Качество эмбриональных фибробластов мыши (MEFs) определяется по праву мышах, таких как CF-1. Плюрипотентности, поддерживающих MEFs и условных СМИ (CM), полученные из этих должен содержать оптимальные концентрации Активин, Gremlin и Tgfβ1, необходимых для Активин / Узловые и FGF пути к совместной оперативно поддерживать самообновления и плюрипотентности.
In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.
The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium2. Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs3. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)4. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established8.
To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells9, adult skin cells10, foreskin fibroblasts11-12, amniotic mesenchymal cells13). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A14. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.
Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgfβ1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs15-16.
For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.
Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.
Процедура MEFs изоляции, представленные здесь позволяет создание стандартизированных условиях культуры ЭСК и hiPSCs. Кроме того, ИФА-системы, используемые для оценки продукции цитокинов фидерных клеток является полезным индикатором качества MEF-производных условно СМИ. Текущий ремонт мыши штамма (CF1) обеспечение поддержки фибробластов необходимо, чтобы избежать от партии к партии изменении медиа-культуры. Кроме того, рекомендуется изолировать от нескольких эмбрионов мышей одновременно получить стабильное качество клеток. Конечно свежевыделенных MEFs может быть заморожен на P0 и P1. Также инактивированной MEFs можно хранить в замороженном состоянии в аликвоты соответствующих сумм в зависимости от требований к клеточной культуре. Обычно около 250,000 клетки должны быть покрыты в одном и 6-луночного планшета для культуры ЭСК и иПК клеток. Создан и оптимизирован метод может быть широко используется, чтобы минимизировать изменчивость между Diff #Аренда экспериментов.
The authors have nothing to disclose.
Особая благодарность доктору Борису Greber для создания Активин ИФА протокол, опубликованной в Greber соавт. 2007 года. Мы особенно благодарны г-жа Моника Shevack подготовки графическое представление. Мы очень благодарны доктору Хайко Фукса за помощь и ценные советы перед и во время съемок. Мы хотели бы поблагодарить всех членов лаборатории Аджайе, особенно Элизабет Socha для поддержания постоянного притока MEFs и CM. Мы также признаем, наши коллеги на животных средство MPIMG за постоянную поддержку. Эта работа была частично финансируется за счет Общества Макса Планка и [BMBF, грант № 0315717A], партнеров ERASysBio + инициатива поддерживается в ЕС ERA-NET Plus схемы FP7.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
DMEM (High Glucose) | Gibco, Invitrogen | 41966-052 | |
FBS | Biochrom | S0115 | |
L-glutamine | Gibco, Invitrogen | 25030-024 | |
Penicillin-streptomycin | Gibco, Invitrogen | 15140-122 | |
Vacuum filter system | Corning | 431097 | 500 ml, 0.22 μm, PAS |
DMSO | Sigma | D2650 | |
Knockout DMEM | Gibco, Invitrogen | 10829-018 | |
Knockout Serum Replacement | Gibco, Invitrogen | 10828-028 | |
Non-Essential Amino Acids | Gibco, Invitrogen | 11140-035 | |
beta-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
PBS | Gibco, Invitrogen | 14190-169 | |
DNase I | Sigma | D4527 | |
Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
Basic Fibroblast Growth Factor | PeproTech | 100-18B | |
Biotinylated Anti-human/mouse/rat Activin A Antibody | R&D Systems | BAM3381 | |
Gelatin | Sigma | G9391 | |
Human/Mouse/Rat Activin A MAb | R&D Systems | MAB3381 | |
0.05% Trypsin-EDTA | Gibco, Invitrogen | 25300-054 | |
Extra Thin Iris Scissors | FST | 14088-10 | |
Extra Fine Graefe Forceps | FST | 11150-10 | |
Pierse Fixation Forceps | FST | 18155-13 |