Encellede Analyse af Bacillus subtilis Biofilm Brug fluorescensmikroskopi og Flowcytometri

Summary

Mikrobielle biofilm udgøres generelt af forskellige subpopulationer af specialiserede celler. Enkelt-celle-analyse af disse subpopulationer kræver anvendelse af fluorescerende reportere. Her beskriver vi en protokol til at visualisere og overvåge flere subpopulationswithin

Abstract

Biofilmdannelse er en generel egenskab for næsten alle bakterier ^1-6. Når bakterier danner biofilm celler er indkapslet i ekstracellulære matrix, der hovedsagelig udgøres af proteiner og exopolysaccharider, blandt andre faktorer ^7-10. Den mikrobielt samfund indkapslet i biofilmen ofte viser differentieringen af særskilte underpopulation af specialiserede celler ^11-17. Disse delpopulationer eksistere side om side og ofte viser rumlige og tidslige organisation i biofilmen ^18-21.

Biofilm dannelse i model organisme Bacillus subtilis kræver differentiering af forskellige subpopulationer af specialiserede celler. Blandt dem er den subpopulation af matrix producenter ansvarlige for at producere og udskille den ekstracellulære matrix af biofilmen afgørende for biofilmdannelse ^11,19. Derfor, differentiering af matrix producenter er kendetegnende for biofilmdannelse i B. subtilis.

Vi har brugt fluorescerende reportere til at visualisere og kvantificere subpopulationen af matrix producenter i biofilm af B. subtilis ^15,19,22-24. Konkret har vi observeret, at subpopulationen af matrix producenter differentierer i respons på tilstedeværelsen af selv-produceret ekstracellulært signal surfactin ^25. Interessant nok er surfactin fremstilles ved en subpopulation af specialiserede celler forskellige fra den subpopulation af matrix producenter ^15.

Vi har beskrevet i denne rapport tekniske tilgang er nødvendige for at visualisere og kvantificere subpopulationen af matrix producenter og surfactin producenter inden for biofilm fra B. subtilis. For at gøre dette, er fluorescerende indberettere af gener, der kræves for matrix produktion og surfactin produktion indsættes i kromosomet af B. subtilis. Reportere udtrykkes kun i en subpopulation af specialiserede celler. Derefter kan subpopulationer væreovervåges ved hjælp af fluorescensmikroskopi og flowcytometri (se figur 1).

Den kendsgerning, at forskellige subpopulationer af specialiserede celler eksisterer i flercellede samfund af bakterier giver os et andet perspektiv om reguleringen af ​​genekspression i prokaryoter. Denne protokol omhandler dette fænomen eksperimentelt, og det kan let tilpasses enhver anden bearbejdning model, at belyse de molekylære mekanismer, der ligger til grund for fænotypiske heterogenitet inden for en mikrobielle samfund.

Protocol

1. Mærkning B. subtilis og biofilmdannelse Assay

1. Amplificere ved PCR promotorregionen for genet af interesse. Vi viser, som eksempel kloning af P _tapa, promotoren af generne ansvarlige for produktionen af TasA matrixprotein ^26. Klon P _tapa i pkm008 vektor (skabt af Rudner laboratoriet, Harvard Medical School. Boston, USA) (fig. 2).
2. Linearisere de plasmider, ved enzymatisk fordøjelse (Enzyme anbefalede XhoI).
3. Fremkald naturlig kompetence i B. subtilis stamme 168 ved at følge et trin protokol tidligere beskrevet af Harwood og Cutting ^27.
4. Tilsættes de lineariserede plasmider i kulturen af ​​kompetente celler og selektion af spectinomycinresistens efter to timers inkubation.
5. Opnåede stammer har indsat konstruktionen i den neutrale amyE locusen af B. subtilis ved dobbelt rekombination (figur 4). Hvis du vil opretteen dobbelt-mærket stamme, integrerer det andet reporter i neutral locus Laca ved anvendelse af plasmidet pDR183 præsenteres i figur 3. Indsætter denne reporter anvendelse af den samme teknik, som vi beskrevet ovenfor til indføring af reportere klonet i pKM008.
6. Overføre reporteren fra stammen 168 til NCIB3610 der er i stand til at danne biofilm. Anvende SPP1 phag-transduktion protokol ^28,29. Vokser donorstamme i TY-medium (LB + 10 _mM MgSO4 +10 uM MnSO _4). Bland 200 ul af kulturen med 100 gl af fag-stamopløsning fortynding. Tilsæt 3 ml blød agar efter 30 minutters inkubering og tillader fag haloer opstår ved 37 ° C.
7. Opsamle blød agar. Centrifuger det og give supernatanten troede en sprøjte 0,22 um filter. Benytte denne supernatant at inficere en kultur af recipient-stammen dyrket i TY-medium. Tilsæt 30 gl 10 ml af kulturen fortyndet 1:10. Inkuber i 30 minutter og selektere for antibiotisk resistens efter 24 timers inkubation.
8. Select en koloni, og dyrke det natten over på LB ved 37 ° C.
9. Øje 3 pi af overnatskulturen på fast biofilm-inducerende medium MSgg 1,5% agar ^30. Tillader celler at vokse i 72 timer ved 30 ° C (figur 3). Efter tre dages vækst, udvikling biofilm dannet på overfladen af ​​MSgg agar et kompleks morfologisk struktur i overfladen af ​​agaren.

