Summary
איכות של fibroblasts העכבר עובריים (MEFs) מוכתב על ידי זן הימני של העכבר כגון CF-1. Pluripotency, תומכת MEFs ומדיה ממוזגים (ס"מ) המתקבל אלה יכילו ריכוזים אופטימליים של Activin, שד ו Tgfβ1 הדרושים Activin / קטרי ו מסלולים FGF לשתף operatively לשמור על עצמי התחדשות pluripotency.
Abstract
בדרך כלל, בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) האדם המושרה בתאי גזע pluripotent (hiPSCs) 1 יכול להיות מתורבת בתנאים משתנים. עם זאת, זה לא קל להקים מערכת יעילה culturing תאים אלה. מאז התנאים תרבות יכולה להשפיע על ביטוי גנים אשר מקנה pluripotency ב hESCs ו hiPSCs, אופטימיזציה וסטנדרטיזציה של השיטה תרבות הוא חיוני.
הקמת קווי hESC תוארה לראשונה על ידי שימוש MEFs כמו תאים מזין בסרום שור עוברית (FBS) המכיל בינוני התרבות 2. לאחר מכן, FBS הוחלף החלפת בנוקאאוט בסרום (KSR) ו FGF2, אשר משפר את הפצת hESCs 3. לבסוף, מזין ללא מערכות תרבות לאפשר תאים culturing על Matrigel מצופים צלחות ב-KSR המכיל אוויר בינוני (מדיום מותנה MEFs) 4. כתוצאה מכך, תנאי hESCs תרבות עברו לקראת תרבות מזין חופשית defin כימיתאד תנאים 5-7. יתר על כן, כדי למנוע אפשרות של זיהום על ידי פתוגנים וחלבונים מן החי באמצעות שיטות תרבות קסנו ללא רכיבים הוקמו 8.
כדי להשיג תנאים משופרים מזין תאים עכבר הוחלפו שורות תאים אנושיים (למשל שריר העובר ותאי עור 9, לתאי עור בוגרים 10, fibroblasts העורלה 11-12, תאים mesenchymal מי השפיר 13). עם זאת, היעילות של שמירה על hESCs שלא עברו התמיינות באמצעות העורלה האדם פיברובלסטים שמקורם שכבות מזין אינו גבוה כמו זה של מזין תאים העכבר בשל במפלס התחתון של הפרשת Activin 14. כמובן, יש הבדל ניכר ייצור גורם הגדילה של עכבר לתאי אדם מזין.
ניתוח של transcriptomes של עכבר לתאי מזין האדם גילה הבדלים משמעותיים בין תאים תומכים ולא תומכת. אקסוגני FGF2 חיונית maintaiנינג עצמית חידוש hESCs ו hiPSCs, ו זוהה כגורם מרכזי בוויסות ביטוי Tgfβ1, Activin ו שד (אנטגוניסט BMP) בתאים מזין. Activin הוכח לגרום ביטוי OCT4, Sox2, ו Nanog ב hESCs 15-16.
לתרבות לטווח ארוך, hESCs ו hiPSCs ניתן לגדל על MEFs מומת mitotically או מתחת מזין ללא תנאי MEF-CM (MEF אילף בינוני) על Matrigel מצופים צלחות כדי לשמור על מצב מובחן שלהם. ההצלחה של שני התנאים תרבות לחלוטין תלוי באיכות של תאים מזין, שכן הם משפיעים ישירות על הצמיחה של hESCs.
כאן, אנו מציגים שיטת אופטימיזציה עבור בידוד והתרבות של fibroblasts העכבר עובריים (MEFs), הכנת בינוני אוויר (ס"מ) האנזים צמוד immunosorbent assay (ELISA) כדי להעריך את רמות Activin בתוך התקשורת.
Protocol
1. הבידוד של Fibroblasts עכבר עובריים (MEFs)
לאחר שני השלבים מבוצעים תחת ללא תנאים אספטיים.
