Summary
간단한 방법은 관련 상피 세포에서 조직 섬유아 세포의 효과를 분석하는 설명되어 있습니다. 이 방법과 3 차원 조직 배양의 결합 차원에서 고립 후 세포의 분석을 용이하게하실 수 있습니다. 기술은 종양 세포에서 종양 - 관련 기질의 효과를 체계적으로 연구를 허용, 악성 잠재력을 변화의 세포에 적용됩니다.
Abstract
거대한 노력은 쉬운 세포 조작을 허용 고전적인 2 차원 세포 배양 모델을 사용하여 많은이 작품의이 완료되어 정상 및 악성 세포 행동 1-2,,에 관련된 신호 전달 경로와 분자를 식별하고 있진 않지만. 그것은 세포 내 신호 전달 경로는 차원 및 3-4 세포 표면 장력을 포함한 세포외 세력에 의해 영향을받는 것이 분명되었다. 다중 접근 방식은 더 정확하게 생물 학적 조직 구조 3 대표하는 입체적인 모델을 개발하기 위해 촬영되었습니다. 이러한 모델은 다중 차원 건축 스트레스를 통합할 수 있지만, 세포의 논리상 필연의 효과 연구 모형의 한계 및 후속 분석을 위해 세포를 추출의 어려움으로 인해 2 차원 조직 배양에보다 쉽게 이해되는 것입니다.
tumorigenesis 및 종양 행동 종양 주위 microenvironment의 중요한 역할 I의 점점 4 인정되고. 종양 기질은 여러 세포 유형 및 세포 분자로 구성되어 있습니다. 종양이 개발 중에 종양 세포 stromal 세포 5 사이의 양방향 신호가 없습니다. 종양 - 기질 공동 진화에 참여하는 몇 가지 요소가 확인되어 있지만, 체계적으로 파악하고 이러한 신호 6 전체 배열을 공부하는 간단한 기술을 개발할 필요가 여전히있다. 섬유아 세포는 정상이나 종양 - 관련 stromal 조직에서 가장 풍부한 셀 타입이며, 증착 및 지하 막과 paracrine 성장 요인 7의 유지에 기여한다.
많은 그룹은 종양 치료에 대한 반응, 면역 세포의 채용, 신호 전달 분자, 증식, apoptosis, angiogenesis, 그리고 침공 8-15 등 다양한 세포 기능에 섬유아 세포의 역할을 공부하고 입체 문화 시스템을 사용해 왔습니다. 우리는 엉덩이에 대한 간단한 방법을 최적화했습니다혼합 세포 인구 (공동 문화) 16-22의 입체 문화를 만드는 상용 세포외 매트릭스 모델을 사용 mammary 상피 세포에 mammary 섬유아 세포의 효과를 essing. 지속적인 공동 문화와 세포 내부에있는 섬유아 세포 클러스터링과 크게 spheroids의 외관에와 매트릭스로 멀티 셀룰러 전망을 형성 상피 세포와 spheroids를 형성하고 있습니다. 변경된 상피 세포 invasiveness로 연결 섬유아 세포의 조작이 쉽게 숫자와 상피 전망 23 길이의 변화에 의해 계량하실 수 있습니다. 더욱이, 우리는 상피 행위에 대한 fibroblast 노출의 효과 분석을 용이하게 입체 공동 문화 상피 세포를 분리하는 방법을 고안했습니다. 우리는 공동 문화의 영향이 여러 assays를 수행하기 위해 충분한 시간을 허용, 상피 세포 격리 후 몇 주 동안 지속 것으로 나타났습니다. 이 방법의 세포에 대한 적응악성 잠재력을 변화하고하는 것은 전문적인 장비를 필요하지 않습니다. 이 기술은 여러 조건 하에서 체외 세포 모델의 급속한 평가를 허용하고, 해당 결과는 생체내 동물 조직 모델뿐만 아니라 인간의 조직 샘플에서 비교할 수 있습니다.
Protocol
1. 입체 공동 문화 구축
- 공동 문화를 확립하기 전에 하루, 하룻밤은 4 ° C 냉장고에서 얼음 냉동실과 해동에서 Matrigel를 제거합니다.
