Summary
Um método rápido para modificar o genoma de
Abstract
Vários métodos estão disponíveis para manipular cromossomas bacterianos 1-3. A maior parte destes protocolos contar com a inserção de plasmídeos replicativos condicionalmente (por exemplo, abrigando replicões pir-dependentes ou sensíveis à temperatura 1,2). Estes plasmídeos são integrados nos cromossomas bacterianos com base na homologia mediada por recombinação. Esses mutantes de inserção são muitas vezes usado diretamente em ambientes experimentais. Em alternativa, a selecção para a excisão do plasmídeo seguido por sua perda pode ser realizada, que para bactérias gram-negativas depende frequentemente da enzima sucrase contra-seleccionável de levana, codificada pelo gene sacB 4. A excisão pode restaurar o genótipo de pré-inserção, ou em resultado de uma troca entre o cromossoma e a cópia mediada por plasmídeos do gene modificado. Uma desvantagem desta técnica é que é demorado. O plasmídeo tem que ser clonado primeiro, que exige a transferência horizontal em V. cholerae (mais n otably por acasalamento com um E. coli estirpe dadora) ou transformação artificial deste último, e da excisão do plasmídeo é aleatório e pode restaurar o genótipo inicial ou criar a modificação desejada se nenhuma selecção positiva é exercida. A seguir, apresentamos um processo para a manipulação rápida da V. cholerae cromossoma (s) 5 (Figura 1). Este método TransFLP baseia-se na descoberta recentemente indução mediada por quitina de competência natural nesse organismo representativo 6 e outros do género, tais como Vibrio V. fischeri 7. Competência natural permite a captação de ADN livre, incluindo fragmentos de PCR gerados pelo DNA. Uma vez absorvido, o ADN recombina com o cromossoma, dada a presença de um mínimo de 250-500 pb da região flanqueadora homólogo 8. Incluindo um marcador de selecção de entre estas regiões flanqueadoras permite a fácil detecção de transformantes que ocorrem com frequência.
t "> Este método pode ser usado para diferentes manipulações genéticas de V. cholerae e potencialmente também outras bactérias naturalmente competentes. Fornecemos três exemplos novos do que pode ser conseguida por este método, além do nosso estudo publicado anteriormente em deleções de um único gene e do Além da afinidade tag-seqüências 5. passos de otimização Vários sobre o protocolo inicial de quitina induzida por transformação natural 6 são incorporados neste protocolo TransFLP. Estes incluem, entre outros, a substituição de fragmentos de conchas de caranguejos por disponível comercialmente quitina flocos 8, a doação de PCR locais derivado de ADN como a transformação de material 9, e a adição de sítios de recombinação FLP-alvo FRT () 5. DRF permitir a excisão sítio-dirigida do marcador de selecção mediada pela recombinase Flp 10.Protocol
O método TransFLP (Figura 1) é exemplificado por três abordagens diferentes: I) a eliminação de dois genes adjacentes que codificam determinantes de virulência de V. cholerae (por exemplo, ΔctxAB), II) a remoção de uma ilha de patogenicidade (por exemplo, ΔVPI-1), e III) a integração de uma polimerase de RNA dependente de sequência do promotor de T7 a montante de um gene de interesse, o que permite a sua subsequentemente expressão artificial no fundo estirpe respectivo (por exemplo, T7-TFox) (Figura 2).
1. Preparação de Quitina Flakes
- 50-80 mg de peso de flocos de quitina de um padrão de tubo de plástico de 1,5 ml. Isto pode ser preparado em grandes quantidades. Quitina flocos estão comercialmente disponíveis a partir de Sigma (cat. número C9213).
- Autoclavar os flocos mantendo as tampas dos tubos aberto.
- Imediatamente fechar as pálpebras após a autoclave tenha arrefecido.
- Loja autoclavado quitina flocosà temperatura ambiente.
2. Opcional: Transformação Artificial de V. cholerae com Flp Recombinase-encoding Plasmid
- Prepare electrocompetentes V. cholerae células utilizando métodos padrão 11. Armazenar aliquotas de células competentes a -80 ° C.
- Adicionar 1-2 uL de uma regularidade de mini-preparação de plasmídeo pBR-flp 5 ao electrocompetentes V. células cholerae e transferir a mistura para uma cuvete de electroporação (0,2 largura da abertura cm).
