Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Måling av Faktor V aktivitet i Human Plasma Ved hjelp av en Microplate koagulasjon Assay

Published: September 9, 2012 doi: 10.3791/3822
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Applied Bioscience Program, Faculty of Science, University of Ontario Institute of Technology, 2Nursing Program, Faculty of Health Sciences, University of Ontario Institute of Technology, 3Medical Laboratory Science Program, Faculty of Health Sciences, University of Ontario Institute of Technology

Summary

Denne studien beskriver en roman mikroplate metode som måler FV koagulasjon aktivitet under fibrinkoagel dannelse i human plasma som ikke har vært rapportert tidligere. Metoden bruker en kinetisk mikroplateleser for kontinuerlig å måle endring i absorbans ved 405nm under fibrinkoagel dannelse i human plasma.

Abstract

I respons til skade, er blod koagulasjon aktivert og resulterer i generering av clotting protease, trombin. Trombin spalter fibrinogen til fibrin som danner et uløselig blodpropp som stopper blødning. Faktor V (FV) i sin aktiverte form, FVA, er en kritisk kofaktor for proteasen FXa og akselerator av trombin generasjon under fibrinkoagel formasjon som del av en prothrombinase, 2. Manuelle FV assays er beskrevet 3, 4, men de er tidkrevende og subjektive. Automatiserte FV analysene rapportert 5-7, men analysatoren og reagenser er dyrt og generelt gir bare clot tid, ikke hastigheten og omfanget av fibrindannelse. Mikroplate plattformen foretrekkes for måling enzym-katalysert hendelser på grunn av bekvemmelighet, tid, kostnader, mindre volum, kontinuerlig overvåking og high-throughput 8, 9. Mikroplate analyser har blitt rapportert for blodpropp lysering 10, blodplateaggregasjon11, og koagulasjonsfaktorene 12, men ikke for FV aktivitet i humant plasma. Målet med metoden var å utvikle en mikroplate metode som måler FV aktivitet under fibrin formasjon i humant plasma.

Denne romanen mikroplate metoden skisserer en enkel, billig, og rask analyse av FV aktivitet i humant plasma. Analysen benytter en kinetisk mikroplateleser å overvåke absorbansen endre på 405nm under fibrindannelse i humanplasma (Figur 1) 13. Analysen måler nøyaktig tid, innledende hastighet, og omfanget av fibrinkoagel formasjon. Det krever kun ul mengder plasma, er komplett i 6 min, har høy gjennomstrømning, er følsom for 24-80pM FV, og måler mengden av utilsiktet aktivert (1-trinns-aktivitet) og trombin-aktivert FV (2-trinns-aktivitet ) for å oppnå en fullstendig vurdering av sin samlede funksjonell aktivitet (2-trinns-aktivitet - 1-trinns-aktivitet).

Spres intravaskretsløp koagulasjon (DIC) er en ervervet koagulopati som oftest utvikler seg fra pre-eksisterende infeksjoner 14. DIC er assosiert med en dårlig prognose og øker dødelighet i forhold til før-eksisterende patologi 15. Analysen ble brukt til å vise at det i 9 pasienter med DIC, FV 1-trinns, to-trinns, og total aktivitet var redusert i gjennomsnitt, med 54%, 44%, og 42%, sammenlignet med normal humane referanse plasma (NHP).

FV mikroplate-analysen er enkelt tilpasses for å måle aktiviteten i alle koagulasjonsfaktor. Denne analysen vil øke vår forståelse av FV biokjemi gjennom en mer nøyaktig og fullstendig måling av sin virksomhet innen forskning og kliniske settinger. Denne informasjonen vil positivt påvirke helsevesenet gjennom tidligere diagnose og utvikling av mer effektive behandlinger for koagulasjonsforstyrrelser, for eksempel DIC.

