Summary
En rask metode for å modifisere genomet
Abstract
Flere metoder er tilgjengelige for å manipulere bakterielle kromosomer 1-3. De fleste av disse protokollene avhengige innsetting av betinget replicative plasmider (f.eks harboring PIR-avhengige eller temperaturfølsom replikoner 1,2). Disse plasmider er integrert i bakterielle kromosomer basert på homologi-mediert rekombinasjon. Slike innsettingen mutanter er ofte brukt direkte i eksperimentelle innstillinger. Alternativt kan valget for plasmid eksisjon etterfulgt av sitt tap utføres, som for Gram-negative bakterier ofte avhengig telleren-valgbar Levan sukrase enzym kodet av genet SACB 4. Excision kan enten gjenopprette pre-innsetting genotype eller resulterer i en utveksling mellom kromosomet og plasmidet-kodede kopi av den modifiserte genet. En ulempe med denne teknikken er at det er tidkrevende. Plasmidet har å bli klonet først, det krever horisontal overføring inn V. cholerae (mest n otably av parring med en E. coli donor stamme) eller kunstig transformasjon av sistnevnte, og den excision av plasmidet er tilfeldig og kan enten gjenopprette det opprinnelige genotype eller skape ønsket modifikasjon hvis ingen positiv utvelgelse utøves. Her presenterer vi en fremgangsmåte for hurtig manipulering av V. cholerae kromosom (er) 5 (figur 1). Dette TransFLP metoden er basert på den nylig oppdagede chitin-mediert induksjon av naturlig kompetanse i denne organismen 6 og annen representant av slekten Vibrio eksempel V. fischeri 7. Naturlig kompetanse tillater opptaket av fritt DNA inkludert PCR-genererte DNA-fragmenter. Gang tatt opp, recombines DNA med kromosomet gitt nærvær av et minimum av 250-500 bp av flankeangrep homologe område 8. Inkludert et utvalg markør i mellom disse flanking regionene gjør det enkelt påvisning av hyppig forekommende transformanter.
t "> Denne metoden kan brukes for ulike genetiske manipulasjoner av V. cholerae og potensielt også andre naturlig kompetente bakterier. Vi gir tre nye eksempler på hva som kan oppnås ved denne metode i tillegg til vår tidligere publisert studie på enkelt gen slettinger og tillegg av affinitet-tag sekvenser 5. Flere optimalisering trinn om den første protokollen av kitin-indusert naturlig transformasjon 6 inngår i denne TransFLP protokollen. Disse inkluderer blant annet utskifting av krabbe shell fragmenter av kommersielt tilgjengelige kitin 8 flak, donasjon av PCR -derived DNA som transformere materiale 9, og tillegg av FLP-rekombinasjon målwebområder (FRT) 5. FRT nettsteder lar seterettet excision av seleksjonsmarkør mediert av Flp recombinase 10.Protocol
Den TransFLP metoden (figur 1) er eksemplifisert ved tre forskjellige metoder: I) sletting av to tilstøtende gener koder virulens determinanter av V. cholerae (f.eks ΔctxAB), ii) fjerning av en sykdomsfremkallende øy (f.eks ΔVPI-1), og III) integrering av en T7 RNA-polymerase-avhengige promotor sekvensen oppstrøms av et gen-av-interesse, som senere lar sine kunstig uttrykk i den respektive stamme bakgrunn (f.eks, T7-tfoX) (Figur 2).
1. Utarbeidelse av Chitin Flakes
- Vekt 50-80 mg av kitin flak i en standard 1,5 ml plastrør. Dette kan fremstilles i bulk. Chitin flak er kommersielt tilgjengelige fra Sigma (kat. nummer C9213).
- Autoklaveres flak holde lokkene på rørene åpne.
- Umiddelbart lukke lokkene etter autoklaven er avkjølt.
- Butikken autoklaverte kitin flakved romtemperatur.
2. Valgfritt: Kunstig Transformation of V. cholerae med Flp rekombinase-koding Plasmid
- Forbered electrocompetent V. cholerae celler ved hjelp av standard metoder 11. Lagre aliquoter av kompetente celler ved -80 ° C.