2. Biofilm Dispersion og cellefiksering

1. Fjerne biofilm danner overfladen af ​​MSgg agar med en tandstikker eller en pincet. Konsistensen af ​​biofilmen bør give dig til at skrælle den fra overfladen af ​​agar i ét stykke.
2. Placere biofilm i 3 ml PBS-buffer og dispergere biofilm ved gentagen passage gennem en pipette eller en nål. Alternativt kan biofilm dispersion gøres ved hjælp af mild sonikering. Mild sonikering kræver 12 pulser med en effekt på 3 og amplitude på 0,7 sekunder.
3. Fastsætte prøver før celle-enkelt analyse. Resuspend 300 pi af cellesuspensionen i 1 ml 4% paraformaldehyd-opløsning og inkuberes ved stuetemperatur i nøjagtig syv minutter.
   Sammensætningen af ​​4% paraformaldehyd-opløsning:
   2 g paraformaldehyd
   50 ml PBS-buffer
   4 gl 10 N NaOH
   Opløsningen filtreres gennem et 0,22 um filter og prøve
4. Vask cellerne efter fiksering i PBS-buffer tre gange og resuspenderes dem i 300 pi PBS-buffer.

3. Fluorescensmikroskopi

1. Hæld 200 pi 0,8% agarose i et mikroskopobjektglas og omhyggeligt dække det med en anden lysbillede. Fjerne den øvre slæde blødt efter 2 minutter til opnåelse af et lag af agarose fastgjort til skinnen på bunden.
2. Plet 2 uL af fikserede celler på overfladen af ​​agarosen lag og dække det med et mikroskop dækglas.
3. Anbring prøven i fluorescensmikroskop. Vi bruger en Fluorescensmikroskop Leica DMI6000B udstyret med et Leica CRT6000 iIlumination-system. De filtre til YFP er Ex: BP500/20, Em: BP535/30 og for den fælles fiskeripolitik er Ex: BP426/20, Em: 480/40
4. Bring din prøve en magnetisering fluorescens mellem 50-200 ms. Indstille excitations periode efter en negativ kontrol, der ikke viser fluorescens i de valgte betingelser for eksperimentet.
5. Henvise fluorescensbillede af det samme billede blev opnået med lyst område. Flet de to billeder i ét billede. Resultaterne opnået fra flow fluorescensmikroskopi under anvendelse af en enkelt-mærket stamme, der huser reporter P _tapa-YFP er vist i figur 6.

4. Kvantificering af enkeltceller ved anvendelse af flowcytometri

1. Prøven bliver dispergeret af fikserede celler ved hjælp af mild sonikering. Sonikeres prøven udfører to serier af 12 pulser med en effekt på 5 og amplitude på 0,7 sekunder, for at dispergere klumper i enkelte celler uden at forårsage cellelysis. Bekræfter effektiviteten af ​​cellen dispersion ved lysmikroskopi. Fortyndede prøve 1:100 i PBS-buffer før flowcytometrianalyse. Vi anvender et flowcytometer BD FACS Canto II. For YFP fluorescens, anvendes en laser excitation ved 488 nm i kombination med et 530/30 filter. For den fælles fiskeripolitik fluorescens, skal du bruge laser excitation ved 405 nm kombineret med en 408/40 filter.
2. Kalibrere flowcytometeret maskine med to negative kontroller. En prøve af PBS-buffer uden celler i suspension tjene som negativ kontrol for størrelsen af ​​de partikler, som detekteres af flowcytometer. En prøve mærket med ingen fluorescens reporter skal tjene som negativ kontrol for fluorescens følsomhed flowcytometer.
3. Anbring prøven mærket med den fluorescerende reporter i flowcytometret. For hver prøve, analysere mindst 50.000 begivenheder med en strømningshastighed på mellem 300 og 3000 hændelser pr.
4. Capture data ved hjælp af FACS Diva software (BD Biosciences) og analysere det ved hjælp af FlowJo 8.5.2 software. Se fluorescens signaler til den kontrol, som visers ingen fluorescens.
5. Præsenterer data til overvågning af fluorescenssignal af en enkelt-mærket stammen i en to-akserne grafik. Plotte fluorescens-signalet detekteret i X-aksen, og antallet af celler, der udtrykker de forskellige niveauer af fluorescens i Y-aksen. Resultaterne opnået fra flowcytometrisk analyse ved anvendelse af en enkelt-mærket stamme, der huser reporter P _tapa-YFP er vist i figur 8.
6. Præsenterer data til overvågning af fluorescenssignal af en dobbelt-mærket stammen i en tre-akserne grafik. Plotte fluorescenssignalet af hver af kanalerne overvåges i X-og Y-akserne (for eksempel vil GFP blive målt i X-aksen og CFP i Y-aksen). Plot i Z-aksen antallet af celler, der udtrykker hver reporter og præsentere dem som konturen isolines der ville være vinkelret på planet af papiret (fig. 9 og 10).