Protocol

1. Utarbeidelse av FV-mangelfull Human Plasma

  1. Denne metoden er en modifikasjon av fremgangsmåten opprinnelig beskrevet av Bloom et al 4.
  2. Skaffe humant fullblod fra en samtykkende sunn voksen frivillig (mann eller kvinne, alder 18 - 50 år) som ikke tar noen medisiner. Bruke gummihansker og en laboratoriefrakk gjennom hele prosedyren.
  3. Forbered 100 ml 3,2% (w / v) trinatrium-citrat i destillert vann. Last 6,0 ml av denne løsningen i separate 60 ml sprøyter. Fjerne luft etter deprimerende stempelet nøye til 6,0 ml på sprøyten.
  4. Bruk en spritkompress å rense området cubital blodåre mellom biceps og underarm. Koble 20 gauge sommerfugl apparat til en 3 ml sprøyte. Sett butterfly nål inn cubital venen og trekke forsiktig på stempelet inntil blod fyller til 3 ml merket. Kast sprøyten med blod. Dette trinnet utføres for å fjerne ethvert vevsfaktor frigjøres fra skadede endotelet ved nålenskadestedet som kan aktivere koagulasjonsprosessen og forstyrre med utarbeidelse av FV-mangelfull plasma.
  5. Koble butterfly nål til 60 ml sprøyte 'lastet' med 6,0 ​​ml trisodium citrate og trekke forsiktig på stempelet til blodet når 60 ml på sprøyten. (Final citrate konsentrasjon 10.9mm).
  6. Fjern sprøyten fra butterfly nål og forsiktig bland sprøyte mens du holder en gloved finger eller tommelen på sprøyten uttaket.
  7. Fortsette å tegne blod inn 60 ml sprøyter hver fylt med 6,0 ​​ml av 3,2% trinatrium-citrat, som beskrevet ovenfor. En bør forutse gjenvinning av ca 50% av citrert blodvolum som plasma etter sentrifugering og at 50 pl FV-mangelfull plasma kreves per prøve i mikroplate analysen. Vårt laboratorium behandler rutinemessig 300-420 ml citrert blod gangen med 5-7 x 60 ml sprøyter hver med 6,0 ​​ml 3,2% trisodium citrate / sprøyte. Dette er tilstrekkelig FV-mangelfull plasma for ca 3000 microplate analyser (se nedenfor).
  8. Fjern butterfly nål fra frivillig arm og trykker på en steril kompress over området av vein punktering for 1,0 min. Dekke området av vein punktering med en steril bandasje.
  9. Sentrifuger citrert blod ved 3300 xg i 20 min ved romtemperatur. Gjenopprette øvre gule plasma lag til en plast beger med en rørepinne med en plast overføringspipetten tar seg ikke å forstyrre den nedre røde og hvite blodlegemer lag.
  10. Måler volum av plasma i ml og beholde 100 pl plasma før EDTA tillegg på is for fremtidig prothrombin clot tid (PT) prøving (se nedenfor).
  11. Tilsett sakte faststoff EDTA til citrert plasma med forsiktig omrøring ved romtemperatur for å oppnå 5mM (sluttkonsentrasjon). Når EDTA er oppløst, juster pH til 7,0 ved dråpevis tilsetning av 1.0M NaOH med forsiktig omrøring.
  12. Dekk begerglasset med Saran Wrap og inkuber i 8-10 timer uten omrøring ved 37 ° C.
  13. Hver 2 hr, gjenopprette 100filEDTA-behandlet plasma på is og bestemme PT ved inkubering med EDTA og sammenlign med PT av plasma før EDTA tillegg (se ovenfor).
  14. For PT bestemmelser, sted flyttbare 8 vel immunomodule strimler i plast mal holderen og sett den inn i mikroplateleser.
  15. Orient immunomodule strimler i mikroplateleser som: tom, tom, sample, tom, tom, sample, tomme, og tom fra venstre til høyre i malen holder å minimere lysspredning forstyrrelser fra sample-holdige strimler. Også bruke bare brønner 2-7 fra topp til bunn i hver 8 vel immunomodule stripe å minimere lysspredning forstyrrelser fra kantene av plast mal holderen.
  16. FV mikroplate analysen er i stand til å måle fibrin dannelse av blodpropper i minst 12 forskjellige prøver samtidig (6 prøver per immunomodule stripe over 2 immunomodule strimler).
  17. Ved hjelp av en flerkanals pipette, tilsett 50 ul HBS (20MM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,4) tilhver mikroplate godt for hver av prøven som skal analyseres. Ved hjelp av en enkelt pipette, tilsett 50 pl av normalt humant plasma poolet referanse (NHP) eller plasma før tilsetning av EDTA eller ved forskjellige inkubasjonstider etter tilsetning EDTA til skille mikroplate brønnene.
  18. Ved hjelp av en flerkanals pipette, tilsett 50 ul tromboplastin (Se under for forberedelse metode) til alle mikroplate brønner med plasma som skal undersøkes. Inkuber i mikroplateleser ved 25 ° C i 1 min og programmere mikroplateleser å riste platen under 15-25 sek i 1 min inkubering.
  19. Bruker datamaskinen tilkobles med mikroplateleser, tilgang SoftMax Pro mikroplate programmet. Still leseren til Absorberingsevne, Wavelength til 405nm, modus til Kinetic, temperatur til 25 ° C, og programmere mikroplateleser å riste i 5 sek, og les absorbansen ved 405nm hver 5 sek i 6 min.
  20. Ved hjelp av en flerkanals pipette, tilsett kalsiumklorid (50 ul av 25 mM i destillert vann; 2.1MM final konsentrasjon) til alle mikroplate brønner, vente 15 sekunder, og trykk "Start"-ikonet på mikroplate SoftMax Pro-menyen for å starte analysen.
  21. Bestem PTS fra absorbansen vs Tid profiler i SoftMax Pro som tiden for å nå halvparten maksimal økning i absorbans ved 405nm (midtpunktet av sigmoidal Absorbance vs Tid kurve produsert etter thromboplastin og kalsiumklorid tillegg. Se nedenfor, Figur 1).
  22. Beregn FV 1-trinns aktivitet fra Log Clot (sek) vs Logg FV aktivitet (Enheter / ml) som illustrert nedenfor i figur 2A. For kvantifiseringsgrensen formål er 1Unit av FV aktivitet definert som aktiviteten som er tilstede i 1,0 ml NHP før tilsiktet aktivering med tilsatt trombin (Se nedenfor, analysere humane plasmaprøver med FV en-trinns og to-trinns mikroplate koagulasjon analysen).
  23. Forbered 4.0L på 20mm HEPES inneholder 0,15 M NaCl i destillert vann med forsiktig omrøring. Juster pH til 7,4 med treg dropwise tilsetning av 5.0M NaOH (HBS, pH 7,4).
  24. Skaffe seg tilstrekkelig lengde på dialyse rør og skyll grundig med destillert vann. Knyt en knute i den ene enden av slangen. Transfer EDTA behandlet plasma til dialyse rør med en plast overføringspipetten, fjerne luft, og knyt en knute i den andre enden av slangen.
  25. Nøye henge EDTA-behandlet plasma i slangen inn HBS med forsiktig omrøring. Dekk med Saran Wrap og Dialyser for 14-16h med forsiktig omrøring ved 4 ° C.
  26. Fjern forsiktig EDTA-treated/dialyzed plasma i 3,0 ml alikvoter til 15,0 ml skrukork rør og beholde 100 pl for PT-test av "endelige" FV-mangelfull plasma på is. Oppbevar FV-mangelfull plasma i ved -80 ° C inntil bruk. Under forholdene beskrevet ovenfor, PTS økning fra 10-15 sekunder før EDTA tillegg til 90-100 sek 8-10 timer etter EDTA tillegg. FV-mangelfull plasma fremstilt ved denne metoden inneholder rutinemessig mindre enn 0,1% av den aktive FV tilstede i utgangsmaterialetfersk humant plasma.

