Skin Punch Biopsi Eksplantering Kultur for Utledning av primære humane fibroblaster

Summary

Den fibroblast explant kultur protokoll fra human hud slag biopsier er en teknisk robust og enkel måte for å utlede hudceller innen 4-8 uker for banking av ca 15-20 millioner celler ved en lav passasje nummer.

Abstract

Vev og cellelinjer som stammer fra en person med sykdommen er ideelle kilder for å studere sykdomsrelaterte cellulære fenotyper. Pasient-avledet fibroblaster i denne protokollen har blitt brukt i avledning av induserte pluripotente stamceller til modell sykdom ^1. Tidlige passasjer i disse fibroblaster kan også brukes for celle-baserte funksjonelle analyser for å studere bestemte sykdom trasé, mekanismer ² og påfølgende drug screening tilnærminger. Fordelen med den presenterte protokollen over enzymatiske prosedyrer er 1) at reproduserbarheten av teknikken fra små mengder vev avledet fra eldre pasienter, for eksempel pasienter som lider av Parkinsons sykdom, 2) den teknisk enkel tilnærmingen over mer krevende metoder ved hjelp av enzymatiske behandlinger, og tre ) tiden betraktning: denne protokollen tar 15-20 min og kan utføres umiddelbart etter biopsi ankomst. Enzymatiske behandlinger kan ta opp til 4 timer, og har problemene medoverdigestion, reduksjon av cellenes levedyktighet og påfølgende binding av cellene når de ikke behandles på riktig måte. Denne protokollen beskriver disseksjon og utarbeidelse av et 4-mm menneskelig hud biopsi for avledning av en fibroblast kultur og har en svært høy suksessrate som er viktig når du arbeider med pasient-avledet vevsprøver. I denne kulturen, keratinocytter migrere ut av vevsprøver løpet av den første uke etter fremstilling. Fibroblaster vises 7-10 dager etter den første utvekst av keratinocytter. DMEM høy glukose media supplert med 20% FBS favoriserer veksten av fibroblaster løpet keratinocytter og fibroblaster vil overgrow keratinocytter. Etter to passasjer keratinocytes har blitt utvannet ut som resulterer i relativt homogene fibroblastkulturer som uttrykker fibroblast markør SERPINH1 (HSP-47). Ved hjelp av denne tilnærmingen, kan 15 til 20 millioner fibroblaster utledes i 4-8 uker for cellen banktjenester. Huden disseksjon tar omtrent 15-20 minutter, blir cellene deretter fulgt en gang om dagenunder mikroskopet, og media er endret etter 2-3 dager etter tilknytning og utvekst av celler.

Protocol

Huden punch biopsi innhentet ved hjelp av standard prosedyre ^{3 (dvs.} oppnådd med 4mm runde Visipunch instrument) bør holdes i fullstendig DMEM 20% FBS media på is. Når prøven er ankommet i laboratoriet, behandle biopsi så snart som mulig.

En. Klargjøring av Skin Punch Biopsi

TRINN 01.01 til 01.03 skal utføres inne i en biosikkerhet CABINET

1. Forbered på forhånd: Tilsett 1 ml 0,1% Gelatin til hver brønn i en 6-brønns plate. Sett platen til side i 30-60 min. Aspirer gelatin løsning og legge 800 mL av komplette DMEM/20% FBS media til hver brønn. Sikre at hele overflaten av brønnen er dekket med media.
2. Invert lokket av en steril 10 cm vevskultur-fatet og tilsett 1,5 ml DMEM / 20% FBS medium inn mot midten av lokket og spres ut Medier med spissen av den serologisk pipette.
3. Ved hjelp av en steril pinsett, sted than hudbiopsi brikke i media på fatet.