- Aplicar um pulso de 1,6 kV.
- Adicionar 0,9 ml de meio SOC, gentilmente transferir células de um tubo de ml padrão 14. Incubar sem movimento durante 2,5 a 3 horas a 30 ° C.
- Ul placa 100 e 300 ul em placas LB contendo 100 ug / ml de ampicilina e incubado a 30 ° C durante a noite.
- Purificar único clone e armazenar como estoque de glicerol para experimentos TransFLP futuras.
3. Desenho oligonucleótido e Reacção em Cadeia da Polimerase
- Pelo menos seis oligonucleótidos são necessários para amplificar a região de ADN (s) de interesse, bem como o cassete de FRT-flanqueado antibiótico por PCR (Figura 3). Recomenda-se também incluir um par de oligonucleótidos escorva fora do fragmento de PCR inserido. Isto permite a verificação de integração e a excisão correcta da cassete de resistência FRT-flanqueado antibiótico (por exemplo, descrito como "chk-up" e primers "chk-down" nas Figuras 3 a 5).
- Projetar os oligonucleótidos # 2, # 3, # 4 e # 5 com cuidado. Eles devem ser suficientemente capazes de hibridar (por exemplo, ~ 28 pb) com o DNA molde. O molde de ADN é ADN genómico (gDNA), para os iniciadores # 2 e # 5, e FRT-Kan-FRT contendo DNA de plasmídeo como pROD17 12 e pBR-FRT-KAN-FRT (neste estudo) para os iniciadores # 3 e # 4 ( Figura 3A).
- Conceber os iniciadores # 2 a # 5 permitindo extensa de emparelhamento de bases na sua extremidade 5 'entre # 2 / # 3 e # 4 / # 5, respectivamente (Figura 3A
- Realizar três reações independentes de PCR como uma rodada 1 º de PCR. A primeira vai amplificar a região a montante do gene / ADN da região-de-interesse com a ajuda de oligonucleótidos # 1 e # 2. A PCR deve resultar num fragmento de pelo menos 500 pb de comprimento que permitem a recombinação homóloga dentro das células. Fragmentos mais curtos (~ 250 pb) pode ser de 8 suficiente mas não são recomendados.
- Em paralelo realizar a segunda PCR, que amplifica a cassete de FRT-flanqueado antibiótico. Para os exemplos fornecidos aqui nós usamos principalmente aph (kan R). Oligonucleotídeos uso # 3 e # 4 para essa reação (Figura 3A).
- Concomitantemente, a amplificação da região de ADN a jusante através de PCR (amostra III). O fragmento de PCR também deve ser de pelo menos 500 pb de comprimento. Realizar a PCR com gDNA como molde e os oligonucleotídeos # 5 e # 6 (Figura 3A).
- Após a purificação de todos os três PCRfragmentos, realizar a 2 ª rodada de PCR. Use uma mistura igual de todos os três fragmentos obtidos no primeiro turno como modelo. A amplificação é catalisada por oligonucleótidos # 1 e # 6. O fragmento de PCR resultante (Figura 3B), que serve como a transformação de ADN na experiência de transformação natural (Figura 1).
4. Quitina induzida Transformação Natural
- Crescer V. células cholerae aerobicamente em meio rico a 30 ° C até atingirem uma densidade óptica a 600 nm de aproximadamente 0,5.
- Colheita das bactérias por centrifugação. Lavar pelota uma vez em meio artificial definido (DASW 6) antes de ressuspender as células em 2 volumes de DASW. Adicionar 1 ml da cultura para 50-80 mg de estéril quitina flocos (explicado no ponto 1). Se as bactérias porto plasmídeo pBR-flp (opcional ponto 2), adicionar ampicilina (50 ug / ml) à cultura. Incubar a 30 ° C durante 16-24 h sem movimento.
- Adicionar & ge; 200 ng do fragmento 2 ª rodada de PCR-derivada (explicado no ponto 3). Misturar cuidadosamente, sem extensivamente destacando as bactérias da superfície da quitina. Incubar a 30 ° C durante 24 horas sem movimento.
