Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Medição da actividade de factor V no plasma humano, utilizando um ensaio de coagulação de Microplacas

Published: September 9, 2012 doi: 10.3791/3822
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Applied Bioscience Program, Faculty of Science, University of Ontario Institute of Technology, 2Nursing Program, Faculty of Health Sciences, University of Ontario Institute of Technology, 3Medical Laboratory Science Program, Faculty of Health Sciences, University of Ontario Institute of Technology

Summary

Este estudo descreve um ensaio que mede a microplaca novel FV actividade de coagulação, durante a formação de coágulos de fibrina no plasma humano, que não havia sido descrita anteriormente. O método utiliza um leitor de microplacas cinético para medir continuamente a variação da absorvância a 405 nm durante a formação de coágulos de fibrina no plasma humano.

Abstract

Em resposta a uma lesão, a coagulação do sangue é activado e resulta na geração de protease de coagulação, a trombina. Trombina fibrinogênio em fibrina se unir, que forma um coágulo insolúvel que pára hemorragia. Factor V (FV), na sua forma activada, FVa, é um cofactor essencial para a protease FXa e um acelerador da produção de trombina durante a formação do coágulo de fibrina, como parte de protrombinase 1, 2. Ensaios manuais FV foram descritos 3, 4, mas eles são demorados e subjectiva. Ensaios automatizados FV foram relatados 5-7, mas o analisador e reagentes são caros e geralmente proporcionam apenas o tempo de coagulação, não a taxa e extensão da formação de fibrina. A plataforma de microplacas é preferido para medir catalisadas por enzimas eventos por causa da conveniência, custo, tempo, volume pequeno, a monitorização contínua, e de alto rendimento 8, 9. Os ensaios de microplacas foram relatados para a lise do coágulo 10, a agregação de plaquetas11, fatores de coagulação e 12, mas não para FV atividade no plasma humano. O objectivo do método consistia em desenvolver um ensaio que mede a actividade de microplacas durante FV formação de fibrina em plasma humano.

Este método de microplacas romance descreve um ensaio simples, barato e rápido de FV actividade em plasma humano. O ensaio utiliza um leitor de microplacas cinético a acompanhar a variação da absorvância a 405 nm durante a formação de fibrina em plasma humano (Figura 1) 13. O ensaio mede com precisão o tempo, a taxa inicial e a extensão de formação de coágulos de fibrina. Ele requer apenas quantidades mL de plasma, é completo em 6 min, tem alto rendimento, é sensível a 24 80pM FV, e mede a quantidade de ativado involuntariamente (1 fase-atividade) e trombina ativada FV (atividade 2 fases ) para obter uma avaliação completa de sua atividade funcional total (2 estágios atividade - uma fase de atividade).

Intravas disseminadascular de coagulação (DIC) é uma coagulopatia adquirida que mais freqüentemente se desenvolve a partir de infecções pré-existentes 14. DIC está associado a um prognóstico pobre e mortalidade aumenta acima da patologia pré-existente 15. O ensaio foi utilizado para demonstrar que em 9 pacientes com DIC, o FV 1 estágio, de 2 fases, e as actividades totais foram reduzidas, em média, em 54%, 44% e 42%, respectivamente, em comparação com o normal humano reunido referência plasma (PNC).

A FV ensaio microplaca é facilmente adaptável para medir a atividade de qualquer fator de coagulação. Este ensaio vai aumentar a nossa compreensão do FV bioquímica através de uma medição mais precisa e completa da sua actividade em pesquisa e na clínica. Esta informação irá impactar positivamente os ambientes de cuidados de saúde através de diagnóstico precoce e desenvolvimento de tratamentos mais eficazes para os transtornos de coagulação, como o DIC.