2. Disseksjon av huden Punch Biopsi

TRINN 9 02.01 til 02.02 skal utføres i en horisontal laminær hette

1. Plasser den nedre delen av 10 cm plate på invertert lokk, og overføre huden biopsi til disseksjonsmikroskop i laminær strømningshette.
2. Dissekere en 4-mm runde hudbiopsi i 12-15 like store stykker med skarpe kanter ved å kutte stykker i to like deler ved hjelp av en skalpell til å holde biopsi på plass og den andre skalpell til å kutte med en rullende bevegelse i én retning. Stykker med frynsete kanter bidra til dårlig feste / celleutvekst.

3. Overføring av dissekert hudbiopsi Deler inn vevskulturplater

TRINN 03.01 til 03.06 skal utføres inne i en biosikkerhet CABINET

1. Plasser den nederste delen av 10 cm vevskultur tallerkenpå toppen av den omvendte lokk, og overføring tallerken tilbake til til biosikkerhet kabinettet.
2. Med en spiss tang, plasserer 2-3 biopsi stykker i hver brønn av den tilberedte 6-brønn plate inneholder 800 mL og ikke på tørre brønner. Bruk peke eller glidende bevegelse for å få brikkene til å feste til bunnen av brønnen. En skalpell er nyttig for å fjerne eventuelle biopsi stykker fra tang.
3. Plasser 6-brønns plate i en 37 ° C inkubator. Overvåk daglig for å sikre at det er en film av media belegg på bunnen av brønnen for den første uken; legg ~ 200 pl hver 2 dager for å erstatte eventuelle fordampede medium.
4. Etter en uke, øke mengden av media til 2 ml komplett DMEM/20% FBS og endre media hver 2-3 dager.
5. Når fibroblaster er konfluent i hver brønn til et punkt der de fibroblaster er å nå kantene av brønnen, trypsinize og passasje 6-brønners plate inn 2X T75 kolber (passasje 1). Vevet stykker kan overføres også. De vil ikke feste og vaskes out under den neste media endring.
6. Når fibroblaster er konfluent, overføre dem til 3X T175 kolber (passasje 2), fryse i fullstendig DMEM media pluss 10% DMSO på 1x10 ⁶ celler / ml per hetteglass.

4. Karakterisering fibroblaster gjennom farging

1. Kultur fibroblaster i åtte vel kammer lysbilde belagt med gelatin.
2. Når cellene er ved 80% konfluens, aspireres mediet fra hver brønn.
3. Løser cellene i 4% paraformaldehyde i ti minutter ved romtemperatur.
4. Vask brønnene tre ganger med 1X PBS.
5. Permeabilize cellene med 150 ul av 0,3% Triton X-100 (i PBS) i 5 min ved romtemperatur.
6. Vask brønnene tre ganger med 1X PBS.
7. Tilsett 200 mL blokkerende løsning (PBS + 5% Normal geit serum (Vector, S-1000)) i 1 time ved romtemperatur.
8. Forbered en 1:250 fortynning av Anti-SERPHIN-1 (Anti-kanin, MAB, Sigma, S5950-200 ul) i blokkering løsning.
9. Enspirate blokkering løsningen, og legge til 150 mL av 1:250 fortynning av AntiSERPINH-en. Inkuber ved 1-2 timer ved romtemperatur, eller ved 4 ° C over natten.
10. Vask brønnene tre ganger med 1X PBS.
11. Forbered en 1:200 geit-anti-kanin monoklonalt antistoff (Alexa Fluor Goat anti-kanin IgG (H + L), Invitrogen, A11008) i blokkering løsning.
12. Tilsett 150 ul av 1:200 geit-anti-kanin monoklonalt antistoff til hver brønn. Inkuber i 1 time, i mørke, ved romtemperatur.
13. Vask brønner gang med 1XPBS.
14. Aspirer PBS, og løft kamrene av å avsløre bare lysbildet.
15. Monter lysbilde med en 2-3 dråper montering medium som inneholder DAPI (Vector, H-1200).
16. Analyser skyve under et fluorescerende mikroskop.