- Vortex a cultura extensivamente para ≥ 30 seg. Espalhe 100-300 ul em placas LB seletivos médio (por exemplo, kanamicina ou gentamicina placas contendo LB para exemplos fornecidos aqui). Utilizar placas selectivas duas vezes se as bactérias abrigam o plasmídeo pBR-flp adicionando ampicilina concomitantemente com outros antibióticos. Incubar as placas a 30 ° C durante 16-24 horas ou até que as colónias são visíveis.
- Isolar transformantes individuais de placas selectivas. Tais transformantes ter substituído o locus cromossómico original, pelo fragmento de PCR devido a um evento de crossover duplo. Estas estirpes podem ser directamente utilizados para experiências posteriores, no caso da remoção da cassete de antibiótico não é necessário.
5. Remoção de Cassete Seletivo (s) por FlpA recombinação
- Artificialmente transformar seus transformantes com plasmídeo pBR flp, conforme descrito no ponto 2 se não for feito antes do ensaio de transformação natural.
- Crescer as bactérias em placas de agar LB contendo ampicilina a 37 ° C durante 16-24 hr. Opções: mudar a temperatura entre 2-3 horas para a 40 ° C, como expressão de flp de plasmídeo pBR-flp é de-reprimida em 5,10 altas temperaturas, bactérias transferência para placas frescas após aprox. 8 horas de incubação.
- Ensaio de sensibilidade aos antibióticos (demonstrado aqui para canamicina; Figura 1) por restreaking os clones em paralelo em placas de agar contendo antibióticos e livre de antibióticos. Isolar o único colônias sensíveis. Congelar ampicilina resistente clone como estoque de glicerol se você pretende modificar ainda mais a tensão com a supressão outro / inserção usando TransFLP.
6. Cura plasmídeo
- Crescer a cultura durante a noite sob condições aeróbias ea 30 ° C. Use meio rico sem a adição de qualquer antibiótico.
- Opcional: Crescer cultura fresco por 3-6 horas, diluindo a 1:100 cultura durante a noite em meio livre de antibióticos fresco.
- Placa raia ou diluição (s) de cultura em placa de ágar LB simples (s) e incubar a 30 ° C durante 8-16 horas (até que as colónias visíveis).
- Teste para ampicilina sensibilidade dos clones por restreaking os clones em paralelo em placas de ágar contendo antibiótico e antibiótico-livre (Figura 1). Congelar ampicilina cepa sensíveis como o estoque de glicerol.
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Representative Results
Os resultados representativos das três exemplos são mostrados nas Figuras 4 a 6. A primeira abordagem, que visa suprimir os genes vizinhos ctxA e CtxB. Juntos, eles codificar o principal fator de virulência de V. cholerae, a toxina da cólera. Concebemos oligonucleótidos para o método TransFLP como descrito acima e de acordo com a Figura 3. A estirpe parental, a estirpe portadora do intermediário FRT-flanqueado cassete de resistência a antibióticos no locus de ADN original de ctxAB e da estirpe final, eliminado por ctxAB e libertado da cassete de resistência foram todos testados quanto à sua genótipo (Figura 4). O método de escolha foi a de células inteiras PCR. Foram utilizados os iniciadores que se ligam não ao fragmento de PCR, mas apenas para a transformação de ADN cromossómico (Figura 3). Isto permitiu-nos verificar a troca específica do local do fragmento de PCR com a região homóloga do cromossoma (Figura 4A). Os fragmentos de PCR foram separados por eletroforese em gel de agarose padrão para determinar o seu tamanho (Figura 4B). Esta estratégia pode ser utilizada para verificar a tensão e intermediários para confirmar a construção de estirpe final (s).