- Legg 1-2 pl av en vanlig mini-fremstilling av plasmid PBR-FLP 5 til electrocompetent V. cholerae celler og overføre blandingen i en electroporation kyvette (0,2 cm gap bredde).
- Påfør en puls på 1,6 kV.
- Legg 0,9 ml SOC medium forsiktig overføre celle til en standard 14 ml rør. Inkuber ikke-bevegelige for 2,5 til 3 timer ved 30 ° C.
- Plate 100 pl og 300 pl på LB plater inneholdende 100 ug / ml ampicillin og inkuber ved 30 ° C over natten.
- Rens enkelt klone og lagre som glyserol lager for fremtidige TransFLP eksperimenter.
3. Oligonukleotid Design og Polymerase Chain Reaction
- Minst seks oligonukleotider kreves for å forsterke DNA-regionen (e) av interesse, så vel som den-FRT flankert antibiotikum kassett ved PCR (figur 3). Det anbefales å også inkludere et par av oligonukleotider priming utenfor innsatt PCR fragmentet. Dette tillater kontroll for integrering og korrekt excision av FRT-flankert antibiotikaresistens kassett (f.eks avbildet som 'CHK-opp "og" CHK-ned' primere i figurene 3 til 5).
- Designe oligonukleotider # 2, # 3, # 4 og # 5 med forsiktighet. De bør være i stand til tilstrekkelig anneal (f.eks ~ 28 bp) til DNA. Malen DNA er genomisk DNA (gDNA) for grunning # 2 og # 5 og FRT-Kan-FRT-holdige plasmid DNA som pROD17 12 og PBR-FRT-KAN-FRT (denne studien) for grunning # 3 og # 4 ( Figur 3A).
- Designe primere # 2 til nr. 5 slik omfattende base sammenkobling på sitt 5'-enden mellom # 2/3 og # 4 / # 5, henholdsvis (figur 3A
- Utføre tre uavhengige PCR reaksjoner som en omg på PCR. Den første vil forsterke oppstrømsområdet av genet / DNA region-of-interesse ved hjelp av oligonukleotider 1 og 2. PCR skal resultere i et fragment på minst 500 bp i lengde for å tillate homolog rekombinasjon i cellene. Kortere fragmenter (~ 250 bp) kan være tilstrekkelig 8, men er ikke anbefalt.
- Parallelt utføre andre PCR, som forsterker FRT-flankert antibiotikum kassett. For eksemplene gitt her vi i hovedsak brukt APH (kan R). Bruk oligonukleotider # 3 og # 4 for denne reaksjon (Figur 3a).
- Samtidig, forsterke nedstrøms DNA-regionen med PCR (tredje prøve). PCR fragmentet bør også være minst 500 bp i lengde. Utfør PCR med gDNA som mal og oligonukleotider # 5 og # 6 (figur 3A).
- Etter rensing av alle tre PCRfragmenter, utføre 2. runde av PCR. Bruk en lik blanding av alle tre fragmenter oppnådd i første runde som mal. Forsterkningen er katalysert av oligonukleotider # 1 og # 6. Den resulterende PCR-fragmentet (figur 3B) virker som transformerende DNA i den naturlige transformasjon eksperimentet (figur 1).
4. Kitin-indusert Natural Transformation
- Grow V. cholerae celler aerobt i rikt medium ved 30 ° C til de når en optisk tetthet på 600 nm på ca 0,5.
- Høste bakteriene ved sentrifugering. Vask pellet gang i definerte kunstig medium (DASW 6) før oppslemme cellene i 2 bind av DASW. Tilsett 1 ml av kultur til 50-80 mg steril kitin flak (forklart under punkt 1). Dersom bakterier harbour plasmid PBR-FLP (valgfritt punkt 2), legg ampicillin (50 ug / ml) til kulturen. Inkuber ved 30 ° C i 16-24 t uten bevegelse.
- Legg til & ge, 200 ng av den 2.-round PCR-avledet fragment (forklart under punkt 3). Bland forsiktig uten omfattende demontere bakterier fra kitin overflater. Inkuber ved 30 ° C i 24 timer uten bevegelse.
