Измерения клеточных Хемотаксис с ECIS / Такси
Summary
ECIS / Такси система автоматизирована, в режиме реального времени анализ, который измеряет сотовой хемотаксис. В данном анализе клетки перемещаются под слоем агарозы, чтобы прийти к целевой электрода. Сотовые движения измеряется начала сопротивления переменного тока 0.
Abstract
Сотовые движения в ответ на внешние раздражители имеет фундаментальное значение для многих клеточных процессах, включая заживления ран, воспалений и ответ на инфекцию. Общий метод измерения хемотаксис является Бойден анализа камеру, в которой клетки и хемоаттрактантный разделены пористой мембраной. Как клетки мигрируют через мембрану в сторону хемоаттрактантный, они придерживаются в нижней части оболочки, или осенью в основных средствах массовой информации, и впоследствии окрашиваются и визуально считается 1. В этом методе клетки подвергаются воздействию крутой и переходные хемоаттрактантный градиент, который считается бедным представление градиента в тканях 2.
Другой анализ системы, под-агарозы хемотаксис анализ, 3, 4 меры клетки движение по твердой подложке в тонкую водную пленку, образует под слоем агарозы. Градиент, который развивается в агарозном мелкий и считается приложениеropriate представление естественного градиента. Хемотаксис может быть оценена микроскопических изображений расстояния. Оба анализа Бойден камеру и под-агарозы анализа, как правило, настроены как конечная точка анализа.
Автоматизированная ECIS / Такси система сочетает в себе под-агарозы подход с электрическим Cell-подложка сопротивление зондированию (ECIS), 5, 6. В данном анализе целевой электроды расположены в каждом из 8 камер. Большое контр-электрод проходит через каждого из 8 камер (рис. 2). Каждая камера заполнена агарозой и два небольших скважин разреза в агарозном по обе стороны от целевого электрода. Одна скважина заполняется клеточной популяции тест, а другой держит источников диффундирующих хемоаттрактантный (рис. 3). Ток проходит через системы может быть использован для определения изменения сопротивления, которое происходит в клетках проходит над объектом электрода. Клетки на целевой электродыE повышают устойчивость системы 6. Кроме того, быстрые изменения сопротивления представляют собой изменения во взаимодействии клеток с поверхности электрода и свидетельствуют о текущих клеточные изменения формы. ECIS / Такси система измерения движения популяции клеток в реальном времени, в течение длительного периода времени, но также достаточно чувствительны, чтобы обнаружить прибытие из одной клетки в цель электрода.
Dictyostelium discoidium, как известно, мигрируют в присутствии фолиевой кислоты градиент 7, 8 и хемотаксиса ответ может быть точно измерена по ECIS / такси 9. Хемотаксис лейкоцитов в ответ на SDF1α и хемотаксис антагонистов также были измерены с ECIS / 10 Такси 11. Пример лейкоцитарной реакции на SDF1α показано на рисунке 1.
Protocol
Discussion
Новые характеристики ECIS / Такси анализа включают ее возможность автоматизировать сбор данных в реальном времени, как клетки реагируют на хемоаттрактантный. В то время как наиболее употребительных применения этой технологии заключается в измерении клеточных реакций на отдельные град…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами Национальных Институтов Здоровья (ES07408 и EB00208).
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog number | Comments |
| ECIS Zθ | Applied Biophysics | http://www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php | |
| ECIS Electrode Array | Applied Biophysics | 8W Chemotaxis | http://www.biophysics.com/cultureware.php |
| Seakem GTG agarose | BioWhittaker Molecular Applications | 50070 | |
| RPMI1640 | Cellgro | 10-040 | |
| HyClone Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | SH300703 | |
| Penicillin/Streptomycin | MP Biomedicals | 1670049 | Penicillin 5,000 IU/ml; Streptomycin 5 mg/ml |
| HEPES Buffer | MP Biomedicals | 1688449 | 1M solution, cell culture grade |
| 14 Gauge stainless steel Cannula (2) 4 inch | General Laboratory Supply | 5-8365-1 | Blunt point |
References
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
- Lauffenburger, D. A., Tranquillo, R. T., Zigmond, S. H. Concentration gradients of chemotactic factors in chemotaxis assays. Methods Enzymol. 162, 85-101 (1988).
- Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. J. Immunol. 115, 1650-1650 (1975).
- Newton-Nash, D. K., Tonellato, P., Swiersz, M., Abramoff, P. Assessment of chemokinetic behavior of inflammatory lung macrophages in a linear under-agarose assay. J. Leukoc. Biol. 48, 297-305 (1990).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 3761-374 (1984).
- Keese, C. G. I. A Whole Cell Biosensor bsed on Cell-Substrate Interactions. IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 12, 500-501 (1990).
- Laevsky, G., Knecht, D. A. Cross-linking of actin filaments by myosin II is a major contributor to cortical integrity and cell motility in restrictive environments. J. Cell. Sci. 116, 3761-3770 (2003).
- Condeelis, J., Bresnick, A., Demma, M., Dharmawardhane, S., Eddy, R., Hall, A. L., Sauterer, R., Warren, V. Mechanisms of amoeboid chemotaxis: an evaluation of the cortical expansion. 11, 5-6 (1990).
- Hadjout, N., Laevsky, G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Automated real-time measurement of chemotactic cell motility. Biotechniques. 31, 1130-1138 (2001).
- Hadjout, N., Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Automated real-time measurements of leukocyte chemotaxis. J. Immunol. Methods. 320, 70-80 (2007).
- Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Metallothionein mediates leukocyte chemotaxis. BMC Immunol. 6, 21-21 (2005).
- Lundien, M. C., Mohammed, K. A., Nasreen, N., Tepper, R. S., Hardwick, J. A., Sanders, K. L., Van Horn, R. D., Antony, V. B. Induction of MCP-1 expression in airway epithelial cells: role of CCR2 receptor in airway epithelial injury. J. Clin. Immunol. 22, 144-152 (2002).
- Zudaire, E., Cuesta, N., Murty, V. The aryl hydrocarbon receptor repressor is a putative tumor suppressor gene in multiple human cancers. J. Clin. Invest. 118, 640-650 (2008).
- Opp, D., Wafula, B., Lim, J., Huang, E., Lo, J. C., Lo, C. M. Use of electric cell-substrate impedance sensing to assess in vitro cytotoxicity. Biosens. Bioelectron. 24, 2625-269 (2009).
- Foxman, E. F., Kunkel, E. J., Butcher, E. C. Integrating conflicting chemotactic signals. The role of memory in leukocyte navigation. J. Cell. Biol. 147, 577-588 (1999).
- Heit, B., Tavener, S., Raharjo, E., Kubes, P. An intracellular signaling hierarchy determines direction of migration in opposing chemotactic gradients. J. Cell. Biol. 159, 91-102 (1999).
