Kvaliteten af muse embryonale fibroblaster (MEF) dikteres af den højre musestamme, såsom CF-1. Pluripotency-støttende MEF'er og konditioneret medium (CM) opnået fra disse skal indeholde optimale koncentrationer af Activin A, Gremlin og Tgfβ1 nødvendige for aktivin / Nodal og FGF veje til at co-operativt opretholde selvfornyelse og pluripotency.
I almindelighed (hiPSCs) humane embryonale stamceller (hESCs) og menneskelige inducerede pluripotente stamceller fra 1 kan dyrkes under skiftende forhold. Men det er ikke let at etablere et effektivt system til dyrkning af disse celler. Da dyrkningsbetingelser kan påvirke genekspression, der giver pluripotency i hESCs og hiPSCs, optimering og standardisering af kulturen metoden er afgørende.
Etablering af embryonale linier blev først beskrevet ved hjælp af MEF'er som fødeceller og føtalt bovint serum (FBS)-holdigt dyrkningsmedium 2. Dernæst blev FBS erstattet med knockout serum udskiftning (KSR) og FGF2, som forøger proliferation af hESCs 3. Endelig, arkføder-frie kultur systemer muliggør dyrkning af celler på Matrigelcoatede plader i KSR indeholdende konditioneret medium (medium konditioneret med MEF'er) 4. Efterfølgende har hESCs dyrkningsbetingelser bevæget sig i retning feeder-fri kultur i kemisk uigenkaldelige bilateraleed forhold 5-7. Desuden har for at undgå den potentielle forurening med patogener og animalske proteiner dyrkningsmetoder med xeno-frie komponenter blevet etableret 8.
Til opnåelse af forbedrede betingelser murine feederceller er blevet erstattet med humane cellelinier (f.eks føtalt muskel og hudceller 9, voksne hudceller 10, forhudsfibroblaster 11-12, amniotiske mesenkymceller 13). Imidlertid er effektiviteten af at opretholde udifferentierede hESCs anvendelse af human forhudsfibroblast-afledte fødelag er ikke så højt som fra murine feederceller som følge af lavere sekretion af activin A 14. Der er naturligvis en tydelig forskel i vækstfaktor produktion af muse og humane fødeceller.
Analyser af transcriptomes af muse og humane fødeceller viste signifikante forskelle mellem støttende og ikke-understøttende celler. Exogenous FGF2 er afgørende for maintaiNing selvfornyelse af hESCs og hiPSCs, og er blevet identificeret som en afgørende faktor, der regulerer ekspression af Tgfβ1, Activin A og Gremlin (en BMP-antagonist) i feeder-celler. Activin A har vist sig at inducere ekspressionen af OCT4, SOX2, og NANOG i hESCs 15-16.
Til langsigtet kultur, kan hESCs og hiPSCs dyrkes på mitotisk inaktiverede MEF'er eller under feeder-frie betingelser i MEF-CM (MEF-konditioneret medium) på Matrigel-overtrukne plader for at opretholde deres udifferentieret tilstand. Succes begge dyrkningsbetingelser fuldt afhænger af kvaliteten af foderceller, idet de direkte påvirker væksten af hESCs.
Her præsenteres en optimeret fremgangsmåde til isolering og dyrkning af muse embryonale fibroblaster (MEF) fremstilling af konditioneret medium (CM) og enzym-linket immunosorbent assay (ELISA) for at vurdere niveauerne af activin A i mediet.
Den MEF'er isoleringsprocedure præsenteret her muliggør etablering af en standardiseret kultur betingelse for hESCs og hiPSCs. Desuden ELISA-system anvendes til at evaluere cytokinproduktion af fødeceller er en nyttig indikator for kvaliteten af MEF-afledte konditionerede medier. Den rutinemæssig vedligeholdelse af musestamme (CF1) tilvejebringelse støtter fibroblaster er nødvendig for at undgå batch til batch variation af kulturmedier. Endvidere anbefales det at isolere embryoner fra flere mus samtidigt for at opnå en ensartet kvalitet af celler. Bestemt frisk isolerede MEF'er kan holdes frosne ved P0 og P1. Også inaktiveres MEF'er kan opbevares nedfrosset i alikvoter af passende mængder afhængigt af kravene til cellekultur. Sædvanligvis ca 250,000 celler bør udpladet i en enkelt brønd i en 6-brønds plade til dyrkning hESCs og iPS celler. Den etablerede og optimeret fremgangsmåde kan anvendes rutinemæssigt til at minimere variabilitet mellem forskelleje eksperimenter.
The authors have nothing to disclose.
Særlig tak til Dr. Boris Greber til opsætning af Activin A ELISA-protokol, som blev offentliggjort i Greber et al. 2007. Vi er især taknemmelige for fru Monica Shevack for at forberede den grafiske oversigt. Vi er meget taknemmelige for Dr. Heiko Fuchs for al hjælp og værdifulde forslag før og under optagelserne. Vi vil gerne takke alle medlemmer af Adjaye laboratoriet, især Elisabeth Socha for at opretholde en konstant tilførsel af MEF'er og CM. Vi anerkender også vores kolleger på dyret facilitet i MPIMG for deres vedvarende støtte. Dette arbejde blev delvist finansieret af Max Planck Society og [BMBF; tilskud nummer 0315717A], partnere ERASysBio + initiativet støttes under EU ERA-NET Plus-ordning i FP7.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
DMEM (High Glucose) | Gibco, Invitrogen | 41966-052 | |
FBS | Biochrom | S0115 | |
L-glutamine | Gibco, Invitrogen | 25030-024 | |
Penicillin-streptomycin | Gibco, Invitrogen | 15140-122 | |
Vacuum filter system | Corning | 431097 | 500 ml, 0.22 μm, PAS |
DMSO | Sigma | D2650 | |
Knockout DMEM | Gibco, Invitrogen | 10829-018 | |
Knockout Serum Replacement | Gibco, Invitrogen | 10828-028 | |
Non-Essential Amino Acids | Gibco, Invitrogen | 11140-035 | |
beta-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
PBS | Gibco, Invitrogen | 14190-169 | |
DNase I | Sigma | D4527 | |
Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
Basic Fibroblast Growth Factor | PeproTech | 100-18B | |
Biotinylated Anti-human/mouse/rat Activin A Antibody | R&D Systems | BAM3381 | |
Gelatin | Sigma | G9391 | |
Human/Mouse/Rat Activin A MAb | R&D Systems | MAB3381 | |
0.05% Trypsin-EDTA | Gibco, Invitrogen | 25300-054 | |
Extra Thin Iris Scissors | FST | 14088-10 | |
Extra Fine Graefe Forceps | FST | 11150-10 | |
Pierse Fixation Forceps | FST | 18155-13 |