- Vortex kulturen mye for ≥ 30 sek. Spre 100-300 ul på selektive LB medium plater (f.eks kanamycin eller gentamicin-holdige LB plater for eksemplene her). Bruk dobbeltsidig selektive plater hvis bakteriene havnen plasmidet PBR-FLP ved tilsetning ampicillin samtidig til andre antibiotika. Inkuber platene ved 30 ° C i 16-24 timer eller inntil kolonier er synlige.
- Isoler enkle transformanter fra selektive plater. Slike transformanter har erstattet den opprinnelige kromosomal locus av PCR fragmentet på grunn av en dobbel crossover hendelsen. Disse stammer kan brukes direkte for ytterligere eksperimenter i tilfelle fjernelse av antibiotikum kassetten er ikke nødvendig.
5. Fjerning av Selective Cassette (e) ved Flp-Rekombinasjon
- Kunstig transformere transformanter med plasmid PBR-FLP som beskrevet under punkt 2 hvis det ikke gjøres før den naturlige transformasjon analysen.
- Grow bakteriene på LB agarplater inneholdende ampicillin ved 37 ° C i 16-24 timer. Alternativer: Endre temperaturen i mellom for 2-3 timer til 40 ° C som uttrykk for FLP fra plasmid PBR-FLP er de-undertrykt ved høyere temperaturer 5,10, overføre bakterier til ferske plater etter ca. 8 timers inkubering.
- Test for antibiotika-følsomhet (demonstrert her for kanamycin, Fig. 1) ved restreaking klonene i parallell på antibiotika-holdige og antibiotika-fri agarplater. Isolere enkelt sensitive kolonier. Frys ampicillin-resistente klonen som glyserol lager hvis du har tenkt å ytterligere endre belastningen med andre sletting / innsetting ved hjelp TransFLP.
6. Plasmid Herding
- Grow kultur over natten under aerobic tilstand ogved 30 ° C. Bruke rik medium uten tilsetning av noen antibiotika.
- Valgfritt: Grow frisk kultur for 3-6 timers ved å fortynne overnatter kultur 1:100 i frisk antibiotika-fri medium.
- Plate eller strek fortynning (r) av kultur på vanlig LB agarplate (er) og inkuber ved 30 ° C i 8-16 timer (inntil kolonier er synlige).
- Test for ampicillin-følsomhet av klonene ved restreaking klonene i parallell på antibiotika-holdige og antibiotika-fri agarplater (figur 1). Frys ampicillin-sensitive belastning som glyserol lager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representative resultater av de tre eksempler er vist på fig 4-6. Den første tilnærmingen rettet mot å slette de nærliggende gener ctxA og ctxB. Sammen har de koder den store virulens faktor V. cholerae, koleratoksin. Vi designet oligonukleotider for TransFLP metoden som beskrevet ovenfor og i henhold til figur 3. Foreldrenes belastning, ble den mellomliggende belastning harboring FRT-flankert antibiotikaresistens kassett på det opprinnelige DNA locus av ctxAB og endelig belastning slettet for ctxAB og befridd for motstanden kassetten alle testet for genotype deres (figur 4). Metoden for valg var hel-celle PCR. Vi brukte primere som ikke anneal til transformere PCR fragmentet, men bare til kromosomalt DNA (figur 3). Dette tillater oss å bekrefte stedsspesifikk utveksling av PCR fragmentet med det homologe område av kromosomet (Figur 4A). PCR fragmenter ble separert ved standard agarosegelelektroforese for å bestemme deres størrelse (figur 4B). Denne strategien kan brukes til å kontrollere belastningen mellomprodukter og for å bekrefte den endelige stamme konstruere (s).