4. Repræsentative resultater

Når B. subtilis vokser på en plade af biofilm-inducerende medium MSgg, biofilmdannelse er observeret efter tre dages inkubation ved 30 ° C ^30. Biofilmen viser stærk sammenhæng og det kunne afrives fra overfladen af ​​agar i ét stykke. Endvidere biofilmen viser et komplekst morfologisk arkitektur, der er betegnende for de forskellige deltagende cellesubpopulationer (fig. 5). For eksempel. Fremstilling af den ekstracellulære matrix i biofilm resulterer i dannelsen af ​​rynker på overfladen af ​​kolonien Denne funktion kan være korreleret med differentiering af subpopulationen af matrix producenter ^19. Tilsvarende optagelse af luften strukturer på overfladen af biofilmen er indikativ for tilstedeværelsen af en subpopulation af sporulerende celler, eftersom de sporer lokaliseret i det apikale område af disse strukturer ^30.

Eksempler på visualisering af celledifferentiering i en enkelt-mærket og en dobbelt-mærket stamme under anvendelse af fluorescens-mikroskopi er represented i figur 6 og 7 hhv. Enkelt-mærket stamme huser det fluorescerende reporter P _tapa-CFP, der udtrykkes i subpopulationen af matrix-producerende celler. Dette subpopulation er ansvarlig for at producere og udskille den ekstracellulære matrix, der udgør biofilmen (fig. 6). Den dobbelt-mærkede stammen huser den reporter P _tapa-CFP ²⁶ og yderligere reporter P _srfAA-YFP ^31. Dette andet reporter tillader at overvåge subpopulation af celler, der er ansvarlige for at udskille den signalerende molekyle surfactin, som udløser signalkaskade til differentiering af matrix producenter (fig. 7). Subpopulationen af ​​matrix producenter er falsk farvet i blåt, mens subpopulationen af ​​surfactin producenter er falsk farvet i gult.

Flowcytometri-analyse under anvendelse af en enkelt-mærket stamme, der huser reporter P _tapa-YFP er vist i figur 8. Ubehandlet kontrol stammen ikke husernoget fluorescerende protein-gener viste en enkelt population lav relativ fluorescens. Celler, der huser P _tapa-YFP i ikke biofilm-fremkaldende forhold heller ikke skelner subpopulationen af matrix producenter og befolkningen som helhed viste lav relativ fluorescens. I biofilm-inducerende tilstand forekom en subpopulation af celler med høj relativ fluorescens, observeret som en skulder til højre for den lave relative fluorescens top ^23.

Resultaterne fra flow-cytometri-analyse under anvendelse af en dobbelt-mærket stamme er vist i figur 9 og 10. Figur 9 overvåget delpopulationer af matrix producenter og surfactin producenter, der anvender dobbelt-mærkede stamme P _{tapa-fiskeripolitik,} P _srfAA-YFP. Som kontrol af baggrundsfluorescens anvendte vi en stamme, der ikke huser nogen fluorescerende protein-gener. Dernæst har vi opdaget hver delpopulation af matrix producenter og surfactin producenter i hver fluorescens kanal, ved hjælp af single-mærket stammen s som kontrol. Den dobbelt-mærket stamme P _tapa-CFP, P _srfAA-YFP viste to subpopulationer af celler, der udtrykker høje niveauer af de fluorescerende reportere. Hver befolkning er indrammet, viser, at der ikke er nogen overlapning i ekspressionen af journalisterne mellem de to subpopulationer af specialiserede celler ^15. Tilsvarende flowcytometri-analyse under anvendelse dobbelt-mærket stamme P _SKF-YFP, P _tapa-YFP er vist i figur 10. Reporter for genet SKF overvåger differentiering af subpopulationen af kannibaler ^32, som er blevet beskrevet at differentiere koordineret med subpopulationen af matrix producenter ^24. I dette tilfælde viste den dobbelt-mærket stamme én subpopulation af fluorescerende celler, der udtrykker både YFP og CFP. Dette indikerede, at begge celledifferentieringsfaktorer pathways koordineret aktiveres på samme subpopulation.