Protocol

1. Preparação de FV-deficient Plasma Humano

  1. Este método é uma modificação do procedimento inicialmente descrito por Bloom et al 4.
  2. Obter sangue humano de um voluntário adulto consentindo saudável (masculino ou feminino, idade 18 - 50 anos) que não está tomando qualquer medicação. Usar luvas de látex e uma bata de laboratório durante todo o procedimento.
  3. Preparação de 100 ml de 3,2% (w / v) de citrato trissódico em água destilada. Carregar 6,0 ml desta solução para seringas de 60 ml separados. Remover o ar de premir o êmbolo com cuidado para a marca de 6,0 ml na seringa.
  4. Use um algodão embebido em álcool para limpar a área da veia cubital entre bíceps e antebraço. Liga-20 aparelho de borboleta de calibre para uma seringa de 3 ml. Inserir a agulha na veia cubital borboleta e desenhar suavemente sobre êmbolo até que o sangue enche a marca de 3 ml. Descartar seringa com sangue. Esta etapa é realizada para remover qualquer factor tecidular libertado do endotélio danificado na agulhalocal da lesão que podem activar o processo de coagulação e interferir com a preparação de FV plasma deficiente.
  5. Liga-agulha de borboleta de 60 ml da seringa 6,0 ml 'carregado' com citrato trissódico e extrair suavemente o êmbolo até que o sangue chega à marca de 60 ml da seringa. (A concentração final de citrato de 10,9 mm).
  6. Retire a seringa de agulha borboleta e misture delicadamente seringa, mantendo um dedo enluvado ou o polegar na saída seringa.
  7. Continuar a retirada de sangue em seringas de 60 ml cada uma cheia com 6,0 ml de 3,2% de citrato trissódico, como descrito acima. Deve-se antecipar a recuperação de aproximadamente 50% do volume de sangue citrado como plasma após centrifugação e que 50 ul de plasma deficiente em FV é necessária por amostra no ensaio de microplaca. O nosso laboratório de rotina processa 300-420 ml de sangue citrado de cada vez usando 5-7 x seringas de 60 ml, cada um com 6,0 ml de 3,2% de citrato trissódico / seringa. Trata-se de plasma deficiente em FV suficiente para, aproximadamente, 3.000 microensaios de placa (veja abaixo).
  8. Remova a agulha borboleta do braço voluntário e pressione uma compressa de gaze estéril sobre local de punção de veia para 1,0 min. Cubra local da punção da veia com uma gaze esterilizada.
  9. Centrifugar o sangue citrado a 3300 xg durante 20 min à temperatura ambiente. Recuperar camada de plasma superior amarela para um copo de plástico com uma barra de agitação com uma pipeta transferidora de plástico tendo o cuidado de não perturbar a camada inferior de células vermelhas e brancas do sangue.
  10. De volume de plasma medida em ml e reter 100 ul de plasma EDTA antes de adição em gelo, durante o tempo de protrombina futuro coágulo (PT) de teste (ver abaixo).
  11. Lentamente, adicionar EDTA sólido de plasma citratado, com agitação suave à temperatura ambiente para alcançar a 5 mM (concentração final). Uma vez que o EDTA tem dissolvido, ajustar o pH a 7,0 por adição gota a gota de NaOH a 1,0 M, com agitação suave.
  12. Cobrir copo com Saran Wrap e incubar durante 8-10 horas sem agitação, a 37 ° C.
  13. Cada 2 horas, 100 ul de recuperaro plasma tratado com EDTA em gelo e determinar a PT, no momento da incubação com EDTA e comparar com o PT do plasma antes da adição de EDTA (ver acima).
  14. Para as determinações da PT, lugar removíveis 8 tiras immunomodule bem no suporte modelo de plástico e inserir em um leitor de microplacas.
  15. Tiras immunomodule orientar em um leitor de microplacas como: vazio, amostra, vazio, vazio, de amostra, vazio, vazio, vazio e da esquerda para a direita, o titular de modelo para minimizar a interferência de dispersão de luz da vizinha amostra contendo tiras. Além disso, utilizar apenas poços 2-7 de cima para baixo, em cada tira de 8 immunomodule bem para minimizar a interferência de dispersão de luz a partir das bordas de suporte de molde de plástico.
  16. O ensaio de microplacas FV é capaz de medir a formação de coágulos de fibrina em, pelo menos, 12 amostras diferentes simultaneamente (6 amostras por tira immunomodule mais de duas tiras immunomodule).
  17. Utilizando uma pipeta de canais múltiplos, adicionar 50 ul de HBS (HEPES 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4) paracada microplaca para cada uma das amostras a serem ensaiadas. Usando uma pipeta único, adicionar 50 ul de humano normal reunido referência plasma (NHP) ou de plasma, antes da adição de EDTA ou de vários tempos de incubação após a adição de EDTA para separar os poços.
  18. Utilizando uma pipeta de canais múltiplos, adicionar 50 ul de tromboplastina (Ver abaixo para o método de preparação) a todos os poços da microplaca com plasma a ser testado. Incubar em um leitor de microplacas a 25 ° C durante 1 min e um programa de o leitor de microplacas para agitar a placa, durante o segundo 15-25 da incubação de 1 min.
  19. Usar o computador com interface com o leitor de microplacas, acesso SoftMax Pro software de aplicação de placa. Definir o leitor a absorvância, a 405 nm de comprimento de onda, de modo a temperatura, a cinética a 25 ° C, e o programa de leitor de microplacas a agitar durante 5 seg, e ler a absorvância a 405 nm cada 5 segundos durante 6 min.
  20. Utilizando uma pipeta de canais múltiplos, adicionar cloreto de cálcio (50 ul de 25 mM em água destilada, 2,1 mm finaconcentração l) a todos os poços, aguarde 15 segundos e pressione o botão 'Iniciar' ícone no menu de microplacas Pro SoftMax para começar o ensaio.
  21. Determinar a partir de PTs os perfis de absorvância versus Tempo em SoftMax Pro como o tempo para atingir o aumento de meia máximo de absorvância a 405 nm (o ponto médio da absorvência em função da curva sigmoidal Tempo de tromboplastina e produzido após adição de cloreto de cálcio. Ver abaixo, Figura 1).
  22. Calcula-se a actividade de FV 1 estágio do tempo de coagulação Log (sec) Log vs Actividade FV (Unidades / ml), conforme ilustrado a seguir na Figura 2A. Para fins de quantificação, 1 unidade de actividade de FV é definida como a actividade presente em 1,0 ml NHP antes da activação intencional com trombina adicionada (Ver abaixo, ensaio amostras de plasma humano com a FV 1 estágio e de 2 fases do ensaio de coagulação de microplaca).
  23. Prepare 4.0L de HEPES 20 mM contendo NaCl 0,15 M em água destilada, com agitação suave. Ajustar o pH a 7,4 com dropw lentoise adição de NaOH 5,0 M (HBS, pH 7,4).
  24. Obter um comprimento suficiente de tubo de diálise e enxaguar com água destilada. Dê um nó em uma das extremidades do tubo. Transferência de EDTA tratadas plasma para tubo de diálise com uma pipeta transferidora de plástico, retirar o ar, e um nó na outra extremidade do tubo.
  25. Cuidadosamente pendurar o plasma tratado com EDTA na tubulação na HBS com agitação suave. Cubra com Saran Wrap e dializar durante 14-16h com agitação suave a 4 ° C.
  26. Remova cuidadosamente o plasma EDTA-treated/dialyzed em 3,0 ml alíquotas de 15,0 ml tubos parafuso nivelado e reter 100 ul para a PT ensaio da 'final' FV plasma deficiente no gelo. Armazenar o plasma deficiente em FV-se a -80 ° C até à sua utilização. Sob as condições descritas acima, o aumento PTs 10-15 seg antes EDTA Além 90-100 seg 8-10 horas após a adição de EDTA. O plasma deficiente em FV preparado por este método contém habitualmente menos do que 0,1% do presente FV activo no inícioplasma humano fresco.