2. Utarbeidelse av tromboplastintid

  1. Dialyse er nødvendig for å fjerne eventuelle kalsium fra denne reagensen for å tillate nøyaktig timing fibrinkoagel dannelse fra tidspunktet for kalsiumklorid tillegg til å initiere koagulasjonsprosessen.
  2. Forbered 100 ml og 4.0L av 20mm HEPES og 0,15 M NaCl i destillert vann i en plast begerglass med forsiktig omrøring. Juster pH til 7,4 med langsom dråpevis tilsetning av 5.0M NaOH (HBS, pH 7,4).
  3. Legg 6,0 ml HBS, pH 7,4 til hvert hetteglass tromboplastintid reagens, erstatte lokket, og rist forsiktig for å løse. Inkuber reagens i avkortet hetteglass i 15 min ved romtemperatur for å oppløse tørket materiale. Rist forsiktig for å løse.
  4. Skjær en tilstrekkelig lengde av dialyse tubing, skyll godt med destillert vann, og feste en ende av røret med en knute. Overføre thromboplastin til dialyse rør, fjerne luft, og feste andre enden av slangen med en knute.
  5. Carefully henge dialyse tubing i 4.0L av HBS, pH 7,4 og forsiktig omrør dekket med Saran Wrap ved 4 ° C i 14-16 timer.
  6. Overføre 3,0 ml alikvoter av det dialyserte tromboplastintid til 15 ml skrukork rør og oppbevar ved -80 ° C inntil brukt.

3. Forberedelse av FV 1-trinns Mikroplate Koagulasjon Assay aktivitet Standard Curves

  1. Tine FV-mangelfull plasma, NHP og tromboplastin ved 37 ° C i 10 min. Bland forsiktig FV-mangelfull plasma og tromboplastintid selvstendig, overføre å skille plast vaske skuffer og inkuber på is. Oppbevar NHP på isen etter forsiktig blanding. Butikk kalsiumklorid (25 mM i destillert vann) i en separat vasking skuff ved romtemperatur.
  2. Forbered 200 pl hver av 2-fold serielle fortynninger av NHP fra 0 -, 2 -, 4 -, 8 -, 16 -, 32 -, 64 -, 128 -, 256 -, 512-fold i HBS, pH 7,4 under anvendelse av 1,5 ml mikrosentrifugerør. Vortex brønn og inkuber på is.
  3. Plasser flyttbare 8 vel immunomodule strimler inn plastic mal holderen og sett den inn i mikroplateleser.
  4. Orient immunomodule strimler i mikroplateleser som: tom, tom, sample, tom, tom, sample, tomme, og tom fra venstre til høyre i malen holder å minimere lysspredning forstyrrelser fra sample-holdige strimler. Også bruke bare brønner 2-7 fra topp til bunn i hver 8 vel immunomodule stripe å minimere lysspredning forstyrrelser fra kantene av plast mal holderen.
  5. FV mikroplate analysen er i stand til å måle fibrin dannelse av blodpropper i minst 12 forskjellige prøver samtidig (6 prøver per immunomodule stripe over 2 immunomodule strimler).
  6. Slå på mikroplateleser og tilgang SoftMax Pro microplate programvare.
  7. Ved hjelp av en flerkanals pipette, foreta samtidige tilsetninger av FV-mangelfull plasma (50 pl) til alle prøven mikroplate brønner. Bruke en enkelt pipette, tilsett 50 pl av de 10 serielle fortynninger av NHP fremstilt ovenfor for å skille mikroplate brønnene.
  8. Ved hjelp av en flerkanals pipette, tilsett tromboplastin (50 ul) til alle sample brønner. Inkuber i mikroplateleser ved 25 ° C i 1 min og programmere mikroplateleser å riste platen under 15-25 sek i 1 min inkubering.
  9. Bruker datamaskinen tilkobles med mikroplateleser, tilgang SoftMax Pro mikroplate programmet. Still leseren til Absorberingsevne, Wavelength til 405nm, modus til Kinetic, temperatur til 25 ° C, og programmere mikroplateleser å riste for de første 5 sekunder etter kalsiumklorid tillegg, og måle absorbans ved 405nm hver 5 sek for 6 min etterpå. Den 5 sek risting intervall er ikke inkludert i de beregnede blodpropp ganger (se nedenfor).
  10. Ved hjelp av en flerkanals pipette, tilsett kalsiumklorid (50 ul på 25mm i destillert vann, endelig konsentrasjon 3,5 mm) til alle prøve mikroplate brønnene, vent 15 sek, trykker du på "Start"-ikonet i mikroplate programmet i SoftMax Pro fra datamaskinen for å starte analyse.
  11. Than blodpropp ganger regnes som tiden i sekunder på å nå midtpunktet mellom minimum og maksimum absorbans ved 405nm etter thromboplastin og kalsiumklorid tillegg.
  12. De første tallene for dannelse av blodpropper er beregnet som økningen i absorbans ved 405nm (mUnits / min) som omfatter de første 5 tidspunkter av dannelse av blodpropper i den lineære delen av Absorbans vs Tid kurve.
  13. Omfanget av koageldannelse ble beregnet som forskjellen mellom den maksimale og minimale absorbans ved 405nm (enheter) oppnådd under dannelse av blodpropper hendelsen.