Para o segundo exemplo, a remoção de uma ilha genómico total, escolhemos a patogenicidade Vibrio ilha 1 (VPI-1) como o alvo 13. O procedimento descrito acima TransFLP padrão não foi bem sucedida no caso presente. Sabia-se de estudos anteriores que tal uma região de ADN de grandes dimensões pode ser trocado por uma região de ADN de dimensões semelhantes usando a quitina induzida por transformação natural 9. Nós, portanto, a hipótese de que a diferença de tamanho entre a região-a-ser-excluído eo bastante curto transformando fragmento de PCR (<3,5 kb) pode ser o fator limitante. Decidimos, portanto, usar o método TransFLP em duas etapas: primeiro que integrou o gene aph (kan R) precedido por um único FRT sítio no início da VPI-1 (ilustrado na Figura 5A). Em seguida, realizada uma segunda ronda de transformação natural, o que nos permitiu inserir uma cassete de resistência a antibióticos complementar (gm R, que confere resistência a gentamicina), seguido de um local DRF segunda no fim da ilha de patogenicidade (Figura 5A). A estirpe duplo resistente respectivo foi electroporado para inserir o plasmídeo pBR-flp eo método TransFLP foi continuada como descrito acima. A estirpe resultante faltava todo o VPI-1, tal como verificado por PCR de ADN genómico purificado (Figura 5B).
Para o terceiro exemplo, que integrou a T7 polimerase dependente de RNA sequência promotora a montante de um gene de interesse, no nosso caso o gene que codifica o principal regulador da transformação natural TFox 6. Isso foi feito usando o método TransFLP com uma pequena modificação do protocolo padrão: incluímos a T7 p RNA dependentesequência de consenso de acordo com a romoter Ref. 14, como saliências para os oligonucleótidos # 4 e # 5. Com esta estratégia, a T7 polimerase dependente de RNA sequência promotora foi mantido no cromossoma, mesmo depois de a cassete de resistência a antibióticos foi excisado (Figura 6). Nós integramos a construção em V. cholerae estirpe ADVCH-T7POL, que abriga o gene de ARN-polimerase de T7 dirigida pelo promotor lacUV5 (Blokesch, não publicado). Para testar a funcionalidade do construto, a saber, a T7 RNA polimerase dependente de expressão de TFox, foram realizados ensaios de transformação naturais em meio LB. A estirpe parental não é naturalmente transformáveis sob estas condições, devido à falta de TFox transcrição em meio rico e, na ausência da sua quitina indutor natural (Figura 6). Este fenótipo é independente do facto de a RNA polimerase de T7 foi induzida artificialmente por IPTG ou não (Figura 6, as pistas 1 e 2, respectively). No entanto, a estirpe TransFLP gerado ADVCH-T7POL-T7-TFox :: FRT, que contém o promotor de T7 de RNA polimerase dependente de a montante do gene competência TFox, foi realmente naturalmente transformável em meio rico (Figura 6, as pistas 3 e 4) . Devido ao vazamento do promotor lacUV5 em meio LB a 15 polimerase de ARN T7 produziu TFox já transcrita a partir do RNA-polimerase de T7-dependente promotor sem indução. Esta competência iniciado natural e transformação confirmando a funcionalidade da ARN T7 integrado sequência do promotor da polimerase-dependente (Figura 6, coluna 3). Este fenótipo foi significativamente aumentada por indução completa do ARN-polimerase de T7, devido à adição do indutor do promotor lacUV5, IPTG (Figura 6, pista 4).
Figura 1.Fluxograma do método TransFLP. Os seis pontos descritos neste protocolo são elaborados:..;: Transformação artificial de V. 1) Preparação de quitina flocos 2) Opcional cholerae com Flp recombinase-plasmídeo que codifica, 3.) desenho de oligonucleótidos e de reacção em cadeia da polimerase;. 4) transformação induzida por quitina natural; 5) A remoção de cassete selectivo (s) de recombinação por flp-,... 6) O plasmídeo de cura clique aqui para ver maior figura .
Figura 2. Representação esquemática de três possibilidades de aplicação para o método TransFLP. I) Um fragmento de ADN de 1458 pb, contendo a toxina da cólera que codifica os genes ctxA e CtxB, foi suprimido, tal como indicado por Δ. II) A ~ 40 kb patogenicidade Vibrio ilha 1 (VPI-1 13)foi excluído da cepa do tipo selvagem. III) A-polimerase de T7 de RNA dependente de sequência de promotor (28 pb) foi integrada a montante do gene TFox. O retângulo vermelho indica a esquerda atrás de seqüência de nucleotídeos curto de um site FRT única de 10. Clique aqui para ver maior figura .
