小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)的质量取决于鼠标CF-1如正确的应变。全能性支持MEFs和条件培养基(厘米),从这些应该包含激活素A,小鬼和TGFβ1的最佳浓度为激活素/ Nodal和FGF通路所需的合作保持自我更新和全能性。
在一般情况下,人类胚胎干细胞(胚胎干细胞)和人类诱导多能干细胞(hiPSCs 1)可变量的条件下培养。然而,它是不容易的建立一个有效的制度,为培养这些细胞。由于文化条件可以影响基因表达,在胚胎干细胞和hiPSCs赋予全能性,培养方法的优化和标准化是至关重要的。
人类胚胎干细胞系的建立首次使用MEFs细胞作为饲养层细胞和胎牛血清(FBS),含培养基2。接下来,胎牛血清被替换Knockout血清替代品(KSR)和FGF2的,从而提高3胚胎干细胞的增殖。最后,馈线自由文化系统培养细胞使基底膜涂层板KSR-含条件培养基(MEFs细胞条件培养基)4。随后,胚胎干细胞培养条件化学defin馈线自由文化走向编辑条件5-7。此外,异种组件由病原体和动物蛋白培养方法,以避免潜在的污染已建立了8个 。
获得改善条件与人类细胞系(如胎儿肌肉和皮肤细胞9日,10成人皮肤细胞,包皮成纤维11-12,13羊膜间质细胞),小鼠饲养层细胞已被替换。然而,使用人包皮成纤维细胞源性饲养层保持未分化的胚胎干细胞的效率是不是只要从小鼠饲养细胞分泌激活素A 14的较低水平,由于高。显然,是在老鼠和人类饲养层细胞生长因子生产的明显差异。
老鼠和人类饲养层细胞的转录组的分析结果显示支持和不支持细胞之间的显着性差异。外源性FGF2的关键是maintai宁胚胎干细胞和hiPSCs自我更新,并已被确定为一个关键调节因子TGFβ1,激活素A和小鬼(骨形态发生蛋白受体拮抗剂)在饲养层细胞的表达。激活素A诱导的OCT4,SOX2和NANOG的在15-16人胚胎干细胞的表达已被证明。
长期培养,胚胎干细胞和hiPSCs可以生长分裂灭活MEFs细胞或基底膜涂层板在MEF-CM(MEF的条件培养基)馈线的条件下,以维持其未分化状态。两种培养条件下的成功完全取决于饲养层细胞的质量,因为它们直接影响了人类胚胎干细胞的生长。
在这里,我们提出了一个优化的分离和培养小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)的方法,制备条件培养基(CM)和酶联免疫吸附试验(ELISA)评估各级激活素在媒体。
这里的MEFs细胞分离过程,使建立一个标准化的培养条件下对人类胚胎干细胞和hiPSCs。此外,基于ELISA的系统,用于评估饲养层细胞的细胞因子生产的MEF派生的空调媒体质量的一个有用的指标。提供配套成纤维细胞的小鼠品系(CF1的)的日常维护是必要的,以避免批次到批次的培养基的变化。此外,建议隔离从几个小鼠胚胎细胞的同时获得一致的质量。当然新鲜分离MEFs细胞可以保持冻结在P0和P1。也灭活MEFs中可以保持在适当数额取决于细胞培养的要求等分冻结。一般应约250.000细胞接种在6孔板培养胚胎干细胞和iPS细胞的单井。建立和优化的方法可以经常使用,以尽量减少复合驱之间的变异租实验。
The authors have nothing to disclose.
特别感谢博士鲍里斯Greber的设立激活素A酶联免疫吸附试验协议在Greber 等2007年发表的。我们特别感谢莫妮卡Shevack夫人准备的图形概览。我们非常感谢所有帮助和拍摄之前和期间的宝贵建议Heiko福克斯博士。我们要感谢所有成员保持稳定供应MEFs和CM的的Adjaye实验室,尤其是伊丽莎白·索查。我们也承认我们的同事,在他们的永久支持MPIMG动物设施。这项工作是由马克斯 – 普朗克协会和[BMBF的部分资金;授权号0315717A],伙伴的ERASysBio + ERA-NET的加在第七框架计划下,欧盟支持的倡议。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
DMEM (High Glucose) | Gibco, Invitrogen | 41966-052 | |
FBS | Biochrom | S0115 | |
L-glutamine | Gibco, Invitrogen | 25030-024 | |
Penicillin-streptomycin | Gibco, Invitrogen | 15140-122 | |
Vacuum filter system | Corning | 431097 | 500 ml, 0.22 μm, PAS |
DMSO | Sigma | D2650 | |
Knockout DMEM | Gibco, Invitrogen | 10829-018 | |
Knockout Serum Replacement | Gibco, Invitrogen | 10828-028 | |
Non-Essential Amino Acids | Gibco, Invitrogen | 11140-035 | |
beta-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
PBS | Gibco, Invitrogen | 14190-169 | |
DNase I | Sigma | D4527 | |
Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
Basic Fibroblast Growth Factor | PeproTech | 100-18B | |
Biotinylated Anti-human/mouse/rat Activin A Antibody | R&D Systems | BAM3381 | |
Gelatin | Sigma | G9391 | |
Human/Mouse/Rat Activin A MAb | R&D Systems | MAB3381 | |
0.05% Trypsin-EDTA | Gibco, Invitrogen | 25300-054 | |
Extra Thin Iris Scissors | FST | 14088-10 | |
Extra Fine Graefe Forceps | FST | 11150-10 | |
Pierse Fixation Forceps | FST | 18155-13 |