For det andre eksemplet, fjerning av en hel genomisk øy, valgte vi Vibrio patogenitet island 1 (VPI-1) som mål 13. Standarden TransFLP beskrevet ovenfor var mislykket i dette tilfellet. Det var kjent fra tidligere studier at et så stort DNA region kan byttes med en lignende størrelse DNA regionen ved hjelp chitin-indusert naturlig transformasjon 9. Vi derfor hypotesen om at størrelsen forskjellen mellom regionen-å-være-slettet og heller kort transformere PCR fragment (<3,5 kb) kan være den begrensende faktor. Vi har derfor besluttet å bruke TransFLP metoden i to trinn: vi først integrert APH genet (kan R) innledes med en enkelt FRT området på begynnelsen av VPI-1 (illustrert i figur 5A). Vi deretter utført en andre runde av naturlig transformasjon, som tillater oss å sette inn en ekstra antibiotikaresistens kassetten (gm R, overdragelse gentamicin motstand) etterfulgt av en andre FRT området på slutten av patogenitet øya (figur 5A). Den respektive doble-resistent stamme ble electroporated å sette plasmid PBR-FLP og TransFLP metoden ble fortsatt som beskrevet ovenfor. Den resulterende stamme manglet hele VPI-1 som verifiseres av PCR av renset genomisk DNA (figur 5B).
For det tredje eksemplet vi integrert en T7 RNA-polymerase-avhengige promotor sekvensen oppstrøms av et gen-av-interesse, i vårt tilfelle genet som koder for store regulatoren av naturlig transformasjon tfoX 6. Dette ble gjort ved hjelp av TransFLP metoden med en liten modifikasjon fra standard protokoll: vi inkluderte T7 RNA avhengige promoter konsensus sekvens ifølge Ref. 14 som overheng inn i oligonukleotidene # 4 og # 5. Med denne strategien T7 RNA polymerase-avhengige promotor sekvensen ble holdt på kromosomet selv etter antibiotikaresistens kassetten ble skåret (figur 6). Vi integrert konstruere i V. cholerae stamme ADVCH-T7POL, som havner T7 RNA polymerase genet drevet av lacUV5 promoter (Blokesch, upublisert). For å teste for funksjonaliteten av konstruksjonen, nemlig T7 RNA polymerase-avhengige uttrykk tfoX, utførte vi naturlige transformasjon assays i LB medium. Foreldrenes belastningen er ikke naturlig transformable under disse betingelser på grunn av mangel på tfoX transkripsjon i rik medium og i fravær av sin naturlige inducer kitin (figur 6). Denne fenotype var uavhengig av om T7 RNA polymerase ble kunstig indusert av IPTG eller ikke (Figur 6, søyle 1 og 2, respectively). Var imidlertid TransFLP genererte stamme ADVCH-T7POL-T7-tfoX :: FRT, som inneholder T7 RNA polymerase-avhengige promotor oppstrøms av kompetanse genet tfoX, faktisk naturlig transformable i rik medium (figur 6, felt 3 og 4) . Grunnet lekkasje av lacUV5 promotoren i LB medium 15 det produserte T7 RNA polymerase allerede transkribert tfoX fra T7 RNA polymerase-avhengige promotor uten induksjon. Dette innledet naturlige kompetanse og transformasjon bekrefter funksjonaliteten til integrerte T7 RNA polymerase-avhengige promotor sekvens (figur 6, felt 3). Denne fenotype ble betydelig forbedret av fulle induksjon av T7 RNA polymerase på grunn av tillegg av induktoren av lacUV5 promotoren, IPTG (figur 6, felt 4).
Figur 1.Flytskjema for TransFLP metoden. De seks poeng beskrevet i denne protokollen er utarbeidet:.. 1) Forberedelse av kitin flak, 2) Valgfritt: Kunstig transformasjon av V. cholerae med Flp rekombinase-koding plasmid;. 3) Oligonukleotid design og polymerase kjedereaksjon;. 4) Chitin-indusert naturlig transformasjon, 5) Fjerning av selektiv kassett (r) etter FLP-rekombinasjon;... 6) Plasmid herding Klikk her for å se større figur .