- 10% 소 송아지 혈청, 5 μg / ML 인슐린과 DME/F12 매체 : 실험 당일 사용되는 상피 세포에 대한 매체 (이 예에서는 HMEC 중간에 해당하는 공동 문화를 위해 매체를 준비 , 1 μg / ML의 하이드로코티손, 1 NG / ML EGF). 이전 Matrigel과 믹싱까지 얼음으로 최소한 1 시간마다 매체를 보관하십시오.
- 해동 Matrigel을 희석하기 위해 Matrigel의 총 원하는 수량 결정 : 매체 (300 μL마다 잘 24 - 잘 접시) 및 얼음에 멸균 튜브에 얼음처럼 차가운 HMEC 매체의 절반 볼륨을 추가합니다. 그렇다면 1:1 희석을 달성하기 위해 튜브에 해동 Matrigel의 같은 반 전체 볼륨을 추가합니다. 얼음 튜브를 유지.
- 장소 50 Matrigel의 μL : 24 - 잘 접시의 지정된 우물의 중간 중간 잘 혼합하고humidified 공기 5 % CO 2와 37 ° C 배양기에서 10 분 동안 품어.
- 우물에 매체를 혼합하여 다른 60 분 품어 : Matrigel의 추가 450 μL를 추가합니다.
- 인큐베이션 기간 동안, 0.5 × 10의 농도에서 섬유아 세포 (여기서 GFP를 표현 H-TERT-불후의 감소 Mammary 섬유아 세포)과 상피 세포 (여기서 RFP을 표현 H-TERT-불후의 인간 Mammary 상피 세포주)의 1:1 정지를 준비 5 세포 HMEC 매체의 0.5 ML 각.
- 60 분 인큐베이션 단계 후에 부드럽게 경화 젤 상단에 세포 현탁액을 떨어뜨, 그리고 보육에 문화를 반환합니다.
- 2 일간 문화를 방해하지 마십시오. 이렇게하면 중간 아주 부드럽게 잘 부드럽게 신선한 HMEC 매체와 교체의 측면에서 매체를 aspirating하여 2~3일마다 변경할 수 있습니다.
- 현미경 하에서 일상 회전 타원체 형성을 모니터링합니다. 문화는 10-14일 후 일반적으로 성숙입니다. 이미지로빛 또는 형광 현미경을 사용하여 적절한. 회전 타원체의 크기와 투영 길이 광 현미경 하에서 측정할 수 있습니다.
2. 공동 문화권 회전 타원체로부터 세포의 분리
- 멸균 2-ML 유리 피펫을 사용하여 매우 부드럽게, 문화를 피펫 아래 10X. 또는 문화를 피펫하기 위하여 70 % 에탄올에 autoclaving 또는 침지 소독 가위를 사용하여 1000 microliter 플라스틱 피펫 팁의 끝부분을 잘라. 유리 피펫 또는 멸균 15 ML의 원심 관에 컷 플라스틱 피펫 팁 및 실온에서 2,000 rpm으로 5 분 원심 중과 문화를 전송합니다. 세포 spheroids은 침전 하단 것입니다.
- 부드럽게 centrifuged 튜브의 상단에서 중단 Matrigel을 제거 멸균 파스퇴르 피펫 팁을 사용합니다.
- pelleted spheroids 1 ML HMEC 매체를 추가, 최대 피펫 아래로 3 배를 멸균이 ML 유리 피펫으로, 그리고 24 우물에 잘으로 문화를 전송조직 배양 플레이트.
- spheroids이 매체를 변경하기 전에 최소 48 시간 동안 접시에 연결하도록 허용합니다. 시간이지나면서 세포가 회전 타원체의 구조를 떠날 것이며 monolayers로 성장.
- 세포가 50 % 합류점에 도달 통과 세포 문화. 첫 100 밀리미터 접시 (약 3~5일)에 나서 35 밀리미터 접시 (약 2-4일)에 문화를 확장합니다. 각 통로 단계로 바로 전에 수동으로 가능한 많은 잔류 '유령 spheroids "로 제거하는 멸균 파스퇴르 피펫을 사용합니다.
- 형광 셀 정렬 필요한 경우가 적절한 세포 표면 마커 더 나아가 별도의 서로 다른 세포 인구를 사용하는 인구의 순도를위한 유동세포계측법으로 세포를 분석합니다. 원하는대로 분리된 세포는 추가 분석을 위해 지금 준비가되어 있습니다.
3. 대표 결과
공동 문화 입체 회전 타원체에서는 공학 Tiam1 입을와 섬유아 세포는 mA로 증가 침공을 유발mammary 상피 세포에 의해 trix (그림 1, D를 비교, E에 F, B, C). 와 섬유아 세포는 Tiam1 이상의 표현이 유방암 세포주 SUM159 (그림 1, G, H, I로 J, K, L을 비교)에 의해 감소 매트릭스 침공을 유도 설계.
그림 2와 같이 일단 공동 교양 spheroids가 설립되어, 세포 인구는 2 차원 맥락에서 다시 도금에 의한 spheroids으로부터 격리 수 있습니다. 테스트 세포의 상대적인 성장 속도에 따라 순수 인구는 시리얼 통로를 통해 등장할 수있다 (그림 3 참조) 또는 적절한 세포 마커를 사용하여 정렬할 수 있습니다. 공동의 문화 차원에서 격리 후, 상피 세포 분석을위한 충분한 기회를있게 장시간 동안 섬유아 세포와 공동으로 문화 수여 속성을 유지합니다. 이 예제에서는 Tiam1 - 결함 섬유아 세포에 노출이 주 동안 지속된 공동 교양 HMECs 증가 마이 그 레이션을 유도3 차원의 공동 문화의 fter 절연 (그림 4).
그림 1. 빛과 형광 현미경 하에서 공동 문화 확립 회전 타원체의 이미징. 회전 타원체 문화가 mammary 상피와 fibroblast 세포 라인과 함께 설립하여 10-14일 위해 문화에 성장할 수있게됩니다. AF : 상피 = HMEC-mCherry 전지. GL : 상피 세포 = SUM159-mCherry 전지. AC, GI : fibroblast = 컨트롤 RMF-GFP 세포. DF : fibroblast = RMF-GFP Tiam1 입을 가진. JL : fibroblast = RMF-GFP Tiam1 넘는 표현으로. 화살표는 매트릭스에 침입하는 상피 전망을 나타냅니다.
그림 2. Matrigel 문화로부터 격리 후 빛과 형광 현미경 하에서 문화 시리얼 이미징. 데이 0 즉시 격리 후 이미징 나타내고 일 1, 2 및5 고립 후 일을 나타냅니다. 시간이 지남에 따라 회전 타원체 증가를 떠나는 세포의 코로나. 결국 거의 세포와 "귀신"회전 타원체는 (화살표) 남아 있습니다. 거의 spheroids 귀신 제거하고 처음 통과 후 남아 있습니다.
Matrigel 공동의 문화로부터 고립 후 세포의 그림 3. 유동세포계측법 분석. 공동 문화권 회전 타원체가 성숙되면 세포는 pipetting과 공동 문화 3D 및 passaging 시리얼으로부터 격리됩니다. 샘플 aliquots가 유동세포계측법에 의해 분석된다 (식별하는 녹색 형광과 붉은 형광을 사용하여이 예제에서 GFP를 - 표현하는 각각 섬유아 세포와 mCherry-표현 상피 세포) 상피와 fibroblast 세포의 상대 인구를 결정합니다.
그림 4. HMECs의 Transwell 마이 그 레이션 isolati 후에도Matrigel 공동 문화부터. 순수 인구가 문화 또는 형광 셀 정렬을 통해 얻은되고 나면 원하는대로, 세포 분석 할 수 있습니다. 여기 HMECs 중 제어 (C) 또는 천공 transwells 걸쳐 Tiam1 결함 (shT) 섬유아 세포와 공동 교양의 마이 그 레이션은 공동의 문화로부터 고립 후 2, 4 및 8 주가되면 평가되었다.
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Discussion
여기에 제시된 방법은 종양 세포를 포함한 상피 세포에 stromal 섬유아 세포의 효과를 분석에 대한 간단한 접근 방식을 나타냅니다. 추가 분석을 위해 모체의 세포는 쉽게 추출을 가능하게하면서 그것은 세포외 지하 멤브레인 매트릭스에서 지원하는 입체적인 맥락 내에서 직접적인 세포 - 세포 상호 작용을 허용합니다. 이것은 fibroblast 라인은 선택과 상피 라인은 그림 1에서와 같이 침략 가능성에 따라 다를 수의 신호 전달 경로에 영향을 조절할 수로 종양 - 관련 기질 연구에 적용할 수 있습니다. 3 차원 공동 배양 모델은 세포 invasiveness의 변화가 유도되었다는 시각적인 검증을 허용합니다. 격리 프로토콜 처리의 최소 3D 문화의 세포의 추출을 허용하고 셀 속성에 영향을 미칠 수 트립신 또는 매트릭스 - 용해 대리인의 사용을 방지합니다. 공동 문화 3D의 fibroblast에 대한 노출의 효과 후미 상피 세포에서 지속이후 분석 결과 (그림 4)을 촉진 3D 공동 문화에서 어 절연. 여기에 표시된 예제 세포 마이 그 레이션에 영향을 그린 반면, 2 차원에서 성장 세포에 적용할 수있는 분석은 고립된 세포에서 사용할 수 있습니다. 우리는 관련 mammary 상피 세포의 행동에 fibroblast Tiam1 표현을 변화의 효과를 분석하기 위해이 방법을 사용 하였다. 섬유아 세포의 Tiam1 결핍증은 3D 문화와 동물 종양 모델 23 mammary 종양 세포 침공과 전이를 촉진합니다. 이 방법은 우리가, 분자 생화학 및 기능적 assays (리우와 Buchsbaum, 언론)을 사용하여 잠재적인 참여 경로를 분석할 수있었습니다.
그것은 우수한 건강에서만 세포 라인을 사용하고 과정에서 문화 오염을 방지하기 위해 엄격한 무균 기술을 준수하는 것이 중요합니다. 최상의 결과는 초기의 세포보다는 늦게 구절을 사용하여 얻을 수있다 (정확한 구절 번호 specif에 따라 달라집니다IC 세포 라인)과로부터 세포 50-80%의 합류점 사이의 밀도에 수확. 프로토콜에 따라 Matrigel의 정확한 처리가 공동 문화를 확립하기 전에 모두 완료 liquification를 촉진하고 세포뿐만 아니라 이전에 모체의 철저한 응고를 보장하기 위해 열쇠입니다. 모체의 불충 분한 금액 또는 응고 오히려 문화의 spheroids보다 단일층로 성장 세포가 높아집니다. 첫 조연 문화 회전 타원체를 설정하면 잘에서 처음 50 μl 플러그의 배치가 고르게 분산 회전 타원체 형성에 중요한 역할 최종 행렬의 고정 견고하고,보다 균일한 응고를 허용합니다. 자동 셀 정렬은 혼합 인구를 구분하는 데 사용되는 경우 이후의 절연 통과 단계의 모든 귀신 spheroids의 제거가 중요합니다. 여기에 표시된 예제는 약 10 밀리그램 / ML의 단백질 성분과 페놀 - 빨간 무료 Matrigel을 사용합니다. 페놀 - 빨간 무료로 준비 assa의 색상 검출을 허용같은 형광과 같은 YS.
이 기술은 관련 상피 세포 종양 또는 반대로 관련 섬유아 세포에 종양 세포의 영향에 대한 stromal 섬유아 세포의 효과를 연구하기 위해 세포 유형의 범위에 적용할 수 있습니다. 이 기술은 여러 조건 하에서 체외 세포 모델의 급속한 평가를 허용하고, 해당 결과는 다음 생체내 동물 조직 모델뿐만 아니라 인간의 조직 샘플에서 비교할 수 있습니다.
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Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Matrigel | BD Biosciences | 356237 | Phenol-red free |
| Hyclone Classical Liquid Medium: DMEM F12 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30023.01 | |
| Hyclone Bovine Calf Serum | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH3007303 | |
| Insulin | EMD Millipore | 407709 | Dissolve in 0.005N HCl; 0.22 μM filter |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H4001 | Dissolve in 50% EtOH; 0.22 μM filter |
| EGF | Sigma-Aldrich | E9644 | Dissolve in 10mM acetic acid; 0.22 μM filter |
References
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