Representative Results

Keratinocytter vokser ut av biopsi stykker så snart 48 timer etter disseksjon. Først fibroblaster utvekst kan observeres om en uke etter behandling. Når brønnene har nådd confluency, er fibroblaster passaged for to passeringer å nå tre 150 cm kolber (T150) og cellene blir cryopreserved. Vi generere med denne metoden 15 til 20 millioner celler. Den fibroblaster er positive for anti-SERPINH1 (også kjent som HSP-47) (figur 1), som er en kollagen-spesifikk molekylærprobe anstand lokalisert i det endoplasmatiske retikulum. HSP47 spiller en avgjørende rolle i kollagen biosyntesen i hudfibroblaster (Kuroda, et al, 2004).

TIME LINE

Dag	Forventning
Dag 3 - Dag 7	Vedlegg og utvekst av keratinocytter	Dag 7 - Dag 14	Utvekst av fibroblaster
Dag 25-Day 35	Fibroblaster bør dekke 6-brønn plate og bør være for passaged inn 75cm kolber, passage en annen gang komme inn 150cm kolber
Dag 30-Day 50	Fryse ned som 1Mio celler / hetteglass ca 15-20 Mio celler i fullstendig DMEM media pluss 10% DMSO

Figur 1. Anti-SERPHIN1 immunhistokjemi av pasient-avledet fibroblast kultur med DAPI kontrafarging.

Discussion

Med denne protokollen, kan relativt rene kulturer av hudfibroblaster oppnås. Fibroblaster har karakteristiske morfologiske trekk ved langstrakte, spindel-lignende celle organer, runde til ovale cellekjerner, og fibroblaster vokse justert og i bunter når konfluent. Mediene støtter veksten av fibroblaster, mens andre celle populasjoner f.eks keratinocytes trenger ekstra tilskudd og vekstfaktorer, eller er mitotisk mindre aktive, gjør dette for relativt rene fibroblastkulturer.

Fibroblaster senere blir passaged med trypsin på et 01:03-01:05 ratio. Kulturen blir utvidet til den ønskede mengde av fibroblaster (15-20 millioner) i løpet av 4-8 uker.

Ved hjelp av denne teknikken, har vårt laboratorium utledet over 70 fibroblast linjer vellykket. Vi har testet hver linje for mycoplasma forurensning og legge antibiotika til vekstmedier for å unngå andre bakteriell forurensning. For jegnitial explant kultur vi funnet at 20% FBS i media støtter veksten, men i senere passasjer 10% FBS er tilstrekkelig. Av og observerer vi en direkte resultat av fibroblaster fra huden stykker antagelig på grunn av den skjærende vinkelen på huden og fjerningen av epidermis som inneholder keratinocytter.

En lignende teknikk ved hjelp av et dekkglass å holde nede huden stykker var mindre effektive i våre hender er ^fire. På grunn av bevegelsen av dekkglass innen kultur tallerken, selv når håndteres med stor forsiktighet-huden biter ikke feste ordentlig.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting microscope	Leica	S6E
10 cm Tissue Culture Petri dish	VWR	25382-166
6-well Tissue Culture plate	VWR	73520-906
Stainless steel disposable sterile scalpels (2), blade No#15, Miltex	VWR	21909-660
Sterile pointed-tip forceps
50 mL Conical tubes	VWR	21008-940
2 mL Serological Pipettes	VWR	89130-894
5 mL Serological Pipettes	VWR	89130-896
10 mL Serological Pipettes	VWR	89130-898
Pasteur Pipettes	VWR	14672-380
Table A. Table of specific reagents and equipments.
1X DMEM: High Glucose	Invitrogen/Gibco	11960-069
20% Fetal Bovine Serum	Invitrogen/Gibco	26140-079
1X L-Glutamine	Invitrogen/Gibco	25030-164
1X MEM Non-essential Amino Acids	Invitrogen/Gibco	11140-076
1X Penicillin/Streptomycin	Invitrogen/Gibco	15140-163
Table B. Reagents.