Figura 3. Explicação para desenho de primers e desempenho de PCR com base na exclusão de ctxAB. Painel A: Para a 1 ª rodada de PCR DNA genômico (gDNA) e plasmídeos pROD17 12 e PBR-FRT-Kan-FRT, respectivamente, serviram como modelos. Os oligonucleotídeos necessários são # 1 a # 6. O iniciador # 2 / # 3 e # 4 / # 5 (exemplo de inserção) deve também possuir uma sobreposição significativa entre si nas suas 5'ends. Painel B: Após a rodada 2 ªPCR, que é baseado em fragmentos da 1 ª rodada da PCR como modelos, um fragmento de tempo deve ser obtidos utilizando par de primers # 1 + # 6. Clique aqui para ver maior figura .
Figura 4. Resultado esperado exemplificado para a estratégia de deleção ctxAB. A estirpe original (tipo selvagem), o mutante de inserção Δ ctxAB :: FRT-Kan-FRT, ea final estirpe Δ ctxAB :: FRT foram testados quanto aos seus genótipos. Painel A: Representação esquemática da potência diferenciação do primer par ctx-CHK-se e ctx chk--se, mais particularmente no que diz respeito à excisão da cassete de antibiótico. Painel B: células bacterianas inteiras foram utilizadas como modelo em reacções de PCR. Para verificar se o DNA mudou lócus primers chk chk-up e para baixo, foram utilizados. Os fragmentos amplificados por PCR foram separados por eletroforese em gel de agarose e visualizados usando DNA SYBR seguro mancha. Pista 1: Tipo selvagem V. cholerae tensão; faixa 2: tensão Δ ctxAB :: FRT-Kan-FRT; pista 3: Δ ctxAB :: FRT. Os tamanhos dos fragmentos de PCR esperados de acordo com o painel A estão indicadas à direita. L, 1kb ladder (Invitrogen). Clique aqui para ver maior figura .
Figura 5. Estratégia para verificar a eliminação da ilha genómico. Painel A: Esquema de patogenicidade Vibrio ilha 1 (VPI-1) (livremente adaptada de Ref. 16; não à escala.). Para a estirpe de tipo selvagem da região de interesse é não amplificável por meio de padrão de PCR e os iniciadores VPI-1-específico chk chk-se e para baixo (~ 40 kb). Por conseguinte, um adicionaloligonucleotídeo recozimento na região para-ser-excluído foi aplicada (VC0817-back), juntamente com up-VPI-chk. Painel B: resultado representativas utilizando o ADN genómico das estirpes respectivas como molde e os pares de iniciadores indicado acima de cada imagem. Cepas testadas: Wild-tipo V. cholerae estirpe (pista 1), a estirpe VPI :: FRT-Kan/Gm-FRT (pista 2), e ΔVPI-1 :: FRT (pista 3). Os tamanhos dos fragmentos de PCR como previsto no painel A são indicados no lado direito. L, 1kb ladder (Invitrogen). Clique aqui para ver maior figura .
Figura 6. Fenótipo Representante após a inserção de uma sequência de promotor artificial. O T7 polimerase dependente de RNA sequência promotora foi integrada a montante do gene TFox competência reguladora utilizando a meto TransFLPd (esboço acima gráfico). O V. dos pais cholerae estirpe (ADVCH-T7POL) contém um gene de ARN-polimerase de T7 dirigida pelo promotor lacUV5. Gráfico: A estirpe parental ADVCH-T7POL (pistas 1 e 2) e da estirpe manipulada por TransFLP (ADVCH-T7POL-T7-TFox :: FRT; pistas 3 e 4) foram testados para transformabilidade natural na ausência (pistas 1 e 3, ) ou na presença de 1 mM de IPTG (pistas 2 e 4). Transformar o ADN genómico foi obtido a partir da estirpe A1552-LacZ-Kan 8. As frequências de transformação são dados no eixo-Y. <Dl, abaixo do limite de detecção de ~ 5 x 10 -8. ** P <0,01 (tal como determinado pelo teste t de Student de dados log-transformados). Seta preta com 'T7' texto:. T7 RNA polimerase sequência promotora-dependente Clique aqui para ver maior figura .