- להקריב את העכבר בהריון (CF1, הארלן, ארה"ב) בשעה 13 או 14 DPC (היום שלאחר coitum) על ידי פריקה צוואר הרחם.
- לנתח את קרני הרחם, בקצרה לשטוף ב 70% (V / V) אתנול במקום לתוך צינור פלקון המכיל PBS ללא Ca 2 + Mg 2 + (Gibco, Invitrogen).
השלבים הבאים מתבצעים בשכונה בתרבית רקמה בתנאים אספטיים ושימוש בכלים סטריליים.
- מניחים קרניים הרחם לתוך צלחת פטרי והפרד העובר מן השליה שלה שק עוברי.
- לנתח את הראש ואיברים אדומים, להתרחץ PBS ולמקם את כל העוברים בצלחת פטרי נקי. דק לרכך את הרקמה באמצעות סכין גילוח סטרילי עד שהוא הופך ניתן פיפטה.
- הוסף 1 מ"ל של 0.05% טריפסין / EDTA (Gibco, Invitrogen), incluדינג 100 קוניץ יחידות DNase אני (USB), לכל העובר.
- העברת רקמה לתוך צינור 50 מ"ל ו בז דגירה של 15 דקות בשעה 37 ° C. אחרי 5 דקות כל אחד הדגירה, לנתק את התאים על ידי pipetting למעלה ולמטה ביסודיות.
- להשבית טריפסין על ידי הוספת נפח של 1 בינוני MEF שהוכן זה עתה.
MEF בינוני התרבות (רכיבים לעשות 500 מ"ל של התקשורת, מערבבים את כל המרכיבים ולסנן):
450 מ"ל של DMEM, 50 מ"ל של FBS (10% (V / V)), 5 מ"ל של 200 מ"מ L-גלוטמין (1/100 (V / V)), 5 מ"ל של סטרפטומיצין, פניצילין (1/100 (V / V)). - בצנטריפוגה תאים עם למהירות נמוכה (300 XG), 5 דקות, להסיר בזהירות את התא גלולה supernatant ו resuspend במדיום MEF חם.
- כ הצלחת מספר תאים שהוא שווה ערך עוברים 3-4 בקבוק אחד T150 (TPP) מצופה ג'לטין 0.2% (ג'לטין מעור שור, סוג ב ', Sigma) עבור שעות 2. את fibroblasts (P0, המעבר 0) הם התאים היחידים שיש להם את היכולת לצרף את ג'לטין מצופים צלוחיות. באופן אידיאלי, התאים הם 80-90% confluent לאחר 24 שעות ובשלב זה עיקר P0 תאים קפוא לשימוש בעתיד.
- הרחב את הבקבוק הנותר T150 (ים) של תאים P0 עד P3 או P4, אז להשבית ולהשתמש כמו מתקני האכלה כדי replate hESCs או לייצר בינוני אוויר (ס"מ).
2. איון ו ציפוי MEFs (תאים הכנה מזין)
כל הפעולות נעשות על מכסה המנוע בתרבית רקמה בתנאים אספטיים.
- מעיל T150 צלוחיות עם ג'לטין 0.2% ו דגירה ב RT עבור שעות לפחות 2.
- לדלל mitomycin C ב PBS (1 מ"ג / מ"ל) ולסנן.
- Aspirate מדיה MEFs ולשטוף עם PBS ללא Ca 2 + Mg 2 +.
- מקום 20 מ"ל של מדיום המכיל 10 מיקרוגרם / מ"ל של mitomycin C על MEFs.
- דגירה של HR 2 ב 37 מעלות צלזיוס עם mitomycin C המכיל בינוני מכן לשטוף פעמיים עם PBS, trypsinize, צנטריפוגה (דקות 5 ב XG 300) ותאי resuspend במצע חמים.