4. Analysering Menneskelig plasmaprøver med FV 1-trinns og to-trinns Microplate koagulasjon Assay

  1. Tine FV-mangelfull plasma, NHP, sample plasmaer, og tromboplastintid ved 37 ° C i 10 min. Bland forsiktig FV-mangelfull plasma og tromboplastintid selvstendig, overføre å skille plast ELISA vaske skuffer og inkuber på is. Oppbevar NHP og prøve plasmaer på isetter forsiktig blanding. Butikk kalsiumklorid (25 mM i destillert vann) i en egen ELISA vask skuff ved romtemperatur.
  2. Forbered 200 pl hver av 40-fold fortynninger av NHP og prøve plasmaer i HBS, pH 7,4 ved hjelp av 1,5 ml mikrosentrifugerør. Vortex brønn og inkuber på is.
  3. Sett flyttbare 8 vel immunomodule strimler i plast mal holderen og sett inn mikroplateleser.
  4. Alternativ tom, tom, sample, tom, tom, sample, tomme, og tom immunomodule strimler fra venstre til høyre i malen holder å minimere lysspredning forstyrrelser fra sample-holdige strimler. Bruk kun brønner 2-7 fra topp til bunn i hver immunomodule stripe å minimere lysspredning forstyrrelser fra kantene av plast mal holderen.
  5. Slå på mikroplateleser og tilgang SoftMax Pro microplate programvare.
  6. Ved hjelp av en flerkanals pipette, legge FV-mangelfull plasma (50 pl) til alle prøven mikroplate brønner. Ved hjelp av en single pipette, tilsett 50 pl av 40-fold utvannet NHP eller sample plasmaer fremstilt ovenfor for å skille mikroplate brønnene.
  7. Ved hjelp av en flerkanals pipette, tilsett tromboplastin (50 ul) til alle sample brønner. Inkuber i mikroplateleser ved 25 ° C i 1 min og programmere mikroplateleser å riste platen under 15-25 sek i 1 min inkubering.
  8. Bruker datamaskinen tilkobles med mikroplateleser, tilgang SoftMax Pro mikroplate programmet. Still leseren til Absorberingsevne, Wavelength til 405nm, modus til Kinetic, temperatur til 25 ° C, og programmere mikroplateleser å riste for de første 5 sekunder etter kalsiumklorid tillegg, og måle absorbans ved 405nm hver 5 sek for 6 min etterpå. Den 5 sek risting intervall er ikke inkludert i de beregnede blodpropp ganger (se nedenfor).
  9. Ved hjelp av en flerkanals pipette, tilsett kalsiumklorid (50 ul av 25 mM i destillert vann; 6.25mM sluttkonsentrasjon) til alle prøven mikroplate brønnene og umiddelbart prESS "Start"-ikonet i mikroplate programmet i SoftMax Pro fra datamaskinen for å starte analysen.
  10. Ved slutten av kjøringen, bestemme tiden, innledende hastighet, og omfanget av koageldannelse for 40-fold fortynnet NHP og sample plasmaer fra absorbans mot tid profiler i SoftMax Pro.
  11. Tatt i betraktning den 40-fold fortynning, bruk blodpropp tid for hver prøve å beregne FV aktivitet i enheter / ml fra FV 1-trinns aktivitet standard kurve Logg Clot Tid vs Logg FV aktivitet (figur 2A). Dette representerer FV-1 trinn aktivitet eller at uten "tilsiktet" aktivering av trombin.
  12. Siden FV aktiveres med trombin til den aktive kofaktor, en FVA, en andre analysen etter tilsetning og inkubasjon med trombin kritisk å nøyaktig måle FV 2-trinns-aktivitet av en plasmaprøve (Med "tilsiktet 'aktivering ved tilsatt trombin).
  13. For FV 2-trinns metode, forberede 200-300 ul renset trombin 18 at 100nM i HBS, pH 7,4 og inkuber på is. Tenkt å bruke 10 ul av fortynnet trombin for hver plasmaprøve som skal analyseres med FV 2-trinns metode.
  14. Fortynn 120 pl av den ovenfor NHP og samplingsfrekvens plasmaer fra 40-fold til 100 ganger med 170 pl HBS, pH 7,4 inneholdende 2.8mm kalsiumklorid. Tilsett 10 pl trombin (10nm sluttkonsentrasjon) til hver prøve. Vortex godt for å blande og inkubere ved 37 ° C i 1 min.
  15. Fortynn NHP og sample plasmaer til 500 ganger ved tilsetning 400 ul HBS, pH 7,4, vortex godt, og analysen 50 ul av hver plasmaprøve i FV 1-trinns mikroplate analysen som beskrevet ovenfor.
  16. Bestem blodpropp tid for NHP og hver plasmaprøve analysert fra absorbansen vs Tid profiler i SoftMax Pro. Tatt i betraktning den 500-fold fortynning, bruk blodpropp tid for hver prøve å beregne FV 2-trinns aktivitet fra FV 1-trinns standard kurve Logg Clot Tid vs Logg FV aktivitet (figur 2A).
  17. Den totale FV aktiviteterty kan da beregnes som FV 2-trinns aktivitet - FV 1-trinns aktivitet.