Figur 2. Skjematisk fremstilling av tre bruksmuligheter for TransFLP metoden. I) A 1458 bp DNA-fragment, inneholdende koleratoksin koding gener ctxA og ctxB, ble slettet som angitt av Δ. II) Det ~ 40 kb Vibrio patogenitet øya 1 (VPI-1 13)ble slettet fra vill-type stamme. III) En T7 RNA polymerase-avhengige promotor sekvens (28 bp) ble integrert oppstrøms av tfoX genet. Den røde firkanten viser venstre bak korte nukleotidsekvens av en enkelt FRT reiser 10. Klikk her for å se større figur .
Figur 3. Forklaring for grunning design og ytelse av PCR basert på sletting av ctxAB. Panel A: For en omg på PCR genomisk DNA (gDNA) og plasmider pROD17 12 og PBR-FRT-Kan-FRT henholdsvis tjente som maler. De nødvendige oligonukleotider er # 1 til # 6. Primeren # 2 / # 3 og # 4 / # 5 (eksempel i innfelt) bør også ha betydelig overlapping til hverandre på deres 5'ends. Panel B: Etter 2 ND rundePCR, som er basert på de 1 omg PCR fragmenter som maler, bør en lang fragment oppnås ved hjelp av primer par # 1 + 6. Klikk her for å se større figur .
Figur 4. Forventet resultat eksemplifisert for ctxAB sletting strategi. Den opprinnelige stammen (villtype), den innsettingen mutant Δ ctxAB :: FRT-Kan-FRT, og den endelige belastningen Δ ctxAB :: FRT ble testet for sine genotyper. Panel A: Skjematisk representasjon av differensieringen kraften av tennsatsen paret ctx-CHK-opp og CTX-CHK-ned, særlig med hensyn til fjerning av det antibiotiske kassetten. Panel B: Hele bakterielle celler ble brukt som mal i PCR reaksjoner. For å se etter den endrede DNA locus primere chk-up og chk ned ble utnyttet. De amplifiserte PCR fragmenter ble separert ved agarose-gelelektroforese og visualisert ved SYBR trygg DNA flekk. Felt 1: Vill-type V. cholerae belastning, felt 2: belastning Δ ctxAB :: FRT-Kan-FRT, felt 3: Δ ctxAB :: FRT. Forventet PCR fragment størrelser i henhold til panel A er angitt til høyre. L, 1kb stige (Invitrogen). Klikk her for å se større figur .
Figur 5. Strategi for å bekrefte sletting av genomisk øya. Panel A: Scheme av Vibrio sykdomsfremkallende øya 1 (VPI-1) (fritt tilpasset fra Ref 16, ikke i målestokk.). For villtype stamme regionen av interesse er ikke-forøkbare ved hjelp av standard PCR-teknologi og VPI-1-spesifikke primere CHK-opp og CHK-ned (~ 40 kb). Derfor en ekstraoligonukleotid annealing i regionen å-være-slettet ble brukt (VC0817-back) sammen med VPI-chk-up. Panel B: Representativ resultat ved hjelp av genomisk DNA av de respektive stammer som mal og Primerpar indikert ovenfor hvert bilde. Stammer testet: Vill-type V. cholerae-stamme (kolonne 1), stamme VPI :: FRT-Kan/Gm-FRT (felt 2), og-1 :: ΔVPI FRT (felt 3). Størrelser av PCR fragmenter som spådd i panel A er angitt på høyre side. L, 1kb stige (Invitrogen). Klikk her for å se større figur .