2. Preparação de Tromboplastina

  1. A diálise é requerida para remover qualquer reagente de cálcio a partir desta, a fim de permitir a formação de coágulos com precisão de temporização de fibrina a partir do tempo de adição de cloreto de cálcio para iniciar o processo de coagulação.
  2. Preparação de 100 ml e 4.0L de HEPES 20 mM e NaCl a 0,15 M em água destilada num copo de plástico com agitação suave. Ajustar o pH a 7,4 com adição gota a gota lenta de NaOH 5,0 M (HBS, pH 7,4).
  3. Adicionar 6,0 ml de HBS, pH 7,4, para cada frasco de reagente de tromboplastina, substituir a tampa, e agitar suavemente para dissolver. Incubar em frascos de reagente niveladas durante 15 min à temperatura ambiente para dissolver o material seco. Agitar suavemente para dissolver completamente.
  4. Corte um comprimento suficiente de tubo de diálise, lavar bem com água destilada, e amarrar uma extremidade do tubo com um nó. Transferência de tromboplastina para tubos de diálise, retirar o ar, e amarrar outra extremidade do tubo com um nó.
  5. Carefully pendurar tubos de diálise em 4.0L de HBS, pH 7,4, e agitar suavemente coberta com Saran Wrap, a 4 ° C durante 14-16 hr.
  6. Transferir alíquotas de 3,0 ml da tromboplastina dialisado para tubos de 15 ml com tampa roscada e armazenar a -80 ° C até ser usado.

3. Preparação de um estágio FV-microplaca de Coagulação ensaio padrão curvas de atividade

  1. Descongelar FV plasma deficiente, NHP, e de tromboplastina, a 37 ° C durante 10 min. Misturar suavemente FV-deficient plasma tromboplastina e independentemente, transferir para separar bandejas de plástico de lavagem, e incubar em gelo. Guarde o PHN no gelo após misturando suavemente. Cloreto de armazenamento de cálcio (25 mM em água destilada) numa bandeja de lavagem separado, à temperatura ambiente.
  2. Preparar 200 uL cada uma das duas diluições em série de NHP, de 0 -, 2 -, 4 -, 8 -, 16 -, 32 -, 64 -, 128 -, 256 -, 512 vezes em HBS, pH 7,4 usando 1,5 tubos de microcentrífuga ml. Vortex poço e incubar em gelo.
  3. Colocar 8 tiras removíveis immunomodule bem em ptitular modelo lastic e inserir em um leitor de microplacas.
  4. Tiras immunomodule orientar em um leitor de microplacas como: vazio, amostra, vazio, vazio, de amostra, vazio, vazio, vazio e da esquerda para a direita, o titular de modelo para minimizar a interferência de dispersão de luz da vizinha amostra contendo tiras. Além disso, utilizar apenas poços 2-7 de cima para baixo, em cada tira de 8 immunomodule bem para minimizar a interferência de dispersão de luz a partir das bordas de suporte de molde de plástico.
  5. O ensaio de microplacas FV é capaz de medir a formação de coágulos de fibrina em, pelo menos, 12 amostras diferentes simultaneamente (6 amostras por tira immunomodule mais de duas tiras immunomodule).
  6. Ligue um leitor de microplacas e SoftMax acesso Pro software de aplicação de placa.
  7. Utilizando uma pipeta de canais múltiplos, fazer adições simultâneas de FV plasma deficiente (50 ul) a todos os poços de amostra. Usar uma pipeta único, adicionar 50 ul de diluições seriadas de 10 NHP preparados acima para separar os poços.
  8. Utilizando uma pipeta multicanal, adicione tromboplastina (50 ul) a todos os poços de amostra. Incubar no leitor de microplacas a 25 ° C durante 1 min e um programa de o leitor de microplacas para agitar a placa, durante o segundo 15-25 da incubação de 1 min.
  9. Usar o computador com interface com o leitor de microplacas, acesso SoftMax Pro software de aplicação de placa. Definir o leitor a absorvância, a 405 nm de comprimento de onda, de modo a temperatura, a cinética a 25 ° C, e o programa de leitor de microplacas a agitar durante os primeiros 5 segundos após a adição de cloreto de cálcio, e a absorvância medida a 405 nm cada 5 segundos durante 6 minutos depois. O intervalo de 5 segundos agitação não está incluído nos tempos de coagulação calculados (ver abaixo).
  10. Utilizando uma pipeta multicanal, adicione cloreto de cálcio (50 ul de 25 mM em água destilada; concentração final 3,5 mM) para toda a amostra poços, espere 15 segundos, pressione "Iniciar" ícone na aplicação de microplacas em SoftMax Pro de computador para começar a ensaio.
  11. Tele vezes coágulo são calculados como o tempo, em segundos, para atingir o ponto médio entre o mínimo e máximo de absorvância a 405 nm após a adição de tromboplastina e cloreto de cálcio.
  12. As taxas iniciais de formação de coágulo são calculadas como a taxa de aumento da absorvância a 405 nm (mUnits / min), que abrangem os primeiros 5 pontos de tempo de formação do coágulo na porção linear da curva de absorvência versus tempo.
  13. A extensão da formação do coágulo foi calculado como a diferença entre a absorvância máxima a 405 nm e um mínimo (Unidades) alcançada durante o evento a formação do coágulo.