1.jpg "/>
Figur 1. Samlet ordning af eksperimentet. Protokollen er opdelt i tre trin. Det første trin kræver mærkning af stamme af B. subtilis med journalisten fusion, der overvåger delpopulation af interesse. Sekund, vokser mærkede stammer i biofilm-inducerende betingelser. Tredje dispergere biofilmen og udføre enkelt-celle-analyse af populationen under anvendelse af fluorescens-mikroskop og flowcytometri.

Figur 2. Skematisk repræsentation af integrationsvektor pKM008. Denne vektor integreres reporteren fusion af interesse i den neutrale locus amyE ved at dobbeltklikke rekombination. Promotoren af interesse (P _tapa) klones i vektoren under anvendelse af restriktionssites EcoRI og HindIII. Derefter ekspressionen af FFP genet er under kontrol af promotoren P _tapa. Den orientation af generne i plasmidet er repræsenteret som en pil.

Figur 3. Skematisk repræsentation af integrationsvektor pDR183. Denne vektor integreres reporteren fusion af interesse i den neutrale locus Laca ved at dobbeltklikke rekombination. Fusion af interesse (P _tapa - FFP) klones i vektoren under anvendelse af restriktionssites EcoRI og BamHI. Orienteringen af ​​gener i plasmidet er repræsenteret som en pil.

Figur 4. Ordningen af integrationen af reportere i kromosomet af B. subtilis ved dobbelt rekombination. (A) B. subtilis kromosomet har to neutrale loci, amyE og Laca at integrere reporter fusioner uden at påvirke udviklingen af biofilmen. (B) B. subtilis ved dobbelt rekombination. Reporter fusion integreres i neutral locus på en stabil måde.

Figur 5. Biofilmdannelse B. subtilis NCIB3610. Proces bioflm dannelsen af stammen B. subtilis NCIB 3610, når der vokser på biofilmen-inducerende medium MSgg i tre dage ved 30 ° C. Sekventielle billeder af udviklingen af ​​biofilmen blev taget hver 12 timer.

Figur 6. Visualisering af subpopulationen af matrix producenter under fluorescensmikroskop. En prøve fra en biofilm af B. subtilis P _tapa - fælles fiskeripolitik blev fastlagt og undersøgt under fluorescensmikroskop. 200 ms af fluorescensexcitation ses en subpopulation af celler udsender højere fluorescens end resten af ​​cellerne. Vi overvejede denne delpopulation som subpopulationen af ​​matrix-producerende celler. Målestokken er 3 um.

Figur 7. Visualisering af subpopulationen af matrix producenter og surfactin producenter under fluorescensmikroskop. Prøve fra en biofilm af B. subtilis P _{tapa-fiskeripolitik,} P _srfAA-YFP dobbelt-mærket stammen blev fastsat, og undersøgt under fluorescensmikroskop. Eksponeringstid på 250 MS viste to subpopulationer af celler udleder højere fluorescens end resten af ​​cellerne. En delpopulation udtrykte YFP, og det blev opdaget udelukkende ved hjælp af YFP kanal (falsk farvet i gult). Dette er den subpopulation af surfactin producenter. En anden delpopulation udtrykte fælles fiskeripolitik, og det blev udelukkende påvist ved hjælp af den fælles fiskeripolitik chann el. Dette er den subpopulation af matrix producenter. Målestokken er 3 um.

Figur 8. Kvantificering af subpopulationen af matrix producenter anvender 2-D flowcytometri. Dispergerede celler fra en biofilm af B. subtilis P _tapa-YFP blev overvåget ved hjælp af flowcytometri. Flowcytometeret talt 50.000 begivenheder og fluorescens signal for hver enkelt begivenhed blev overvåget. Optalte antal celler er afbildet i Y-aksen, medens intensiteten af ​​YFP signal plottet i X-aksen. Celler blev dyrket i LB-medium til opnåelse af ikke-biofilm inducerende betingelser. Celler blev dyrket i MSgg medium til opnåelse af biofilm-inducerende betingelser. Subpopulationen af ​​matrix producenter adskiller kun biofilm-inducerende betingelser. Dette tal blev tilpasset fra López et al., PNAS (2009) 106 :280-285.