Figur 6. Representant fenotype etter innsetting av en kunstig promotersekvens. T7 RNA polymerase-avhengige promotor sekvensen ble integrert oppstrøms av kompetansen regulatoriske genet tfoX bruker TransFLP method (skisse over grafen). Foreldrenes V. cholerae-stamme (ADVCH-T7POL) inneholder en T7 RNA polymerase genet drevet av lacUV5 promotoren. Graf: Foreldrepengeperioden stamme ADVCH-T7POL (søyle 1 og 2) og belastningen manipulert av TransFLP (ADVCH-T7POL-T7-tfoX :: FRT; baner 3 og 4) ble testet for naturlig transformability i fravær (kolonnene 1 og 3 ) eller nærvær av 1 mM IPTG (søyle 2 og 4). Transforming genomisk DNA ble avledet fra stamme A1552-LacZ-Kan 8. Transformation frekvenser er gitt på Y-aksen. <Dl under deteksjonsgrensen av ~ 5 x 10 -8. ** P <0,01 (som bestemmes av studentens t-test av log-transformerte data). Svarte pilen med tekst 'T7':. T7 RNA polymerase-avhengige promotersekvens Klikk her for å se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den TransFLP metoden beskrevet ovenfor, og andre steder 5 har vært mye brukt i vårt laboratorium. Den slags genetiske manipulasjoner som er gjennomførbare inkluderer blant annet: sletting av enkle gener og gen klynger, sletting av genomisk øyer (f.eks VPI-1), innsetting av sekvenser oppstrøms av et gen av interesse (for eksempel promoter sekvenser) og innsetting av sekvenser på slutten av et bestemt gen (f.eks koding affinitet tags).
En import forutsetning for TransFLP er at de respektive V. cholerae belastning er naturlig transformable. Dette er ofte ikke tilfelle, spesielt i isolater avledet fra kolerapasienter. Slike stammer er hyppigst muterte innenfor quorum sensing krets f.eks innenfor genet som koder for store regulator av quorum sensing, 17 HapR. Gi tilbake en kopi av hapR gjenoppretter naturlig transformability i disse stammene 6 som exemplifisert for HapR-defekte stamme N16961 18.
Mulige modifikasjoner kan bli innarbeidet, slik som anrikning av bakterier etter naturlig transformasjon 8 i tilfelle frekvensen er for lav. Vær oppmerksom på at transformasjonen frekvensen er generelt lavere i tilfelle PBR-FLP plasmid er allerede til stede mens du gjør kitin-indusert naturlig transformasjon analysen. Dette er sannsynligvis forårsaket av delvis lekkasje av temperaturfølsomme uttrykket av FLP-genet fra PBR-FLP, som ville føre til for tidlig excision av antibiotikaresistens kassetten og manglende evne til å velge for disse transformantene. Vi anbefaler derfor for kritiske tilfeller å sette inn PBR-FLP plasmid etter den naturlige transformasjon trinn.
En annen kritisk trinn er 2. runde av PCR, som vil kombinere de tre en st-runde PCR fragmenter. Det kan skje at deler fragmenter er tilstede etter PCR reaDette skjer (for eksempel en delvis montering av bare fragmenter "opp" og "FRT-Kan-FRT 'ifølge figur 1). Dette er ubetydelig, kan som dobbel homolog rekombinasjon med den targetiserte kromosomal region ikke forekomme i denne situasjonen. Som bare transformanter skjuler det antibiotikaresistens kassett er valgt for, blir alle andre transformanter med ikke-ønskede DNA børser ekskludert.
Et annet punkt å huske på er med hensyn til repetisjon av prosedyren for flere runder. Vi har allerede klart å kombinere sletting av ctxAB clusteret med sletting av sykdomsfremkallende øya (VPI-1) og en annen virulens clusteret (Blokesch, upublisert). Videre har vi effektivt integrert T7 RNA polymerase-avhengige promotor innenfor disse stammer (oppstrøms tfoX og andre steder). Imidlertid bør forestilt genotype være konstant testet for alle belastninger mellomprodukter (f.eks, etter koloni PCR som demonstrated i figur 4). Dette vil bidra til å ekskludere uønskede Flp-mediert rekombinasjon av venstre bak FRT arr (vist som røde rektangulære i alle tallene) med hverandre mens PBR-FLP plasmid er fortsatt til stede i bakterier. Dette kan trolig regnes for fjernt plassert gener, som sannsynligheten for at excision av i mellom regionen ville være dødelig grunnet slettingen av essensielle gener er svært høy.