Representative Results

Representant Resultater - Utarbeidelse av FV 1-trinns mikroplate koagulasjon analysen aktivitet standardkurver

Et representativt eksempel av fibrin dannelse av blodpropper i FV analysen over tid genereres av mikroplateleser er illustrert i Figur 1. FV analysen måler nøyaktig tid, første sats, og omfanget av fibrin dannelse av blodpropper. Inspeksjon av brønnene ved assay fullføring bekreftet at koageldannelse oppstått. Alle reaksjoner nådde omtrent samme grad av dannelse av blodpropper med en generell endring i absorbans ved 405nm av 0,35 til 0,45 enheter mellom start absorbansen før og maksimal absorbans etter thromboplastin og kalsiumklorid tillegg. Representative eksempler på FV 1-trinns aktivitet standardkurver fra Log Clot Tid (i sekunder) vs Logg FV Aktivitet (Enheter / ml) og logg Initial Valuta dannelse av blodpropper (i mUnits / min) vs Logg FV Aktivitet (Enheter / ml ) for serielle fortynninger av NHP er vist i figur 2B, henholdsvis. Montering av Log-log plot av Clot Tid vs FV 1-aktivitet indikerte en sterk sammenheng mellom disse variablene etter lineær regresjonsanalyse (Figur 2A, R 2 = 0,980). Montering av Log-log plott av den opprinnelige prisen av dannelse av blodpropper vs FV aktivitet også indikert en sterk sammenheng mellom disse variablene etter lineær regresjonsanalyse (Figur 2B, R 2 = 0,983). Forholdet av både Log Clot Tid og Logg Initial Valuta dannelse av blodpropper vs Log FV aktivitet forble lineær for NHP fortynnes opp til 512 ganger. Siden FV sirkulerer i NHP på ca 12-40nm 16, er mikroplate analysen følsom for ca 24-80pM FV i NHP. Gitt at dissosiasjonskonstanten av samspillet FVA-FXa-lipid i prothrombinase er ca 1nm 17, er FV mikroplate analysen helt egnet for måling av FV nivåer i fysiologisk relevant nm for FVA funksjon i prothrombinase.

Bruke FV mikroplate analysen ble det også bestemt at det normale utvalget av FV aktivitet i FV 1-trinns aktivitet analysen av 15 friske kontrollpersoner plasmaer (mannlige og kvinnelige, Alder 18-20 år) var (gjennomsnitt ± standardavvik, Range): 0,96 ± 0.14U/ml; 0.68-1.11U/ml. Dette stemmer godt med normal sunn FV aktivitet og område (0.66-1.14U/ml) rapportert av Cutler et al. for FV 1-trinns aktivitet bestemmes med en automatisert analysator 7. Intra-assay variabilitet av tiden, omfang og innledende hastighet på dannelse av blodpropper i FV 1-trinns metode i 6 brønner på 8 forskjellige dager var 3,4%, 4,4%, og 3,1%, respektivt. Den inter-assay variabilitet av tiden, omfang og innledende hastighet på dannelse av blodpropper i FV 1-trinns metode i 6 brønner 8 forskjellige eksperimenter på 8 forskjellige dager var 7,1%, 7,8%, og 9,2%, respektivt. Dermed intra-og inter-assay variasjon av disse tre måltrøde variabler var på et lavt og akseptabelt nivå for robust analyseytelsen innen og mellom microplate analysen av flere prøver samtidig (opp til 12).

Representant Resultater - analysere menneskelige plasmaprøver med FV 1-trinns og to-trinns mikroplate koagulasjon analysen

Standardkurven av Log Clot Tid vs Tilkopling FV Aktivitet (figur 2A) ble anvendt for å måle aktiviteten i FV NHP og 9 DIC pasientens plasmaer som ble ikke med vilje aktivert med tilsatt trombin (FV 1-trinns-aktivitet) eller med hensikt aktiveres med tilsatt trombin (FV 2-trinns-aktivitet), og resultatene er vist i tabell 1. Alle 9 DIC pasient plasmaer utstilt FV 1-trinns aktiviteter og innledende priser på dannelse av blodpropper som ble redusert i gjennomsnitt med 54% og 18%, henholdsvis fra NHP. De grad av dannelse av blodpropper i FV 1-trinns metode i DIC pasientene var ikke i stor grad forskjellig fra NHP, og økt gjennomsnittlig med 13% fra NHP.

Aktivering av NHP med trombin ble generert en omtrentlig 8 ganger økning i FV 2-trinns-aktivitet over FV 1-trinns-aktivitet (tabell 1). Dette indikerer at FV i NHP var hovedsakelig til stede i sin uaktivert form og er enig med de tidligere rapporterte resultater ved bruk av manuelle tilt-tube FV analyser 3, 4 og automatiserte FV analyser 5-7. FV 2-trinns og total aktivitet ble også redusert i DIC pasienter i gjennomsnitt, med 44% og 42%, henholdsvis fra NHP. De første prisene og omfang av dannelse av blodpropper i FV 2-trinns metode i DIC pasientene var ikke signifikant forskjellig fra NHP, og varierte i gjennomsnitt med ca 9% og 4%, henholdsvis fra det som er observert med NHP. Disse resultatene indikerer at sammenlignet med FV i NHP, FV i DIC pasientgrupper plasmaer resulterte i en forlenget tid, og redusert hastighet på fibrinkoagel formasjon og at pasienten FV var i gjennomsnitt bare 56% som aktiverbar med trombin samt.