4. Analisando amostras de plasma humano com a FV 1 estágio e 2 estágios Ensaio de coagulação Microplaca

  1. Descongelar FV plasma deficiente, NHP, plasmas de exemplo e de tromboplastina, a 37 ° C durante 10 min. Misturar suavemente FV-deficient plasma tromboplastina e independentemente, transferir para separar bandejas de plástico de lavagem de ELISA, e incubar em gelo. Armazenar os plasmas NHP e amostra no gelodepois misturando suavemente. Cloreto de armazenamento de cálcio (25 mM em água destilada) num tabuleiro separado de lavagem ELISA, à temperatura ambiente.
  2. Preparar 200 ul cada um de 40 diluições da amostra e NHP plasmas de HBS, pH 7,4 usando 1,5 ml tubos de microcentrífuga. Vortex poço e incubar em gelo.
  3. Insira removíveis 8 tiras immunomodule bem no suporte modelo de plástico e inserir em um leitor de microplacas.
  4. Suplente vazio, vazio, amostra, vazio, amostra, vazio, vazio, vazio e tiras immunomodule da esquerda para a direita no porta-modelo para minimizar a interferência de dispersão de luz da vizinha amostra contendo tiras. Utilizar apenas poços 2-7 de cima para baixo, em cada tira de immunomodule para minimizar a interferência de dispersão de luz a partir das bordas de suporte de molde de plástico.
  5. Ligue um leitor de microplacas e SoftMax acesso Pro software de aplicação de placa.
  6. Utilizando uma pipeta multicanal, adicione FV-deficient plasma (50 uL) a todos os poços de amostra. Usando um single pipeta, adicionar 50 ul de 40 vezes NHP diluído ou plasmas de amostra anteriormente preparada para separar os poços.
  7. Utilizando uma pipeta multicanal, adicione tromboplastina (50 ul) a todos os poços de amostra. Incubar no leitor de microplacas a 25 ° C durante 1 min e um programa de o leitor de microplacas para agitar a placa, durante o segundo 15-25 da incubação de 1 min.
  8. Usar o computador com interface com o leitor de microplacas, acesso SoftMax Pro software de aplicação de placa. Definir o leitor a absorvância, a 405 nm de comprimento de onda, de modo a temperatura, a cinética a 25 ° C, e o programa de leitor de microplacas a agitar durante os primeiros 5 segundos após a adição de cloreto de cálcio, e a absorvância medida a 405 nm cada 5 segundos durante 6 minutos depois. O intervalo de 5 segundos agitação não está incluído nos tempos de coagulação calculados (ver abaixo).
  9. Utilizando uma pipeta de canais múltiplos, adicionar cloreto de cálcio (50 ul de 25 mM em água destilada, concentração final 6.25mM) para todos os poços de amostra e imediatamente prEss 'Iniciar' ícone na aplicação de microplacas em SoftMax Pro de computador para começar o ensaio.
  10. No final da corrida, determinar o tempo, a taxa inicial e a extensão de formação de coágulo de 40 vezes NHP diluído e plasmas de amostra a partir dos perfis de absorvência em função do tempo em SoftMax Pro.
  11. Tendo em conta a diluição de 40 vezes, usar o tempo de coagulação para cada amostra para calcular a actividade de FV em Unidades / ml a partir do FV 1 estágio curva padrão de actividade Tempo Clot Log vs Actividade Log FV (Figura 2A). Isso representa a atividade FV-1 fase ou que sem ativação "intencional" pela trombina.
  12. Desde FV é ativado com trombina para o co-fator ativo, FVa 1, um segundo ensaio, após a adição e incubação com trombina é fundamental para medir com precisão a atividade FV 2 estágios de uma amostra de plasma (Com ativação "intencional" pela trombina adicionada).
  13. Para o ensaio de FV de 2 fases, prepara 200-300 ul de trombina purificada 18 at 100 nM em HBS, pH 7,4 e incuba-se em gelo. Plano para usar 10 ul de trombina diluída para cada amostra de plasma para ser testada com o ensaio de FV de 2 fases.
  14. Diluir 120 ul do PNS acima e plasmas de amostra de 40 vezes a 100 vezes com 170 ul de HBS, pH 7,4, contendo cloreto de cálcio 2,8 mm. Adicionar 10 ul de trombina (10 nM de concentração final) para cada amostra. Vortex para misturar bem e incubar a 37 ° C durante 1 min.
  15. Diluir NHP e plasmas de amostra a 500 vezes por adição de 400 ul de HBS, pH 7,4, bem vórtice, e ensaio 50 uL de cada amostra de plasma no FV 1 pré-ensaio de microplacas, como descrito acima.
  16. Determine o tempo de coagulação para PNS e cada uma das amostras de plasma testadas a partir dos perfis de absorvância versus Tempo em SoftMax Pro. Tendo em conta a diluição de 500 vezes, usar o tempo de coagulação para cada amostra para calcular a FV de 2 fases a partir da actividade de FV 1-fase curva padrão do tempo de infiltração versus Log Activity Log FV (Figura 2A).
  17. O total FV atividadesty pode então ser calculado como FV atividade de 2 fases - FV actividade um palco.