s/ftp_upload/3796/3796fig9.jpg "/>
Figur 9. Kvantificering af subpopulationen af matrix producenter og surfactin producenter anvender 3-D flowcytometri. Fluorescenssignal af de overvågede kanalerne er præsenteret i X-aksen (for YFP) og Y-aksen (for CFP). Z-aksen måler antallet af celler, der udtrykker hver reporter og kvantificeres som konturen isolines vinkelret på papirets plan. Antallet af begivenheder overvåget i dette forsøg var 50.000 begivenheder. Øverste venstre panel viser en kontrol af baggrundsfluorescens huse ingen fluorescerende protein-gener. Højre øverste panel registrerer subpopulationen af surfactin producenter i YFP fluorescens kanal (indrammet i gult) med en enkelt-mærket stamme P _srfAA-YFP. Nederste venstre panel registrerer subpopulationen af matrix producenter i den fælles fiskeripolitik fluorescens kanal (indrammet i blåt) hjælp af en enkelt-mærket stamme P _{tapa-fiskeripolitik.} Den dobbelt-mærkede stamme P _tapa </ Em>-fiskeripolitik, P _srfAA-YFP overvåges i nederste højre panel. Det viste to subpopulationer, der er indrammet i gul og blå. Dette tal blev tilpasset fra López et al., Genes and Development (2009) 23 :1631-1638.

Figur 10. Kvantificering af subpopulationen af matrix producenter og kannibaler anvendelse af 3-D flowcytometri. Fluorescenssignal af de overvågede kanalerne er præsenteret i X-aksen (for YFP) og Y-aksen (for CFP). Antallet af begivenheder overvåget i dette forsøg var 50.000. Højre øverste panel registrerer subpopulationen af kannibaler i YFP fluorescens kanal (indrammet i gult) i en enkelt-mærket stamme P _SKF-YFP. Nederste venstre panel registrerer subpopulationen af matrix producenter i den fælles fiskeripolitik fluorescens kanal (indrammet i blåt) i en enkelt-mærket stamme P _{tapa-fiskeripolitik.} Double-mærket stamme P _{tapa-fiskeripolitik,} P _SKF-YFP viste kun en subpopulation af celler i diagonal til X-og Y-akser (indrammet i grønt). Denne subpopulation er påvist i YFP og den fælles fiskeripolitik kanal, fordi det udtrykker de to reportere samtidigt. López et al., Genes and Development (2009) 23 :1631-1638.

Discussion

Det faktum, at bakterielle samfund viser subpopulationer af celler, der udtrykker specifikt sæt af gener beviser kompleksiteten af mikrobielle samfund ^33,34. Denne protokol skal hjælpe til at fastslå, om ekspressionen af ​​ethvert gen af ​​interesse er begrænset til en bestemt underpopulation af specialiserede celler i det mikrobielle samfund. Visualisering af disse delpopulationer kræver udvikling af nye teknikker, fordi de traditionelle metoder til at overvåge genekspression eller microarray analyse på de niveauer af genekspression til hele mikrobielle samfund og svingninger i genekspression i det mikrobielle samfund generelt overset.

Fluorescensmikroskopi og flowcytometri komplement ideelt til analyse af celletyper for at tilvejebringe en kombination af kvalitativ og kvantitativ, der vil definere af subpopulationen af ​​interesse. Begrænsninger af begge teknikker gør det nødvendigt at henvise til hinanden for the skyld nøjagtigheden af ​​målingerne. I tilfælde af fluorescensmikroskopi, varierer intensiteten af ​​signalet fra fluorescerende celler (og undertiden størrelsen af ​​subpopulationen) afhængigt af eksponeringstiden anvendes til at excitere prøverne (normalt mellem 50 og 200 ms). I tilfælde af flowcytometri begrænser imidlertid den lille størrelse af bakteriecellerne til påvisning og nogle bakterielle kan ikke overvåges. På grund af cellestørrelsen begrænsninger bør fluorescenssignal udsendt med reporter være høj nok til at tillade detektion af fluorescens, og netop derfor, man har oplevet problemer med påvisning af celler, der udtrykker reportere med lavt ekspressionsniveau. Men nye flowcytometre nu kommer med en mere følsom detektionsgrænse, som giver os mulighed for at overvåge bakterielle populationer i en mere præcis måde. Desuden vil den højere følsomhed i detektionsgrænsen tillade os at undersøge for cellesortering, at isolere den subpopulation af celler vi interested i og foretage genekspressionsanalyse i dette subpopulation.