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Discussion
O método TransFLP descrito acima e noutros locais 5 tem sido extensivamente utilizada no nosso laboratório. O tipo de manipulações genéticas que são viáveis incluem, entre outros: a eliminação de genes individuais e aglomerados de genes, a deleção de ilhas genómicas (por exemplo, VPI-1), a inserção de sequências a montante de um gene de interesse (por exemplo, sequências do promotor) e da inserção sequências na extremidade de um gene específico (por exemplo, as etiquetas de afinidade de codificação).
Um pré-requisito para a importação TransFLP é que o respectivo V. estirpe cholerae é naturalmente transformável. Isto não é, por vezes o caso, especialmente em isolados provenientes de pacientes de cólera. Tais estirpes são frequentemente mutado no exemplo quorum sensing circuito, dentro do gene que codifica o principal regulador de quorum sensing, HapR 17. Fornecer volta uma cópia do hapR restaura transformabilidade natural destas seis estirpes como exemplicados para a estirpe-HapR defeituoso N16961 18.
As possíveis modificações podem ser incorporadas, tais como o enriquecimento das bactérias, após transformação natural 8 no caso de a frequência for demasiado baixa. Por favor, note que a freqüência de transformação é, em geral, menor no caso do plasmídeo pBR flp-já está presente ao fazer a quitina induzida por teste de transformação natural. Isto é provavelmente causado por vazamento parcial da expressão sensível à temperatura do gene FLP do pBR-flp, o que resultaria em prematuro excisão da cassete de resistência a antibióticos e a inabilidade para seleccionar estes transformantes. Recomendamos, portanto, para os casos críticos para inserir o plasmídeo pBR flp após a etapa de transformação natural.
Outro passo fundamental é a 2 ª rodada da PCR, que irá combinar as três fragmentos de uma st-redondas PCR. Pode ocorrer que fragmentos parciais estão presentes após a rea PCRction (por exemplo, uma montagem parcial de apenas fragmentos "para cima" e "FRT-Kan-FRT 'de acordo com a Figura 1). Isto é insignificante, como dupla recombinação homóloga com a região cromossómica específica não pode ocorrer nesta situação. Como apenas os transformantes portadores da cassete de resistência a antibióticos são seleccionadas para, todos os transformantes com outras trocas não desejadas de ADN, são excluídos.
Outro ponto a ter em mente é com relação à repetição do procedimento por várias rodadas. Nós já combinou com sucesso a exclusão do agrupamento de genes ctxAB com a supressão da patogenicidade ilha (VPI-1) e um outro grupo de genes de virulência (Blokesch, inédito). Além disso, temos efetivamente integrado a T7 RNA polimerase dependente de promotor dentro destas cepas (a montante TFox e em outros lugares). No entanto, o genótipo previsto deve ser constantemente testadas para todos os intermediários de tensão (por exemplo, por PCR de colónias como demonstrated na Figura 4). Isto irá ajudar a excluir a recombinação mediada por Flp indesejada da esquerda para trás cicatrizes DRF (mostrado como vermelho rectangular em todas as figuras) uns com os outros, enquanto o plasmídeo pBR-flp ainda está presente nas bactérias. Isto pode, provavelmente, ser tomado em consideração para genes localizados remotamente, como a probabilidade de que a excisão da região entre-seria letal devido à supressão de genes essenciais é muito elevado.
Finalmente, gostaríamos de discutir a eliminação de genes dentro de operons. Não se pode excluir que a deleção de um gene a montante, o que deixa uma cicatriz FRT atrás, podem alterar a expressão do gene a jusante (s). Para garantir que este efeito não é a causa do fenótipo observável, mas que este é de facto provocado pela supressão, um ensaio de complementação é recomendada. Um outro controle que já utilizada com sucesso no laboratório é a integração dos DRF a jusante da cicatriz do withou gene de interesset apagando o último. Nós não observamos tais problemas em nosso laboratório ainda, mas não pode excluir a sua existência.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Eu gostaria de agradecer Olga de Souza Silva para assistência técnica. Este trabalho foi financiado pela Swiss National Science Foundation (SNSF) Grant 31003A_127029.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chitin flakes | Sigma | C9213 | Autoclaving required |
| OPTIONAL: Micropulser (in case antibiotic cassette should be excised by Flp recombinase encoded on pBR-flp) | Biorad | 165-2100 | Or comparable electroporators |
References
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