Representative Results

Resultados representativos - Preparação de FV de 1 estágio de microplacas de coagulação do ensaio curvas padrão de atividade

Um exemplo representativo de formação do coágulo de fibrina no ensaio ao longo do tempo FV gerado pelo leitor de microplacas é ilustrado na Figura 1. O ensaio de FV com precisão mede o tempo, a taxa inicial e a extensão de formação de coágulos de fibrina. A inspecção dos poços após a conclusão do ensaio confirma que a formação de coágulo ocorreu. Todas as reacções atingiram aproximadamente o mesmo grau de formação de coágulo com uma mudança geral da absorvância a 405 nm de 0,35-0,45 Unidades de absorvância entre o início antes e após a absorção máxima de tromboplastina e adição de cloreto de cálcio. Exemplos representativos de FV de 1 estágio curvas de atividade padrão de tempo Clot Log (em segundos) vs log de atividade FV (Unidades / ml) e log taxa inicial de formação de coágulos (em mUnits / min) versus Log Atividade FV (Unidades / ml ) por diluições em série de NHP é mostrado na Figura 2B, respectivamente. Montagem da trama Log-Log do Tempo Clot vs FV 1-Atividade indicou uma forte relação entre essas variáveis ​​após a análise de regressão linear (Figura 2A, R 2 = 0,980). Montagem da trama Log-Log da taxa inicial de formação de coágulo de Actividade vs FV também indicaram uma forte relação entre estas variáveis ​​após a análise de regressão linear (Figura 2B; R 2 = 0,983). A relação de ambos tempo de coagulação e Log Log taxa inicial de formação de coágulos vs Atividade Log FV permaneceu linear para NHP diluído até 512 vezes. Desde FV circula no PHN em aproximadamente 12-40 nM 16, o ensaio de microplacas é sensível a aproximadamente 24 80pM FV no PNS. Uma vez que a constante de dissociação da interacção de FVa-FXa em lípidos protrombinase é de cerca de 1 nM 17, o ensaio de microplacas FV é inteiramente apropriado para a medição dos níveis de FV na fisiologicamente relevant gama nM para FVa em função da protrombinase.

Usando o ensaio de microplacas FV, ​​também foi determinado que a faixa normal de FV atividade no ensaio de atividade FV um estágio de 15 plasmas controle saudáveis ​​(Masculino e Feminino, Idade 18-20yrs) foi (média ± desvio padrão; Range): 0,96 ± 0.14U/ml; 0.68-1.11U/ml. Isto concorda bem com a actividade normal, saudável e FV intervalo (0.66-1.14U/ml) relatado por Cutler et al. para o FV 1 estágio actividade determinada com um analisador automático 7. A variabilidade intra-ensaio do tempo de medida, e velocidade inicial de formação de coágulos no ensaio de FV 1 estágio de seis poços ao longo de 8 dias diferentes foi de 3,4%, 4,4% e 3,1%, respectivamente. A variabilidade inter-ensaio do tempo de medida, e velocidade inicial de formação de coágulos no ensaio de FV 1 estágio em 6 poços de 8 experiências diferentes em oito dias diferentes foi de 7,1%, 7,8% e 9,2%, respectivamente. Assim, a variabilidade intra-e inter-ensaio destes três Measuvariáveis ​​vermelho foi a um nível baixo e aceitável para o desempenho do ensaio robusto dentro e entre as microplacas ensaio de múltiplas amostras em simultâneo (até 12).

Resultados representativos - ensaios amostras de plasma humano com a FV 1 estágio e 2 estágios ensaio de coagulação microplaca

A curva padrão de Log vs Actividade Tempo Clot Log FV (Figura 2A) foi utilizado para medir a actividade de FV em NHP e 9 plasmas de doentes DIC, que não foram intencionalmente activado com adição de trombina (FV 1 pré-actividade), ou foram activadas com intencionalmente adicionada trombina (FV 2 fases de actividade) e os resultados são mostrados na Tabela 1. Todos os 9 plasmas de doentes exibiram DIC FV 1 estágio actividades e as taxas iniciais de formação de coágulos, que foram reduzidos em média, em 54% e 18%, respectivamente, a partir de PHN. As extensões de formação de coágulos no ensaio de FV 1 estágio nos pacientes DIC não foram largamente diferente da NHP, e aumentaram, em média, em 13% a partir de PHN.

Activação da trombina com NHP gerou um aumento de 8 vezes em FV aproximado de 2 fases actividade acima da actividade FV 1 estágio (Tabela 1). Isso indica que a FV em PNC foi presente principalmente em sua forma inactivada e concorda com os resultados previamente relatados com manuais ensaios de inclinação do tubo-FV 3, 4 e testes automatizados FV 5-7. A FV-2 fases e actividade total foram também diminuídos nos pacientes DIC, em média, em 44% e 42%, respectivamente, a partir de PHN. As taxas iniciais e extensões de formação de coágulos no FV de 2 fases de ensaio nos pacientes DIC não foram significativamente diferentes do PNS, e variou em média, por cerca de 9 e% 4%, respectivamente, do que a observada com NHP. Estes resultados indicaram que, em comparação com o FV em NHP, o FV nos plasmas de pacientes DIC resultaram em um período de tempo prolongado e diminuição da taxa de formação do coágulo de fibrina, e que o paciente FV foi, em média, apenas 56% como activável com trombina também.

ent "fo: manter-together.within-page =" always "> Figura 1
Figura 1. Formação do coágulo no plasma de referência normal humano reunido medido com a cinética de microplacas FV 1 pré-ensaio de coagulação. Formação de fibrina no coágulo NHP foi continuamente monitorizado a 405 nm usando um leitor de microplacas cinético. A trama é a saída do leitor de microplacas de uma reacção de 6 min 32 vezes NHP diluído, FV plasma deficiente, de tromboplastina, e cloreto de cálcio em uma microplaca. O eixo vertical representa a alteração da absorvância a 405 nm que ocorreram como resultado da formação de fibrina no plasma. O tempo de formação de fibrina foi definido como o tempo necessário para atingir o aumento da absorvância máxima meia ou o ponto central da curva (36,40 seg.) A velocidade inicial de formação do coágulo foi definida como a taxa de variação da absorvância a 405 nm ao longo dos primeiros 5 pontos de tempo do aumento da porção linear da curva de absorção (611,88 mUnits / min). O extenda de formação de coágulo foi definida como a diferença entre a absorção máxima e mínima a 405 nm (0,35 unidades).