- ספירת תאים ו צלחת בצפיפות של 56.000 תאים / ס"מ 2 ב T150 צלוחיות ולהשתמש לייצור ס"מ במשך 6 ימים הבאים.
3. בינוני אילף (CM) הכנה
כל הפעולות נעשות על מכסה המנוע בתרבית רקמה בתנאים אספטיים.
- יום לאחר ציפוי MEFs מומת בצפיפות של 56.000 תאים / ס"מ 2 להחליף את המדיום MEF עם המדיום hESC (UM, בינוני מותנית) (0.5 מ"ל / ס"מ 2) השלים טרי עם 4 ng / ml של FGF2.
- איסוף ס"מ צלוחיות מזין לאחר דגירה 24 שעות ולהוסיף בינוני hESC טרי המכיל 4 ng / mL של FGF2 על מתקני האכלה.
- חזור על הליך זה במשך 6 ימים. בכל חנות היום אסף סי ב -20 ° C.
- לאחר 6 ימים מערבבים את כל aliquots של בינוניות מסנן (קורנינג, 0.22 מיקרומטר, PAS). לעשות 50 aliquots מ"ל ו חנות ב -80 ° C.
- להשלים ס"מ עם ng 4 נוסף / מ"ל של FGF2 לפני הוספת hESCs גדל על Matrigel. </ Li>
4. מדידת Activin בתקשורת המותנות (ELISA) 15
- להביא את כל דגימות ריאגנטים לטמפרטורת החדר.
- לדלל ללכוד נוגדנים (אדם \ עכבר \ עכברוש Activin א ', מב מחקר ופיתוח מערכות) ב PBS עם BSA 1%, מוסיפים microplate (100 μl / טוב) ו דגירה לילה ב RT.
- לאחר 24 שעות לשטוף את פי שלוש בארות עם PBST (PBS עם 0.05% Tween 20) (300 μl / טוב) אז בלוק (1% BSA / PBS, 300 μl / טוב) עבור שעות 1 ב RT.
- בזמן הזה מכינים Activin (R & D מערכות) עקומת סטנדרטי, כולל 7 דילולים (ריכוז פחות מ 30 ng / ml) ו מדגם ריק. טווח עבודה ליניארי של Activin הוא בין 0.25 ו - 32 ng / mL.
- הוסף כפילויות של סטנדרטים דגימות כדי בארות (100 μl / טוב) ו דגירה של שעה 2 ב RT.
- לשטוף את הבארות שלוש פעמים (300 μl של PBST).
- מוסיפים את נוגדנים משני (biotinylated) (עכבר אנוש / / עכברוש Biotinylated Activin, MAB מו"פ מערכות) (0.25 מיקרוגרם / מ"ל ב 1% BSA / PBS) ו דגירה של HR 2 ב RT.
- לשטוף את הבארות שלוש פעמים (300 μl של PBST), להוסיף streptavidin-HRP (מדולל% 1 BSA / PBS, מחקר ופיתוח מערכות) ו דגירה של 20 דקות ב RT.
- לשטוף את הבארות שלוש פעמים (300 μl של PBST), להוסיף 100 μl של פתרון המצע (Quantikine, מחקר ופיתוח מערכות) ו דגירה למשך 30 דקות ב RT בחושך.
- הוסף 100 μl של פתרון להפסיק (Quantikine, מחקר ופיתוח מערכות) זה גם ומערבבים בעדינות.
- סט Microplate הקורא (Molecular Devices ספקטרה מקס 250, מכשור רפואי גלובלית, Inc, מינסוטה) ל 450 ננומטר, עם תיקון גל ב 540 או 570 ננומטר, כדי לקבוע את צפיפות אופטית של כל טוב.
5. נציג תוצאות
התוכנית הכוללת של הליך הבידוד מוצג באיור 1. מורפולוגיה אופיינית hESCs ו hiPSCs בתרבית בתנאים שונים מוצג באיור 2. המורפולוגיה של MEFs ותאי מזין מומת המשמשים להכנת CM מוצגת באיור 3. באופן כללי, התאים צריכים להיות confluent 24 שעות לאחר בידוד ומוכן להיות קפוא או מורחבת. עם זאת, לפעמים זה עלול לקחת 2-3 ימים לפני קבלת תרבויות confluent. סי יש להכין מתאי במעבר 4 ולא מאוחר יותר. זה חיוני כי תאים ראשוניים ניתן להרחיב על 4-5 קטעים לפני תחילת ההזדקנות.
ציטוקינים, Activin, נחשב כגורם הקריטי ביותר מופרש על ידי תאים מזין על התמיכה של צמיחה מובחן של תאים גזע pluripotent 14. מדידה של רמת Activin ב ס"מ (איור 4) הוא assay כמותי מאוד נוח לעקוב אחר איכות MEFs.
באיור 1. ייצוג סכמטי של הליך הבידוד MEFs.
איור 2. מורפולוגיה אופיינית hESCs שלא עברו התמיינות בתרבית בנוכחות של (A) תאים מזין, (ב) בינוני אוויר ובינוניים (C) מוגדר. מורפולוגיה אופיינית hiPSCs בתרבית בנוכחות (D, E) מזין תאים.
איור 3. מורפולוגיה אופיינית fibroblasts העכבר עובריים (MEFs). (א) המעבר 0 (P0) יומיים לאחר ציפוי / בידוד, (ב) שכבת מזין מומת בצפיפות של 56.000 תאים / ס"מ 2.
איור 4. אנזימים המקושר immunosorbent assay (ELISA) מבוסס מדידות של ריכוז של Activin במדיום אוויר (CM) יחסי ציבורepared עם fibroblasts העכבר עובריים שמקורם במתח העכבר CF1. סי נאסף במשך 6 ימים ונקווה אז. סי "1" ו סי "2" מתייחסים קבוצות שונות של מדיה ואום אל התקשורת הבלתי מותנה. כפי פונקציה של תהליך מיזוג הוא Activin הפרשת לתוך המדיום ידי MEFs, Activin הוא כמעט בלתי ניתן לגילוי באום.
Discussion
הליך הבידוד MEFs המוצגת כאן מאפשרת את הקמתה של מצב התרבות סטנדרטית hESCs ו hiPSCs. יתר על כן מערכת ELISA המבוסס משמש להערכת ייצור ציטוקינים על ידי התאים מזין הוא אינדיקטור שימושי לאיכות של MEF הנגזרות התקשורת ממוזגים. תחזוקה שוטפת של זן העכבר (CF1) מתן תמיכה fibroblasts יש להימנע אצווה אל אצווה וריאציה של התקשורת והתרבות. יתר על כן, מומלץ לבודד את העוברים מעכברים בו זמנית כדי להשיג איכות עקבית של תאים. אין ספק MEFs מבודד טרי אפשר לשמור קפוא ב P0 ו P1. MEFs מובטל כמו כן אפשר לשמור קפוא aliquots של כמויות מתאימות בהתאם לדרישות תרבית תאים. בדרך כלל כ 250.000 תאים יש מצופה היטב אחד של הצלחת 6 גם כדי hESCs התרבות תאים שב"ס. השיטה הוקמה אופטימיזציה ניתן להשתמש באופן שגרתי כדי לצמצם את השונות בין diffeלשכור ניסויים.
Disclosures
אין ניגוד עניינים הצהיר.
Acknowledgments
תודה מיוחדת לד"ר בוריס גרבר להגדרת Activin פרוטוקול ELISA כפי שפורסם גרבר et al. 2007. אנו מודים במיוחד לגב 'מוניקה Shevack להכנת סקירה גרפית. אנו מודים מאוד ד"ר פוקס הייקו על כל העזרה והצעות ערך לפני ובמהלך הצילומים. ברצוננו להודות לכל אנשי המעבדה Adjaye, במיוחד אליזבת סוצ'ה לשמירה על אספקה קבועה של MEFs ו CM. כמו כן, אנו מכירים עמיתינו במתקן בעלי החיים של MPIMG לתמיכה הקבע שלהם. עבודה זו מומנה בחלקה על ידי מקס פלאנק, חברה [BMBF, מספר מענק 0315717A], השותפים של ERASysBio + היוזמה נתמכת במסגרת האיחוד האירופי ERA-NET פלוס תוכנית ב FP7.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (High Glucose) | Gibco, Invitrogen | 41966-052 | |
| FBS | Biochrom | S0115 | |
| L-glutamine | Gibco, Invitrogen | 25030-024 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco, Invitrogen | 15140-122 | |
| Vacuum filter system | Corning | 431097 | 500 ml, 0.22 μm, PAS |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Knockout DMEM | Gibco, Invitrogen | 10829-018 | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco, Invitrogen | 10828-028 | |
| Non-Essential Amino Acids | Gibco, Invitrogen | 11140-035 | |
| beta-Mercapt–thanol | Sigma | M7522 | |
| PBS | Gibco, Invitrogen | 14190-169 | |
| DNase I | Sigma | D4527 | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor | PeproTech | 100-18B | |
| Biotinylated Anti-human/mouse/rat Activin A Antibody | R&D Systems | BAM3381 | |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| Human/Mouse/Rat Activin A MAb | R&D Systems | MAB3381 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco, Invitrogen | 25300-054 | |
| Extra Thin Iris Scissors | FST | 14088-10 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | FST | 11150-10 | |
| Pierse Fixation Forceps | FST | 18155-13 |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Amit, M. Clonally derived human embryonic stem cell lines maintain pluripotency and proliferative potential for prolonged periods of culture. Dev. Biol. 227, 271-278 (2000).
- Xu, C. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).
- Ludwig, T. E. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat. Biotechnol. 24, 185-187 (2006).
- Yao, S. Long-term self-renewal and directed differentiation of human embryonic stem cells in chemically defined conditions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 6907-6912 (2006).
- Lu, J., Hou, R., Booth, C. J., Yang, S. H., Snyder, M. Defined culture conditions of human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 5688-5693 (2006).
- Skottman, H., Hovatta, O. Culture conditions for human embryonic stem cells. Reproduction. 132, 691-698 (2006).
- Richards, M., Fong, C. Y., Chan, W. K., Wong, P. C., Bongso, A. Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 20, 933-936 (2002).
- Richards, M. Comparative evaluation of various human feeders for prolonged undifferentiated growth of human embryonic stem cells. Stem Cells. 21, 546-556 (2003).
- Amit, M. Human feeder layers for human embryonic stem cells. Biol. Reprod. 68, 2150-2156 (2003).
- Inzunza, J. Derivation of human embryonic stem cell lines in serum replacement medium using postnatal human fibroblasts as feeder cells. Stem Cells. 23, 544-549 (2005).
- Zhang, K. Utilization of Human Amniotic Mesenchymal Cells as Feeder Layers to Sustain Propagation of Human Embryonic Stem Cells in the Undifferentiated State. Cell Reprogram. , (2011).
- Eiselleova, L. Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells. Int. J. Dev. Biol. 52, 353-363 (2008).
- Greber, B., Lehrach, H., Adjaye, J. Fibroblast growth factor 2 modulates transforming growth factor beta signaling in mouse embryonic fibroblasts and human ESCs (hESCs) to support hESC self-renewal. Stem Cells. 25, 455-464 (2007).
- Vallier, L., Alexander, M., Pedersen, R. A. Activin/Nodal and FGF pathways cooperate to maintain pluripotency of human embryonic stem cells. J. Cell Sci. 118, 4495-4509 (2005).