ent "fo: keep-together.within-page =" always "> Figur 1
Figur 1. Proppdannelse i normal humane referanse plasma målt med den kinetiske mikroplate FV 1-trinns koagulasjon analysen. Fibrin dannelse av blodpropper i NHP ble kontinuerlig overvåket på 405nm ved hjelp av en kinetisk mikroplateleser. Plottet er mikroplateleser utgangen på en 6 min reaksjon av 32-fold fortynnet NHP, FV-mangelfull plasma, tromboplastintid, og kalsium-klorid i en mikroplate godt. Den vertikale aksen representerer endringen i absorbans ved 405nm som oppstod som følge av fibrindannelse i plasma. Tiden av fibrin formasjonen ble definert som tiden for å nå en halv maksimal økning i absorbans eller midtpunktet av kurven (36,40 sek). Den første rate av koageldannelse ble definert som frekvensen av forandring av absorbans ved 405nm over de første 5 tidspunkt på lineær økning av absorbansen delen av kurven (611,88 mUnits / min). Extelt koageldannelse ble definert som differansen mellom maksimal og minimal absorbans ved 405 nm (0,35 enheter).

Figur 2
Figur 2. Standardkurver av tid og innledende hastighet på koageldannelse vs Faktor V aktivitet i normale humane referanse plasma ved bruk FV 1-trinns mikroplate analysen. NHP ble seriefortynnet (0 - til 512-ganger i HBS) og analyseres med FV 1-trinns mikroplate assay som beskrevet i protokollen. Log-log plott av tiden og innledende hastighet på koageldannelse vs FV aktivitet i FV 1-trinns mikroplate analysen er vist etter lineær regresjonsmodellering av dataene i panelene A og B, henholdsvis.

1-trinns metode Initial Rate (mUnits / min)
Eksempel 1-trinns metode Aktivitet (enheter / ml) 1-trinns metode Omfang (Units) 2-trinns metode Aktivitet (enheter / ml) 2-trinns metode Omfang (Units) 2-trinns metode Initial Rate (mUnits / min) Total aktivitet (enheter / ml)
NHP 1,02 0.363 744,96 7,93 0.433 375,84 6,91
Pasient 1 0,36 0.404 583,80 3,84 0.432 249,96 3,48
Pasient 2. 0,67 0.416 704,04 5,28 0.469 323,16 4,61
0,31 0.435 562,08 3,92 0.453 294,96 3,61
Pasient 4 0,39 0.435 617,04 4,14 0.462 372,60 3,75
Pasient 5 0,73 0.401 641,40 5,91 0.433 354,24 5,18
Pasient 6 0,45 0.403 600,72 4,16 0.445 393,96 3,71
Pasient 7 0,49 0.395 575,40 4,89 0.449 357,48 4,40
Pasient 8 0,19 0.448 489,00 2,89 0.450 330,48 2,70
Pasient 9 0,64 0.423 699,48 5,11 0.455 417,24 4,47

Tabell 1 FV Aktiviteten i NHP og i 9 pasienter som utviklet Disseminert intravaskulær koagulasjon (DIC). Den FV 1-trinns, 2-trinns, og samlede aktiviteten i NHP og 9 DIC pasient plasmaer ble bestemt fra FV 1-trinns mikroplate analysen standard kurve av tid av koageldannelse g. FV aktivitet (figur 2A) og er gitt i enheter / ml. De første prisene (Initial økningen i A405nm i første fem tidspunkter i mUnits / min) og omfang (Maximum A405nm - Minimum A405nm) av dannelse av blodpropper i FV 1 - og 2-trinns mikroplate analysen er også vist.

Discussion

Den kinetiske mikroplate analysemetoden skisserer utviklingen av en ny, rask, billig og praktisk teknikk for måling av FV koagulasjon aktivitet i prøver av humant plasma, som har ikke (FV 1-trinns metode), eller har blitt bevisst aktivert med tilsatt trombin (FV 2-trinns metode). Analysen benytter en kinetisk mikroplateleser og alle materialer og reagenser som kreves er kommersielt tilgjengelige eller kan bli gjort i huset. Analysen overvåker kontinuerlig endring i lysspredningen av plasma under fibrinkoagel dannelse ved 405nm. Mikroplate analysen har fordelen av å bruke liten plasma prøvevolumer (ul), og er mottagelig for analyse av flere prøver samtidig (opp til 12). Disse analysebetingelser attributter er fordelaktig når dyrt utstyr og reagensene brukes (Automated analysatorer og Faktor-mangelfull plasmaer), bare små prøvevolumer er tilgjengelige (Pasient plasmaer) eller analysere et stort antall prøver (Under FV rensing trom plasma).

FV mikroplate analysen har de ekstra fordeler som det er praktisk, rask, og krever ikke at isolering og rensing av de nødvendige bestanddeler. Sammenlignet med manuell tilt-tube 3, 4 og automatiserte 5-7 FV analyser som har blitt rapportert, har FV mikroplate analysen sammenlignes rekke nyttige blodpropp ganger (25-75 sek) og tilsvarende FV nivåer i utvalget (0.5 til 0.005 enheter / ml), og følsomhet / deteksjonsgrense (20-80pM). Sammenlignet med manuelle tilt-tube FV analyser som lider en subjektiv visuell vurdering av koageldannelse 3, 4, tillater FV mikroplate analysen objektiv og kvantitativ måling av blodpropp tid første rate, og omfanget av fibrinkoagel formasjon. Sammenlignet med automatiserte FV analyser som lider fra kravet dyre analysatorer og reagenser 5-7, FV mikroplate analysereagensene og materialer er billig og alle nødvendige materialer kan være kjøpersed kommersielt eller gjort in-house. Manuell tilt-rør 3, 4 og 5-7 automatiserte FV analyser generelt bare gi tid for dannelse av blodpropper, ikke tiden, innledende hastighet, og omfanget av fibrinkoagel dannelse som alle nøyaktig målt spektrofotometrisk med FV mikroplate analysen. Endelig manuell tilt-røret 3,4 og automatisert 5-7 FV analyser lider bare å være i stand til å måle FV aktivitet i plasmaprøver en om gangen, mens FV mikroplate-analysen er mottagelig for høy gjennomstrømning og 12 prøver kan være analysert samtidig.

Mikroplate analysen ble brukt til å vise at FV i 9 DIC pasientgrupper plasmaer var mindre aktiv enn i NHP grunn av en kombinasjon av forsinkede blodpropp ganger og lavere innledende forekomst av dannelse av blodpropper i FV 1-trinns metode. De første tallene for dannelse av blodpropper i FV 2-trinns metode i DIC pasienten plasmaer ikke ble endret fra NHP. De grad av dannelse av blodpropper i DIC patient plasmaer var heller ikke endret fra NHP i FV 1-trinns og to-trinns-analyser. Redusert FV 1-trinns, 2-trinns, og samlede virksomhet kan ha vært på grunn av økt FV forbruk 19 og / eller inaktivering 6 i samsvar med andre studier i løpet av patogenesen av dette ervervet blodsykdom. Gitt omfanget av dannelse av blodpropper i DIC plasmaer var det samme som observert med NHP, var denne variabelen mest sannsynlig et resultat av fibrinogen konsentrasjon i FV-mangelfull plasma og ikke relatert til egenskapene pasienten plasmaer.

Resultatene fra mikroplate analysen indikerte at måling av FV aktivitet i prøver av humant plasma kan fås fra den tid og initiell hastighet på koageldannelse fra FV 1-trinns metode, og tidspunktet for dannelse av blodpropper og total aktivitet fra FV 2 - trinns metode. Det var ikke mulig å oppnå kvantitativ måling av FV aktivitet i en plasmaprøve basert på omfanget av koageldannelse i than FV 1 - og 2-trinns assays eller den første rate av dannelse av blodpropper i FV 2-trinns metode. Gitt alle reaksjoner nådde omtrent samme grad av dannelse av blodpropper av 0,35 til 0,45 enheter mellom den innledende absorbansen før og maksimal absorbans etter thromboplastin og kalsiumklorid dessuten ikke måling av utstrekningen av koageldannelse ikke gi en kvantitativ vurdering av FV aktivitet i en gitt plasmaprøve.

Romanen mikroplate analysen vil finne anvendelse i forskning og kliniske innstillinger for måling av FV aktivitet i prøver av humant plasma og fraksjoner under dets rensing fra human og animalsk plasma. Den mikroplate analysen kan brukes til å måle tiden, innledende hastighet, og omfanget av koageldannelse; parametre ikke generelt overvåkes samtidig i manuelle tilt-tube assays og automatiserte koagulasjon analysatorer. Denne informasjonen gir mer av en komplett kvantitativ vurdering av involvering av FV under dannelse av blodpropper hendelseni humant plasma enn har tidligere vært rapportert 3-7. Denne informasjonen er spesielt viktig i både forskning og kliniske laboratorier ved måling betydelige endringer i FV aktivitet i prøver av plasma eller med renset FV eller FVA. FV mikroplate analysen kan også bli brukt for å karakterisere og måle forbindelser som kan aktivere eller inaktivere FV og FVA, måle FV aktivitet hos pasienter med risiko for venøs trombose som følge av FV Leiden mutasjon 20, 21 og for å overvåke aktiviteten av FV under sin renselse fra plasma.