Figura 2
Figura 2. Curvas padrão de tempo e velocidade inicial de formação do coágulo vs actividade do Factor V no plasma de referência normal humano reunido utilizando o FV 1 pré-ensaio de microplaca. NHP foi diluída em série (0 - e 512 vezes em HBS) e analisados ​​com o FV 1 estágio ensaio de microplacas, conforme descrito no protocolo. Log-Log tramas do tempo e velocidade inicial de formação do coágulo vs actividade FV no FV 1 estágio ensaio de microplacas são apresentados após a modelagem de regressão linear dos dados nos painéis A e B, respectivamente.

ensaio de 1 estágio Taxa inicial (mUnits / min)
Amostra 1 estágio Actividade ensaio (Unidades / ml) 1 estágio Extensão ensaio (unidades) 2 fases Actividade ensaio (Unidades / ml) 2 estágios Extensão ensaio (unidades) 2 estágios Taxa de ensaio inicial (mUnits / min) A actividade total (Unidades / ml)
PHN 1,02 0,363 744,96 7,93 0,433 375,84 6,91
Paciente 1 0,36 0,404 583,80 3,84 0,432 249,96 3,48
Paciente 2 0,67 0,416 704,04 5,28 0,469 323,16 4,61
0,31 0,435 562,08 3,92 0,453 294,96 3,61
Paciente 4 0,39 0,435 617,04 4,14 0,462 372,60 3,75
Paciente 5 0,73 0,401 641,40 5,91 0,433 354,24 5,18
O paciente 6 0,45 0,403 600,72 4,16 0,445 393,96 3,71
Paciente 7 0,49 0,395 575,40 4,89 0,449 357,48 4,40
Paciente 8 0,19 0,448 489,00 2,89 0,450 330,48 2,70
Paciente 9 0,64 0,423 699,48 5,11 0,455 417,24 4,47

Tabela 1 Atividade FV em PNC e em 9 pacientes que desenvolveram a coagulação intravascular disseminada (DIC). FV O 1 estágio, 2 estágios, e atividade total no PNS e 9 plasmas paciente DIC foram determinados a partir da FV um estágio ensaio microplaca padrão curva de tempo de formação do coágulo vs FV atividade (Figura 2A) e são apresentados em Unidades / ml. As taxas iniciais (taxa inicial de aumento da A405nm durante cinco primeiros pontos de tempo em mUnits / min) e extensões (A405nm máxima - A40 Mínimo5nm) de formação de coágulos no FV 1 - e 2-stage ensaio de microplacas são também mostradas.

Discussion

O método de ensaio cinético de microplacas descreve o desenvolvimento de um romance, técnica rápida, barata e conveniente para a medição da actividade de coagulação FV em amostras de plasma humano, que não têm (FV 1 pré-ensaio) ou que tenham sido intencionalmente activado com adição de trombina (FV 2 fases de ensaio). O ensaio utiliza um leitor de microplacas cinético e todos os materiais e reagentes necessários estão disponíveis comercialmente ou podem ser feitas em casa. O ensaio continuamente monitoriza a mudança na dispersão de luz de plasma durante a formação do coágulo de fibrina a 405 nm. O ensaio de microplacas tem a vantagem da utilização de volumes de plasma pequenas amostras (ul) e é receptivo para a análise de múltiplas amostras em simultâneo (até 12). Estes atributos do ensaio são vantajosos quando o equipamento caro e os reagentes são utilizados (analisadores automáticos e Factor de plasmas deficientes), apenas pequenos volumes de amostras estão disponíveis (plasmas de pacientes) ou análise de um grande número de amostras (Durante FV f purificaçãorom plasma).

O ensaio de microplacas FV tem as vantagens adicionadas que é conveniente, rápida, e não requer o isolamento e purificação dos componentes constituintes necessários. Comparado com inclinação manual de tubo 3, 4 e automatizados ensaios 5-7 FV que têm sido relatados, a FV ensaio microplaca tem alcance útil comparável de vezes coágulo (25-75 seg) e os níveis correspondentes FV na amostra (0,5-0,005 Unidades / ml), e a sensibilidade de detecção / limites (20 80pM). Em comparação com os ensaios manuais de inclinação do tubo-FV que sofrem de uma avaliação subjectiva visual de formação de coágulo de 3, 4, o ensaio de microplacas FV permite a medição objectiva e quantitativa do tempo de coagulação, a taxa inicial e a extensão de formação de coágulos de fibrina. Em comparação com os ensaios automatizados FV que sofrem da condição de analisadores caros e reagentes 5-7, os reagentes de ensaio de microplacas FV e materiais são de baixo custo e de todos os materiais necessários podem ser purchased comercialmente ou feitas em casa. Inclinação manual de tubo 3, 4 e ensaios automatizados 5-7 FV geralmente fornecem apenas o tempo para a formação do coágulo; não o tempo, a taxa inicial e a extensão de formação do coágulo de fibrina, que são todos medidos com precisão espectrofotometricamente com o ensaio de microplacas FV. Finalmente, inclinação manual tubo de 3,4 e automatizado ensaios 5-7 FV sofrem de só ser capaz de medir a atividade FV em amostras de plasma, um por vez, e que a FV ensaio microplaca é passível de alto rendimento e 12 amostras podem ser ensaiados simultaneamente.

O ensaio de microplaca foi usado para demonstrar que o FV em 9 plasmas de doentes DIC foi menos activo do que em NHP devido a uma combinação de tempos de coagulação retardada e menores taxas iniciais de formação de coágulos no ensaio de FV 1 estágio. As taxas iniciais de formação de coágulos no ensaio FV 2 fases nos plasmas de pacientes DIC não foram alteradas a partir de PHN. As extensões de formação de coágulos no patien DICt plasmas também não foram alteradas a partir de NHP no FV 1 estágio e dois estágios ensaios. Diminuição FV 1 estágio, 2 estágios e atividades totais pode ter sido devido ao consumo de FV aumento 19 e / ou inativação 6, de acordo com outros estudos durante a patogênese desta doença do sangue adquirido. Dada a extensão da formação de coágulos nos plasmas DIC foi igual ao observado com PNS, esta variável foi provavelmente uma consequência da concentração de fibrinogénio no plasma deficiente em FV e não relacionada com as características dos plasmas de pacientes.

Os resultados do ensaio indicaram que a microplaca de medição da actividade de FV em amostras de plasma humano podem ser obtidos a partir da taxa inicial e o tempo de formação de coágulos a partir do ensaio de FV 1 estágio e o tempo de formação do coágulo e a actividade total da FV 2 - ensaio de fase. Não foi possível obter a medição quantitativa da actividade de FV em uma amostra de plasma com base no grau de formação de coágulos em tele FV 1 - e 2-stage ensaios ou a taxa inicial de formação de coágulos no FV de 2 fases de ensaio. Dado todas as reacções atingiram aproximadamente o mesmo grau de formação de coágulo de 0,35-0,45 unidades de absorvância inicial entre o antes e o absorvância máxima após adição de tromboplastina e cloreto de cálcio, a medição da extensão da formação de coágulos não fornecer uma avaliação quantitativa da actividade de FV dada amostra de plasma.

O ensaio de microplacas novel encontrará utilização na pesquisa e na clínica para a medição da actividade de FV em amostras de plasma humano e de fracções durante a sua purificação a partir do plasma humano e animal. O ensaio de microplaca pode ser utilizada para medir o tempo, a taxa inicial e a extensão da formação de coágulos; parâmetros não geralmente monitorizadas simultaneamente em manuais de inclinação do tubo-ensaios de coagulação e analisadores automatizados. Esta informação proporciona mais de uma avaliação quantitativa completa do envolvimento de FV durante o evento de formação de coágulosno plasma humano que foi previamente relatada 3-7. Esta informação é especialmente importante em termos de pesquisa e os laboratórios clínicos para medir alterações significativas na actividade de FV em amostras de plasma ou com FV purificado ou FVa. O ensaio de microplacas FV podem também ser utilizados para caracterizar e medir compostos que podem activar ou inactivar FV e FVa, medir a actividade de FV em pacientes em risco de trombose venosa, como resultado da mutação FV Leiden 20, 21 e para monitorizar a actividade de FV durante a sua purificação a partir de plasma.

O ensaio de microplacas FV é facilmente adaptável para medir a actividade de qualquer factor de coagulação da via extrínseca intrínseca, ou comum, utilizando o plasma deficiente em factor apropriado e iniciando os reagentes para a formação de fibrina. O ensaio vai aumentar a nossa compreensão do FV bioquímica através de uma medição mais precisa e completa da sua actividade de investigação e laboratórios clínicos. Finally, esta informação irá impactar positivamente os ambientes de cuidados de saúde através de diagnóstico precoce e desenvolvimento de tratamentos mais eficazes para os indivíduos que sofrem de distúrbios de coagulação, como o DIC.

Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

A pesquisa foi apoiada com o desenvolvimento profissional e fundos de pesquisa de inicialização da Universidade de Ontário Institute of Technology (UOIT) para o Dr. John A. Samis e um Canadian Institutes of Health Research Saúde Professional Student Research Award para Irina Levit. Os autores reconhecem Shannon Everett (Ensino e do Centro de Aprendizagem, UOIT) por sua ajuda a preparar o vídeo. Os autores agradecem ao Dr. Michael E. Nesheim (Departamento de Bioquímica da Universidade de Queen, Kingston, ON), por sua orientação, percepção e discussões úteis. Os autores também agradecem ao Dr. Hock Cheng Toh (Roald Dahl Hemostasia e Trombose Centre, Royal Liverpool University Hospital, Liverpool, Reino Unido) para a prestação dos plasmas de pacientes DIC utilizados no estudo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Kinetic microplate reader Molecular Devices Spectra Max 190 SOFTmax PRO 4.3 LS software
Normal pooled human reference plasma Precision Biologicals CCN-10
Trisodium citrate Becton Dickenson B10242
EDTA Becton Dickenson B10093
FV-deficient human plasma4 Made from fresh human plasma and stored in aliquots at -70 °C.
3 and 60 ml syringes Becton Dickenson 309585 and 136898
Butterfly apparatus Vacutainer 367251 20 gauge
HEPES Sigma/Aldrich H-3375
NaCl Fisher BP358-212
Thromboplastin Trinity Biotech T1106 Dialyzed vs. HBS, pH 7.4 and stored in aliquots at -70 °C.
Calcium chloride Becton Dickenson B10070
Human thrombin15 From human plasma; stored at -20 °C in 50% (v/v) glycerol.
Dialysis membrane Fisher 21-152-6 6-8kDa molecular weight cutoff; 50mm x 3m.
Template holder and removable 8 well strips. Nunc 14-245-63 and 469957
ELISA washing trays BioRad 224-4872
1.5 ml microfuge and 15 ml screw capped tubes. Sarstedt 72690 and 62554205
Multichannel pipette Fisher 2703630 8 channel model.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Orfeo, T., Brufatto, N., Nesheim, M. E., Xu, H., Butenas, S., Mann, K. G. The factor V activation paradox. J. Biol. Chem. 279, 19580-19591 (2004).
  2. Bukys, M. A., Blum, M. A., Kim, P. Y., Brufatto, N., Nesheim, M. E., Kalafatis, M. Incorporation of factor Va into prothrombinase is required for coordinated cleavage of prothrombin by factor Xa. J. Biol. Chem. 280, 27393-273401 (2005).
  3. Nesheim, M. E., Katzmann, J. A., Tracy, P. B., Mann, K. G. Factor V. Methods. Enzymol. 80, 249-274 (1981).
  4. Bloom, J. W., Nesheim, M. E., Mann, K. G. A rapid technique for the preparation of factor V deficient plasma. Thromb. Res. 15, 595-599 (1979).
  5. Samis, J. A., Stewart, K. A., Nesheim, M. E., Taylor, F. B. Jr Factor V cleavage and inactivation are temporally associated with elevated elastase during experimental sepsis. J. Thromb. Haemost. 5, 2559-2561 (2007).
  6. Samis, J. A., Stewart, K. A., Toh, C. H., Day, A., Downey, C., Nesheim, M. E. Temporal changes in factors associated with neutrophil elastase and coagulation in intensive care patients with a biphasic waveform and disseminated intravascular coagulation. J. Thromb. Haemost. 2, 1535-1544 (2004).
  7. Cutler, J. A., Patel, R., Rangarajan, S., Tait, R. C., Mitchell, M. J. Molecular characterization of 11 novel mutations in patients with heterozygous and homozygous FV deficiency. Haemophilia. 16, 937-942 (2010).
  8. Ihara, M., Suzuki, T., Kobayashi, N., Goto, J., Ueda, H. Open-sandwich enzyme immunoassay for one-step noncompetitive detection of corticosteroid 11-deoxycortisol. Anal. Chem. 81, 8298-8304 (2009).
  9. Janke, R., Genzel, Y., Wahl, A., Reichl, U. Measurement of key metabolic enzyme activities in mammalian cells using rapid and sensitive microplate-based assays. Biotechnol. Bioeng. 107, 566-581 (2010).
  10. Beebe, D. P., Aronson, D. L. An automated fibrinolytic assay performed in microtiter plates. Thromb. Res. 47, 123-128 (1987).
  11. Frantantoni, J. C., Poindexter, B. J. Measuring platelet aggregation with microplate reader. A new technical approach to platelet aggregation studies. Am. J. Clin. Pathol. 94, 613-617 (1990).
  12. Pratt, C. W., Monroe, D. M. Microplate coagulation assays. Biotechniques. 13, 430-433 (1992).
  13. Tilley, D., Levit, I., Samis, J. A. Development of a microplate coagulation assay for Factor V in human plasma. Thromb. J. 9, 11-16 (2011).
  14. Toh, C. H., Downey, C. Back to the future: Testing in disseminated intravascular coagulation. Blood Coagul. Fibrinolysis. 16, 535-542 (2005).
  15. Spero, J. A., Lewis, J. H., Hasiba, U. Disseminated intravascular coagulation: Findings in 346 patients. Thromb. Haemost. 43, 28-33 (1980).
  16. Tracy, P. B., Eide, L. L., Bowie, E. J., Mann, K. G. Radioimmunoassay of factor V in human plasma and platelets. Blood. 60, 59-63 (1982).
  17. Krishnaswamy, S., Nesheim, M. E., Pryzdial, E. L. G., Mann, K. G. Assembly of prothrombinase complex. Meths. Enzymol. 222 (Part A), 261-280 (1993).
  18. Bajzar, L., Manuel, R., Nesheim, M. E. Purification and characterization of TAFI, a thrombin-activable fibrinolysis inhibitor. J. Biol. Chem. 270, 14477-14784 (1995).
  19. Mammen, E. F. Disseminated intravascular coagulation (DIC). Clin. Lab. Sci. 13, 239-2345 (2000).
  20. Dahlbäck, B., Carlsson, M., Svensson, P. J. Familial thrombophilia due to a previously unrecognized mechanism characterized by poor anticoagulant response to activated protein C: prediction of a cofactor to activated protein C. PNAS. 90, 1004-108 (1993).
  21. Dahlbäck, B. Advances in understanding pathogenic mechanisms of thrombophilic disorders. Blood. 112, 19-27 (2008).

Tags

Immunology Factor V microplaca o ensaio de coagulação de plasma humano a coagulação intravascular disseminada (DIC) a coagulação do sangue
Medição da actividade de factor V no plasma humano, utilizando um ensaio de coagulação de Microplacas
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tilley, D., Levit, I., Samis, J. A.… More

Tilley, D., Levit, I., Samis, J. A. Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay. J. Vis. Exp. (67), e3822, doi:10.3791/3822 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter