マウス胚性線維芽細胞(MEF)の品質は、例えば、CF-1のようなマウスの右歪みによって決定されます。これらから得られた多能性·支持のMEFと馴化培地(CM)が共同で動作可能な自己再生および多能性を維持するために、アクチビン/ノードおよびFGF経路に必要なアクチビンA、グレムリンとTGFβ1の最適な濃度を含める必要があります。
一般に、ヒト胚性幹細胞(ヒトES細胞)とヒト人工多能性幹細胞(hiPSCs)1は、可変条件下で培養することができます。しかし、これらの細胞を培養するための効果的なシステムを確立することは容易ではありません。培養条件は、ヒトES細胞とhiPSCsの多能性付与遺伝子発現に影響を与えることができるので、最適化および培養方法の標準化が重要である。
hESCの樹立は、最初のフィーダー細胞とウシ胎児血清(FBS)含有培地2としてのMEFを使用して記述されていた。次に、FBSはノックアウト血清代替物(KSR)、およびヒトES 3の増殖を促進するFGF2、置き換えられました。最後に、フィーダーフリーの培養システムは、KSR含有馴化培地を細胞(MEFによって条件付け培地4)にマトリゲルをコートしたプレート上で細胞培養を可能にします。その後、ヒトES細胞の培養条件は、化学的にdefinでフィーダーフリーの培養に向かって移動したEDの条件は5-7。また、異種フリーコンポーネントを使用して、病原体と動物性タンパク質の培養法による潜在的な汚染を避けるために、8を確立されている。
改良された条件を取得するには、マウスフィーダー細胞は、ヒト細胞株(例えば、胎児の筋肉や皮膚細胞9、大人の皮膚細胞10、包皮線維芽細胞11-12、羊膜間葉系細胞13)に置き換えられています。しかし、ヒト包皮線維芽細胞由来のフィーダーレイヤーを使用して未分化ヒトES細胞を維持するための効率は14アクチビンの分泌の低いレベルのために、マウスフィーダー細胞からのそれと同じくらい高くはありません。明らかに、マウスとヒトのフィーダー細胞による成長因子の産生で明らかに違いがあります。
マウスとヒトのフィーダー細胞のトランスクリプトームの解析は支持と非支持細胞の間に有意差を明らかにした。外因性のFGF2はmaintaiために重要ですヒトES細胞とhiPSCsの自己再生寧と、フィーダー細胞のTGFβ1、アクチビンAとグレムリン(BMP拮抗薬)の発現を調節する重要な因子として同定されている。アクチビンAは、ヒトES細胞15から16にOCT4、SOX2、NANOGとの発現を誘導することが示されている。
長期培養では、ヒトES細胞とhiPSCsは、その未分化状態を維持するために、有糸分裂不活性化されたMEFまたはマトリゲルをコートしたプレート上でMEF-CM(MEF-馴化培地)でフィーダーフリーの条件下で成長させることができる。彼らは直接ヒトES細胞の成長に影響を与えるので、両方の培養条件の成功は、完全に、フィーダー細胞の品質に依存します。
ここでは、メディア内のアクチビンのレベルを評価するために、マウス胚性線維芽細胞(MEF)の単離および培養のために最適化された方法、条件培地(CM)と酵素免疫測定法(ELISA)の調製を示す。
ここで紹介するMEFの分離手順は、ヒトES細胞とhiPSCsための標準化された培養条件の確立を可能にします。また、フィーダー細胞によるサイトカイン産生を評価するために使用されるELISAベースのシステムは、MEF由来の馴化培地の質の有用な指標である。サポートしている線維芽細胞を提供するマウス系統(CF1)の定期的なメンテナンスは、培地のバッチ間の変動を回避するために必要です。また、細胞の一貫した品質を得るために同時に複数のマウスから胚を分離することをお勧めします。確かに新たに単離したMEFは、P0とP1で凍結保存することができます。また、不活化のMEFは、細胞培養のための要件に応じて適切な量のアリコートで凍結保存することができます。通常約250.000細胞を培養ヒトES細胞やiPS細胞への6ウェルプレートの単一ウェルに播種する必要があります。確立され、最適化されたメソッドは、定期的にdiffeの間でのばらつきを最小限に抑えることができます。実験を借りる。
The authors have nothing to disclose.
Greber らに公開されているアクチビンELISAプロトコルを設定するための博士ボリスGreberに感謝します2007。我々は、グラフィカルな概要を準備するための夫人モニカShevackに特に感謝しています。私たちは、撮影前と中にすべてのヘルプと貴重な提案のために博士ハイコ·フックスに非常に感謝しています。我々は、MEFには、CMの安定供給を維持するために特にエリーザベトSocha、アジャイ室のすべてのメンバーに感謝したい。我々はまた、永続的なサポートのためのMPIMGの動物施設で私たちの同僚を認める。本研究の一部はマックス·プランク協会によって資金を供給された[BMBF、助成金番号0315717A] ERASysBioのパートナー+ EU FP7のERA-NET Plusのスキームの下でサポートイニシアチブ。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
DMEM (High Glucose) | Gibco, Invitrogen | 41966-052 | |
FBS | Biochrom | S0115 | |
L-glutamine | Gibco, Invitrogen | 25030-024 | |
Penicillin-streptomycin | Gibco, Invitrogen | 15140-122 | |
Vacuum filter system | Corning | 431097 | 500 ml, 0.22 μm, PAS |
DMSO | Sigma | D2650 | |
Knockout DMEM | Gibco, Invitrogen | 10829-018 | |
Knockout Serum Replacement | Gibco, Invitrogen | 10828-028 | |
Non-Essential Amino Acids | Gibco, Invitrogen | 11140-035 | |
beta-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
PBS | Gibco, Invitrogen | 14190-169 | |
DNase I | Sigma | D4527 | |
Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
Basic Fibroblast Growth Factor | PeproTech | 100-18B | |
Biotinylated Anti-human/mouse/rat Activin A Antibody | R&D Systems | BAM3381 | |
Gelatin | Sigma | G9391 | |
Human/Mouse/Rat Activin A MAb | R&D Systems | MAB3381 | |
0.05% Trypsin-EDTA | Gibco, Invitrogen | 25300-054 | |
Extra Thin Iris Scissors | FST | 14088-10 | |
Extra Fine Graefe Forceps | FST | 11150-10 | |
Pierse Fixation Forceps | FST | 18155-13 |