Summary
Een eenvoudige methode beschreven voor het analyseren effecten weefsel fibroblasten op geassocieerde epitheelcellen. De combinatie van deze methode en driedimensionale weefselkweek kan worden vergemakkelijkt analyse van cellen na isolatie van 3D. De techniek is voor cellen van verschillende maligne potentieel, waardoor systematisch onderzoek effecten van tumor-geassocieerde stroma op tumorcellen.
Abstract
Terwijl de enorme inspanningen zijn gegaan in het identificeren van signaalwegen en moleculen die betrokken zijn in normale en kwaadaardige cel gedrag 1-2, een groot deel van dit werk is gedaan met behulp van klassieke tweedimensionale celcultuur modellen, die zorgen voor een gemakkelijke cel manipulatie. Het is duidelijk geworden dat de intracellulaire signaalwegen worden beïnvloed door extracellulaire krachten, met inbegrip van dimensionaliteit en cel oppervlaktespanning 3-4. Meerdere benaderingen zijn genomen om de drie-dimensionale modellen te ontwikkelen die beter biologisch weefsel architectuur 3 te vertegenwoordigen. Hoewel deze modellen zijn voorzien van multi-dimensionaliteit en architectonische stress, studie van de gevolgen daarvan voor de cellen is minder makkelijk dan in de twee-dimensionale weefselkweek te wijten aan de beperkingen van de modellen en de moeilijkheid om het extraheren van cellen voor latere analyse.
De belangrijke rol van de micro-omgeving rondom tumoren in het ontstaan van tumoren en het gedrag van de tumor is steeds opgenomen 4. Tumor stroma bestaat uit meerdere celtypes en extracellulaire moleculen. Tijdens de ontwikkeling van tumoren zijn er in twee richtingen signalen tussen tumorcellen en stromale cellen 5. Hoewel sommige factoren die deelnemen aan tumor-stroma co-evolutie zijn geïdentificeerd, is er nog steeds behoefte aan eenvoudige technieken om systematisch te identificeren en de studie van de volledige reeks van deze signalen 6 te ontwikkelen. Fibroblasten zijn de meest voorkomende celtype in de normale of tumor-geassocieerde stromale weefsels, en bijdragen aan de afzetting en het onderhoud van basaal membraan en paracriene groeifactoren 7.
Veel groepen hebben gebruikt drie-dimensionale cultuur systemen om de rol van de fibroblasten op verschillende cellulaire functies, waaronder tumor respons op therapieën, rekrutering van immuuncellen, signaalstoffen, proliferatie, apoptose, angiogenese, en de invasie 8-15 te bestuderen. We hebben geoptimaliseerd een eenvoudige methode voor ezelkingscapaciteit de effecten van mammaire fibroblasten op mammaire epitheelcellen behulp van een commercieel verkrijgbaar extracellulaire matrix model driedimensionale kweken gemengd celpopulaties (co-culturen) 16-22 maken. Bij voortgezette co-kweek de cellen vormen sferoïden met fibroblasten clustering in het interieur en epitheelcellen grotendeels op de buitenzijde van de sferoïden en die meercellige uitsteeksels in de matrix. Manipulatie van de fibroblasten die leidt tot veranderde epitheelcellen invasiviteit gemakkelijk kan worden gekwantificeerd door veranderingen in het aantal en de lengte van epitheliale projecties 23. Verder hebben we een methode ontwikkeld voor het isoleren epitheliale cellen van de drie-dimensionale co-kweek de analyse van de effecten van fibroblast blootstelling op epitheliale gedrag maakt. We hebben gevonden dat de effecten van co-cultuur voor de weken aanhouden na het epitheelcellen isolatie, waardoor ruim de tijd om meerdere tests uit te voeren. Deze methode is aanpasbaar aan cellen vanverschillende maligne potentieel en vereist geen speciale apparatuur. Deze techniek maakt een snelle in vitro evaluatie van celmodellen onder verschillende omstandigheden en de bijbehorende resultaten te vergelijken met in vivo modellen dierlijke weefsels en menselijke weefselmonsters.
Protocol
1. Vaststelling van drie-dimensionale Co-culturen
- De dag voor tot oprichting van de co-culturen, de Matrigel 's nachts uit de vriezer en dooi op het ijs in een 4 ° C koelkast.
- Op de dag van het experiment bereiden medium voor co-cultuur, die overeenkomt met het medium voor de epitheliale cellen die (HMEC medium in dit voorbeeld: DME/F12 medium met 10% bovine kalfsserum 5 pg / ml insuline , 1 pg / ml hydrocortisone en 1 ng / mL EGF). Bewaar het medium op het ijs ten minste 1 uur vóór het mengen met Matrigel.
- Om de ontdooide Matrigel verdunnen, bepalen de totale gewenste hoeveelheid Matrigel: medium (300 ul per putje voor 24-putjes) en voeg de helft van dat volume van ijskoude HMEC medium in een steriele buis op ijs. Voeg dezelfde halve totale ontdooid Matrigel de buis een 1:1 verdunning mogelijk. Houd de tube op het ijs.
- Breng 50 ul van Matrigel: medium mengsel midden goed in aangewezen wells van een 24-well plaat enIncubeer 10 min in een 37 ° C incubator met bevochtigde lucht en 5% CO2.
- Een extra 450 pi Matrigel: medium mengsel aan de putjes en geïncubeerd nog 60 minuten.
- Tijdens de incubatie bereiden een 1:1 suspensie van fibroblasten (hier h-tert-geïmmortaliseerde reductie uier fibroblasten die GFP) en epitheelcellen (hier h-tert-geïmmortaliseerde Human uier Epitheliale cellijn RFP) bij een concentratie van 0,5 x 10 5 cellen elk in 0,5 ml HMEC medium.
- Na de 60-minuten durende incubatie stap, voorzichtig laten vallen de celsuspensie op de bovenkant van de gestolde gel, en terug te keren cultuur naar de incubator.
- Niet storen de culturen voor 2 dagen. Hierna kan medium worden ververst 2-3 dagen door zachtjes opzuigen medium vanaf de zijde van de put en zachtjes te vervangen met vers HMEC medium.
- Monitor sferoïde vorming dagelijks onder microscopie. Culturen zijn over het algemeen volwassen na 10-14 dagen. Beeld alsnodig met behulp van licht of fluorescentie microscopie. Sferoïde grootte en de projectie lengte kan worden gemeten onder lichtmicroscopie.
2. Isolatie van Cellen van Spheroid Co-culturen
- Heel voorzichtig en pipetteer de cultuur op en neer 10x met behulp van een steriele 2-ml glazen pipet. U kunt ook afgesneden van de top van een 1000 microliter plastic pipet met een schaar in de autoclaaf of onderdompeling in 70% ethanol om de cultuur pipet. Breng de cultuur met een pipet het glas of de kunststof gesneden pipetpunt een steriele 15 ml centrifugebuis centrifugeer 5 min bij 2000 rpm bij kamertemperatuur. De cellulaire sferoïden zal neerslaan op de bodem.
- Gebruik een steriele Pasteur pipet tip om de verstoorde Matrigel voorzichtig uit de top van de gecentrifugeerde buis.
- Voeg 1 ml HMEC medium om de gepelleteerde sferoïden en pipetteer op en neer 2-3 keer met een steriel 2 ml glazen pipet en breng de cultuur van een goed in een 24-wellweefselkweek plaat.
- Laat de sferoïden naar de schotel voor hechten ten minste 48 uur veranderen medium. Na verloop van tijd de cellen verlaat de bolvormige structuren en te groeien als monolagen.
- Passage van de celculturen wanneer de cellen 50% confluentie bereiken. Eerste uitbreiding van de cultuur van een 35 mm schaal (ongeveer 2-4 dagen), en vervolgens naar een 100 mm schaal (ongeveer 3-5 dagen). Direct voorafgaand aan elke passage stap, een steriele Pasteur pipet om handmatig te verwijderen zo veel residuele "ghost sferoïden" mogelijk te maken.
- Analyseer cellen door flowcytometrie voor de bevolking zuiverheid met behulp van passende celoppervlaktemerkers en verder aparte verschillende celpopulaties door fluorescentie celsortering indien nodig. De geïsoleerde cellen zijn nu klaar voor verdere analyse naar wens.
3. Representatieve resultaten
In drie-dimensionale sferoïde co-culturen, fibroblasten met gemanipuleerde Tiam1 silencing te induceren verhoogd invasie in matrix van mammaire epitheelcellen (figuur 1 vergelijken D, E, F A, B, C). Fibroblasten met gemanipuleerde over-expressie van Tiam1 te induceren afgenomen matrix invasie van de borstkanker cellijn SUM159 (Figuur 1, vergelijk J, K, L tot G, H, I).
Als co-gekweekte sferoïden zijn opgesteld, kan celpopulaties worden geïsoleerd uit sferoïden door opnieuw uitplaten in een tweedimensionale context, zoals weergegeven in figuur 2. Afhankelijk van de relatieve groei van de onderzochte cellen kunnen ontstaan door zuivere populatie seriële passage (zie figuur 3) of kan worden gesorteerd met geschikte celmarkers. Na isolatie van 3D co-cultuur, epitheelcellen behouden de eigenschappen door co-cultuur met fibroblasten gedurende langere tijd, waardoor ruimschoots de gelegenheid voor analyse. In dit voorbeeld blootstelling aan Tiam1-deficiënte fibroblasten geïnduceerd toenemende migratie samen gekweekt HMECs dat hield weken eenfter isolatie van 3D co-cultuur (figuur 4).
Figuur 1. Imaging van gevestigde sferoïde co-culturen onder licht en fluorescentie microscopie. Sferoïde culturen gelegd met mammaire epitheel en fibroblast cellijnen en mag in cultuur groeien 10-14 dagen. AF: epitheel = HMEC-mCherry cellen. GL: epitheelcellen = SUM159-mCherry cellen. AC, GI: fibroblast = controle RMF-GFP-cellen. DF: fibroblast = RMF-GFP met Tiam1 silencing. JL: fibroblast = RMF-GFP met Tiam1 over-expressie. Pijlen geven epitheliale projecties binnen te vallen in de matrix.
Figuur 2. Serial beeldvorming van culturen onder licht en fluorescentie microscopie na isolatie van Matrigel cultuur. Dag 0 is imaging onmiddellijk na isolatie, dag 1, 2 en5 geven dagen na isolatie. De corona van de cellen het verlaten van de sferoïde toeneemt in de tijd. Uiteindelijk een "ghost" sferoïde met zeer weinig cellen blijft (pijl). Zeer weinig sferoïden blijven na ghost verwijderen en de eerste passage.
Figuur 3. Flow cytometrie analyse van cellen na isolatie van Matrigel co-kweek. Na sferoïde co-culturen zijn geworden, worden de cellen geïsoleerd van de 3D-co-cultuur met pipetteren en seriële passage. Voorbeeld aliquots geanalyseerd door flow cytometrie (in dit voorbeeld met groene fluorescentie en rode fluorescentie te identificeren die GFP tot expressie fibroblasten en mCherry expressie epitheelcellen respectievelijk) relatieve populaties van epitheliale en fibroblastcellen bepalen.
Figuur 4. Transwell migratie van HMECs blijft na isolativerlengde van Matrigel co-cultuur. Zodra zuivere populatie verkregen door cultuur of fluorescentie celsortering kunnen cellen geanalyseerd zoals gewenst. Hier migratie van HMECs samen gekweekt met een controle (C) of Tiam1 deficiënt (vel) fibroblasten in geperforeerde transwells werd op 2, 4 en 8 weken na de isolatie van co-cultuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier beschreven methode is een eenvoudige benadering de analyse van de effecten van stroma fibroblasten op epitheliale cellen, waaronder tumor cellen. Het maakt direct cel-cel interacties in een driedimensionale context door extracellulaire matrix basismembraan, terwijl een eenvoudigere extractie van cellen uit de matrix voor verdere analyse. Dit kan worden toegepast op de studie van tumor-geassocieerde stroma, zoals fibroblasten lijnen kan worden gemanipuleerd om signaalwegen keuze en epitheliale lijnen variëren invasiepotentieel, zoals weergegeven in figuur 1 op. De 3D co-cultuur model zorgt voor visuele verificatie dat veranderingen in de cel invasiviteit zijn geïnduceerd. De isolatie protocol voorziet in extractie van cellen uit de 3D culturen met een minimum van hantering en vermijdt het gebruik van trypsine of matrix oplossende middelen die kunnen beïnvloeden cel eigenschappen. De effecten van blootstelling aan fibroblast in 3D co-cultuur volharden in epitheliale cellen achterER isolatie van 3D co-cultuur, het vergemakkelijken van de daaropvolgende analyse (figuur 4). Hoewel het hier getoonde voorbeeld toont effecten celmigratie kan elke test voor cellen groeien in 2D worden de geïsoleerde cellen. Wij hebben deze methode om de effecten van verschillende fibroblast Tiam1 expressie op het gedrag van de bijbehorende mammaire epitheelcellen analyseren. Tiam1 tekort in fibroblasten stimuleert mamma tumorcel invasie en metastase in 3D cultuur en dierlijke tumormodellen 23. Deze methode heeft ons in staat om potentiële betrokken wegen met behulp van moleculaire, biochemische en functionele testen (Liu en Buchsbaum, in druk) te analyseren.
Het is belangrijk om alleen cellijnen uitstekende gezondheid gebruiken en voldoen aan de strenge steriele techniek om verontreiniging van culturen voorkomen tijdens het proces. De beste resultaten worden verkregen met cellen van begin dan laat passages (nauwkeurige passage nummer afhankelijk van de speciic cellijn) en uit cellen geoogst bij dichtheden tussen de 50-80% confluentie. Precieze behandeling van Matrigel volgens protocol is de sleutel om zowel volledig liquification voor te vergemakkelijken tot oprichting van de co-culturen en een grondige stollen van de matrix zorgen voor toevoeging van de cellen. Onvoldoende hoeveelheid of het stollen van de matrix zal resulteren in cellen groeien als een monolaag niet in sferoïden in de culturen. Bij de eerste de sferoïde co-culturen tot oprichting van, de plaatsing van een eerste 50 pl plug in de put zorgt voor een stevige verankering en meer uniforme verharding van de uiteindelijke matrix, die is de sleutel tot gelijkmatig verdeeld sferoïde formatie. Verwijdering van alle ghost sferoïden op post-isolatie passage stappen is van essentieel belang automatisch celsortering wordt gebruikt om gemengde populatie scheiden. De hier getoonde voorbeelden gebruikt fenol-rood vrije Matrigel met proteïne samenstelling van ongeveer 10 mg / ml. De fenol-rood vrij voorbereiding zorgt voor kleur detectie in ASSAys, zoals fluorescentie.
Deze techniek kan worden toegepast op verschillende celtypen om de effecten van stroma fibroblasten op geassocieerde tumoren epitheelcellen of omgekeerd, de gevolgen van tumorcellen op geassocieerde fibroblasten bestuderen. Deze techniek zorgt voor een snelle evaluatie van in vitro cel modellen onder meerdere voorwaarden, en de bijbehorende resultaten kunnen dan worden vergeleken met in vivo dierlijke weefsels modellen maar ook menselijk weefsel monsters.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Matrigel | BD Biosciences | 356237 | Phenol-red free |
| Hyclone Classical Liquid Medium: DMEM F12 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30023.01 | |
| Hyclone Bovine Calf Serum | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH3007303 | |
| Insulin | EMD Millipore | 407709 | Dissolve in 0.005N HCl; 0.22 μM filter |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H4001 | Dissolve in 50% EtOH; 0.22 μM filter |
| EGF | Sigma-Aldrich | E9644 | Dissolve in 10mM acetic acid; 0.22 μM filter |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100, 57-70 (2000).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Kim, J. B. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Semin. Cancer Biol. 15, 365-377 (2005).
- Li, H., Fan, X., Houghton, J. Tumor microenvironment: the role of the tumor stroma in cancer. J. Cell Biochem. 101, 805-815 (2007).
- Tse, J. C., Kalluri, R. Mechanisms of metastasis: epithelial-to-mesenchymal transition and contribution of tumor microenvironment. J. Cell Biochem. 101, 816-829 (2007).
- Bhowmick, N. A. TGF-beta signaling in fibroblasts modulates the oncogenic potential of adjacent epithelia. Science. 303, 848-851 (2004).
- Bhowmick, N. A., Moses, H. L. Tumor-stroma interactions. Curr. Opin. Genet. Dev. 15, 97-101 (2005).
- Havlickova, B., Biro, T., Mescalchin, A., Arenberger, P., Paus, R. Towards optimization of an organotypic assay system that imitates human hair follicle-like epithelial-mesenchymal interactions. Br. J. Dermatol. 151, 753-765 (2004).
- Kilani, R. T. Selective cytotoxicity of gemcitabine in bladder cancer cell lines. Anticancer Drugs. 13, 557-566 (2002).
- Seidl, P., Huettinger, R., Knuechel, R., Kunz-Schughart, L. A. Three-dimensional fibroblast-tumor cell interaction causes downregulation of RACK1 mRNA expression in breast cancer cells in vitro. Int. J. Cancer. 102, 129-136 (2002).
- Silzle, T. Tumor-associated fibroblasts recruit blood monocytes into tumor tissue. Eur. J. Immunol. 33, 1311-1320 (2003).
- Bartling, B., Demling, N., Silber, R. E., Simm, A. Proliferative stimulus of lung fibroblasts on lung cancer cells is impaired by the receptor for advanced glycation end-products. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 34, 83-91 (2006).
- Kunz-Schughart, L. A. Potential of fibroblasts to regulate the formation of three-dimensional vessel-like structures from endothelial cells in vitro. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 290, C1385-C1398 (2006).
- Liu, T., Lin, B., Qin, J. Carcinoma-associated fibroblasts promoted tumor spheroid invasion on a microfluidic 3D co-culture device. Lab Chip. 10, 1671-1677 (2010).
- Zengel, P. Multimodal therapy for synergic inhibition of tumour cell invasion and tumour-induced angiogenesis. BMC Cancer. 10, 92-92 (2010).
- Kunz-Schughart, L. A., Heyder, P., Schroeder, J., Knuechel, R. A heterologous 3-D coculture model of breast tumor cells and fibroblasts to study tumor-associated fibroblast differentiation. Exp. Cell Res. 266, 74-86 (2001).
- Djordjevic, B., Lange, C. S. Cell-cell interactions in spheroids maintained in suspension. Acta Oncol. 45, 412-420 (2006).
- Hirschhaeuser, F. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. J. Biotechnol. 148, 3-15 (2010).
- Hoevel, T., Macek, R., Swisshelm, K., Kubbies, M. Reexpression of the TJ protein CLDN1 induces apoptosis in breast tumor spheroids. Int. J. Cancer. 108, 374-383 (2004).
- Paduch, R., Kandefer-Szerszen, M. Vitamin D, tamoxifen and beta-estradiol modulate breast cancer cell growth and interleukin-6 and metalloproteinase-2 production in three-dimensional co-cultures of tumor cell spheroids with endothelium. Cell. Biol. Toxicol. 21, 247-256 (2005).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods Mol. Med. 140, 141-151 (2007).
- Foty, R. A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids. J. Vis. Exp. (51), e2720-e2720 (2011).
- Xu, K. The role of fibroblast Tiam1 in tumor cell invasion and metastasis. Oncogene. 29, 6533-6542 (2010).