Til slutt vil vi gjerne diskutere sletting av gener innen operons. Vi kan ikke ekskludere at sletting av en oppstrøms-genet, som etterlater en FRT arr bak, kan endre ekspresjonen av nedstrøms genet (er). For å sikre at denne virkning ikke er årsaken til observerbar fenotype, men at dette er faktisk forårsaket av slettingen, en komplementering assay anbefales. En annen kontroll som vi allerede har brukt i laboratoriet er integreringen av de FRT arr nedstrøms av genet-of-interesse uten å måttet slette det siste. Vi observerte ikke slike problemer i vårt laboratorium ennå, men kan ikke utelukke deres eksistens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Jeg ønsker å takke Olga de Souza Silva for teknisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet av den sveitsiske National Science Foundation (SNSF) Grant 31003A_127029.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chitin flakes | Sigma | C9213 | Autoclaving required |
| OPTIONAL: Micropulser (in case antibiotic cassette should be excised by Flp recombinase encoded on pBR-flp) | Biorad | 165-2100 | Or comparable electroporators |
References
- Miller, V. L., Mekalanos, J. J. A novel suicide vector and its use in construction of insertion mutations: osmoregulation of outer membrane proteins and virulence determinants in Vibrio cholerae requires toxR. J. Bacteriol. 170, 2575-2583 (1988).
- Hamilton, C. M., Aldea, M., Washburn, B. K., Babitzke, P., Kushner, S. R. New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli. J. Bacteriol. 171, 4617-4622 (1989).
- Kato, C., Ohmiya, R., Mizuno, T. A rapid method for disrupting genes in the Escherichia coli genome. Biosci. Biotechnol. Biochem. 62, 1826-1829 (1998).
- Donnenberg, M. S., Kaper, J. B. Construction of an eae deletion mutant of enteropathogenic Escherichia coli by using a positive-selection suicide vector. Infect. Immun. 59, 4310-4317 (1991).
- De Souza Silva, O., Blokesch, M. Genetic manipulation of Vibrio cholerae by combining natural transformation with FLP recombination. Plasmid. 64, 186-195 (2010).
- Meibom, K. L., Blokesch, M., Dolganov, N. A., Wu, C. -Y., Schoolnik, G. K. Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae. Science. 310, 1824-1827 (2005).
- Pollack-Berti, A., Wollenberg, M. S., Ruby, E. G. Natural transformation of Vibrio fischeri requires tfoX and tfoY. Environ. Microbiol. 12, 2302-2311 (2010).
- Marvig, R. L., Blokesch, M. Natural transformation of Vibrio cholerae as a tool-optimizing the procedure. BMC Microbiol. 10, 155 (2010).
- Blokesch, M., Schoolnik, G. K. Serogroup Conversion of Vibrio cholerae in Aquatic Reservoirs. PLoS Pathog. 3, e81 (2007).
- Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene. 158, 9-14 (1995).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A laboratory manual. Ford, N., Nolan, C., Ferguson, M. 1, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
- Reyes-Lamothe, R., Possoz, C., Danilova, O., Sherratt, D. J. Independent positioning and action of Escherichia coli replisomes in live cells. Cell. 133, 90-102 (2008).
- Karaolis, D. K. R. A Vibrio cholerae pathogenicity island associated with epidemic and pandemic strains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 3134-3139 (1998).
- Ikeda, R. A., Ligman, C. M., Warshamana, S. T7 promoter contacts essential for promoter activity in vivo. Nucleic Acids Res. 20, 2517-2524 (1992).
- Pan, S. H., Malcolm, B. A. Reduced background expression and improved plasmid stability with pET vectors in BL21 (DE3). Biotechniques. 29, 1234-1238 (2000).
- Faruque, S. M., Zhu, J., Asadulghani,, Kamruzzaman, M., Mekalanos, J. J. Examination of diverse toxin-coregulated pilus-positive Vibrio cholerae strains fails to demonstrate evidence for Vibrio pathogenicity island phage. Infect. Immun. 71, 2993-2999 (2003).
- Joelsson, A., Liu, Z., Zhu, J. Genetic and phenotypic diversity of quorum-sensing systems in clinical and environmental isolates of Vibrio cholerae. Infect. Immun. 74, 1141-1147 (2006).
- Heidelberg, J. F. DNA sequence of both chromosomes of the cholera pathogen Vibrio cholerae. Nature. 406, 477-483 (2000).