FV mikroplate-analysen er enkelt tilpasses for å måle aktiviteten i alle koagulasjonsfaktor i ytre, indre, eller felles vei med riktig faktor-mangelfull plasma og initiere reagenser for fibrindannelse. Analysen vil øke vår forståelse av FV biokjemi gjennom en mer nøyaktig og fullstendig måling av sin virksomhet innen forskning og kliniske laboratorier. Ultimately, vil denne informasjonen positivt påvirke helsevesenet gjennom tidligere diagnose og utvikling av mer effektive behandlinger for personer rammet med koagulasjonsforstyrrelser, for eksempel DIC.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Forskningen ble støttet med fagutvikling og forskning Oppstart midler fra University of Ontario Institute of Technology (UOIT) til Dr. John A. samer og en kanadiske Institutes of Health Research Health Professional Student Research Award til Irina Levit. Forfatterne erkjenner Shannon Everett (Undervisning og læring Centre, UOIT) for hennes assistanse forbereder videoen. Forfatterne erkjenner Dr. Michael E. Nesheim (Department of Biochemistry, Queens University, Kingston, ON) for sin mentor, innsikt og nyttige diskusjoner. Forfatterne erkjenner også Dr. Cheng Hock Toh (Roald Dahl Hemostase og Trombose Centre, Royal Liverpool University Hospital, Liverpool, UK) for å gi DIC pasienten plasmaer som brukes i studien.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Kinetic microplate reader Molecular Devices Spectra Max 190 SOFTmax PRO 4.3 LS software
Normal pooled human reference plasma Precision Biologicals CCN-10
Trisodium citrate Becton Dickenson B10242
EDTA Becton Dickenson B10093
FV-deficient human plasma4 Made from fresh human plasma and stored in aliquots at -70 °C.
3 and 60 ml syringes Becton Dickenson 309585 and 136898
Butterfly apparatus Vacutainer 367251 20 gauge
HEPES Sigma/Aldrich H-3375
NaCl Fisher BP358-212
Thromboplastin Trinity Biotech T1106 Dialyzed vs. HBS, pH 7.4 and stored in aliquots at -70 °C.
Calcium chloride Becton Dickenson B10070
Human thrombin15 From human plasma; stored at -20 °C in 50% (v/v) glycerol.
Dialysis membrane Fisher 21-152-6 6-8kDa molecular weight cutoff; 50mm x 3m.
Template holder and removable 8 well strips. Nunc 14-245-63 and 469957
ELISA washing trays BioRad 224-4872
1.5 ml microfuge and 15 ml screw capped tubes. Sarstedt 72690 and 62554205
Multichannel pipette Fisher 2703630 8 channel model.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Orfeo, T., Brufatto, N., Nesheim, M. E., Xu, H., Butenas, S., Mann, K. G. The factor V activation paradox. J. Biol. Chem. 279, 19580-19591 (2004).
  2. Bukys, M. A., Blum, M. A., Kim, P. Y., Brufatto, N., Nesheim, M. E., Kalafatis, M. Incorporation of factor Va into prothrombinase is required for coordinated cleavage of prothrombin by factor Xa. J. Biol. Chem. 280, 27393-273401 (2005).
  3. Nesheim, M. E., Katzmann, J. A., Tracy, P. B., Mann, K. G. Factor V. Methods. Enzymol. 80, 249-274 (1981).
  4. Bloom, J. W., Nesheim, M. E., Mann, K. G. A rapid technique for the preparation of factor V deficient plasma. Thromb. Res. 15, 595-599 (1979).
  5. Samis, J. A., Stewart, K. A., Nesheim, M. E., Taylor, F. B. Jr Factor V cleavage and inactivation are temporally associated with elevated elastase during experimental sepsis. J. Thromb. Haemost. 5, 2559-2561 (2007).
  6. Samis, J. A., Stewart, K. A., Toh, C. H., Day, A., Downey, C., Nesheim, M. E. Temporal changes in factors associated with neutrophil elastase and coagulation in intensive care patients with a biphasic waveform and disseminated intravascular coagulation. J. Thromb. Haemost. 2, 1535-1544 (2004).
  7. Cutler, J. A., Patel, R., Rangarajan, S., Tait, R. C., Mitchell, M. J. Molecular characterization of 11 novel mutations in patients with heterozygous and homozygous FV deficiency. Haemophilia. 16, 937-942 (2010).
  8. Ihara, M., Suzuki, T., Kobayashi, N., Goto, J., Ueda, H. Open-sandwich enzyme immunoassay for one-step noncompetitive detection of corticosteroid 11-deoxycortisol. Anal. Chem. 81, 8298-8304 (2009).
  9. Janke, R., Genzel, Y., Wahl, A., Reichl, U. Measurement of key metabolic enzyme activities in mammalian cells using rapid and sensitive microplate-based assays. Biotechnol. Bioeng. 107, 566-581 (2010).
  10. Beebe, D. P., Aronson, D. L. An automated fibrinolytic assay performed in microtiter plates. Thromb. Res. 47, 123-128 (1987).
  11. Frantantoni, J. C., Poindexter, B. J. Measuring platelet aggregation with microplate reader. A new technical approach to platelet aggregation studies. Am. J. Clin. Pathol. 94, 613-617 (1990).
  12. Pratt, C. W., Monroe, D. M. Microplate coagulation assays. Biotechniques. 13, 430-433 (1992).
  13. Tilley, D., Levit, I., Samis, J. A. Development of a microplate coagulation assay for Factor V in human plasma. Thromb. J. 9, 11-16 (2011).
  14. Toh, C. H., Downey, C. Back to the future: Testing in disseminated intravascular coagulation. Blood Coagul. Fibrinolysis. 16, 535-542 (2005).
  15. Spero, J. A., Lewis, J. H., Hasiba, U. Disseminated intravascular coagulation: Findings in 346 patients. Thromb. Haemost. 43, 28-33 (1980).
  16. Tracy, P. B., Eide, L. L., Bowie, E. J., Mann, K. G. Radioimmunoassay of factor V in human plasma and platelets. Blood. 60, 59-63 (1982).
  17. Krishnaswamy, S., Nesheim, M. E., Pryzdial, E. L. G., Mann, K. G. Assembly of prothrombinase complex. Meths. Enzymol. 222 (Part A), 261-280 (1993).
  18. Bajzar, L., Manuel, R., Nesheim, M. E. Purification and characterization of TAFI, a thrombin-activable fibrinolysis inhibitor. J. Biol. Chem. 270, 14477-14784 (1995).
  19. Mammen, E. F. Disseminated intravascular coagulation (DIC). Clin. Lab. Sci. 13, 239-2345 (2000).
  20. Dahlbäck, B., Carlsson, M., Svensson, P. J. Familial thrombophilia due to a previously unrecognized mechanism characterized by poor anticoagulant response to activated protein C: prediction of a cofactor to activated protein C. PNAS. 90, 1004-108 (1993).
  21. Dahlbäck, B. Advances in understanding pathogenic mechanisms of thrombophilic disorders. Blood. 112, 19-27 (2008).

Tags

Immunologi Faktor V Mikroplate koagulasjon analysen Human plasma Disseminert intravaskulær koagulasjon (DIC) blodpropp
Måling av Faktor V aktivitet i Human Plasma Ved hjelp av en Microplate koagulasjon Assay
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tilley, D., Levit, I., Samis, J. A.… More

Tilley, D., Levit, I., Samis, J. A. Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay. J. Vis. Exp. (67), e3822, doi:10.3791/3822 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter