Kvaliteten på mus embryonale fibroblaster (MEFs) er diktert av rett stamme av mus som CF-1. Pluripotency-støttende MEFs og klimaanlegg media (CM) hentet fra disse bør inneholde optimale konsentrasjoner av activin A, Gremlin og Tgfβ1 nødvendig for activin / Nodal og FGF veier til samarbeide opprettholde selvfornyelse og pluripotency.
Generelt humane embryonale stamceller (hESCs) og menneskeskapte pluripotent stamceller (hiPSCs) en kan dyrkes under varierende forhold. Men det er ikke lett å etablere et effektivt system for dyrking disse cellene. Siden kultur forholdene kan påvirke genuttrykket som gir pluripotency i hESCs og hiPSCs, er optimalisering og standardisering av kulturen metoden avgjørende.
Etableringen av hESC linjer ble først beskrevet ved hjelp av MEFs som mater celler og fosterutvikling storfe serum (FBS)-holdig kultur medium to. Deretter ble FBS erstattet med knockout serum erstatning (KSR) og FGF2, som øker spredning av hESCs tre. Til slutt, mater-frie kultur systemer gjør dyrking celler på Matrigel-belagte plater i KSR-inneholder aircondition medium (medium betinget av MEFs) 4. Senere har hESCs kultur forholdene beveget seg mot mater-free kulturen på kjemisk å defineretert forhold 5-7. Dessuten har for å unngå potensiell forurensning av patogener og animalske proteiner kultur metoder ved hjelp av Xeno-frie komponenter er etablert 8.
For å oppnå bedre betingelser mus mater celler har blitt erstattet med menneskelige cellelinjer (f.eks fosterutvikling muskel og hud celler 9, voksne hudceller 10, foreskin fibroblaster 11-12, fostervann mesenkymalceller 13). Imidlertid er effektiviteten av å opprettholde udifferensierte hESCs med humant forhuden fibroblast-deriverte mater lag ikke like høy som fra mus mater celler på grunn av lavere sekresjon av activin En 14. Selvfølgelig, det er en tydelig forskjell i vekst faktor produksjon av mus og menneskelige mater celler.
Analyser av transcriptomes av mus og menneskelige mater celler viste signifikante forskjeller mellom støttende og ikke-støttende celler. Eksogene FGF2 er avgjørende for vedlikeholdening selvfornyelse av hESCs og hiPSCs, og har blitt identifisert som en nøkkelfaktor som regulerer uttrykket av Tgfβ1, activin A og Gremlin (en BMP antagonist) i mater celler. Activin A har vist seg å indusere uttrykk for OCT4, Sox2, og NANOG i hESCs 15-16.
For langsiktig kultur, kan hESCs og hiPSCs dyrkes på mitotisk inaktivert MEFs eller under mater-frie forhold i MEF-CM (MEF-condition Medium) på Matrigel-belagte plater for å opprettholde sin udifferensiert tilstand. Suksess for både kultur forholdene avhenger helt og fullt på kvaliteten av materen cellene, siden de direkte påvirker veksten av hESCs.
Her presenterer vi en optimalisert metode for isolering og kultur av mus embryonale fibroblaster (MEFs), utarbeidelse av kondisjonert medium (CM) og enzym-koblede immunsorbent analyse (ELISA) for å vurdere nivåene av activin A innenfor media.
Den MEFs isolasjon prosedyren som presenteres her gjør etableringen av en standardisert kultur betingelse for hESCs og hiPSCs. Videre ELISA-baserte system som brukes til å evaluere cytokin produksjon av mater celler er en nyttig indikator på kvaliteten på MEF-deriverte klimaanlegg media. Den rutinemessig vedlikehold av musa stamme (CF1) gir støtte fibroblaster er nødvendig for å unngå batch-til-batch variasjon av kultur media. Videre anbefales det å isolere embryoer fra flere mus samtidig å få konsistent kvalitet av celler. Gjerne fersk isolert MEFs kan fryses ved P0 og P1. Også inaktiveres MEFs kan fryses i alikvoter av passende mengder avhengig av hvilke krav til cellekultur. Vanligvis ca 250.000 celler bør belagt i en enkelt brønn av en 6-brønns plate til kultur hESCs og IPS celler. Det etablerte og optimalisert metode kan rutinemessig brukt for å minimere variasjonen mellom diffeleie eksperimenter.
The authors have nothing to disclose.
Spesiell takk til Dr. Boris Greber for å sette opp activin A ELISA protokoll som er offentliggjort i Greber et al. 2007. Vi er spesielt takknemlige til fru Monica Shevack for å utarbeide grafisk oversikt. Vi er veldig takknemlige til Dr Heiko Fuchs for all hjelp og verdifulle innspill før og under filming. Vi ønsker å takke alle medlemmer av Adjaye laboratoriet, spesielt Elisabeth Socha for å opprettholde en konstant tilførsel av MEFs og CM. Vi erkjenner også våre kolleger ved Dyreavdelingen av MPIMG for deres permanent støtte. Dette arbeidet ble delvis finansiert av The Max Planck Society og [BMBF; stipend nummer 0315717A], partnere av ERASysBio + initiativet støttes under EUs ERA-NET Plus ordningen i FP7.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
DMEM (High Glucose) | Gibco, Invitrogen | 41966-052 | |
FBS | Biochrom | S0115 | |
L-glutamine | Gibco, Invitrogen | 25030-024 | |
Penicillin-streptomycin | Gibco, Invitrogen | 15140-122 | |
Vacuum filter system | Corning | 431097 | 500 ml, 0.22 μm, PAS |
DMSO | Sigma | D2650 | |
Knockout DMEM | Gibco, Invitrogen | 10829-018 | |
Knockout Serum Replacement | Gibco, Invitrogen | 10828-028 | |
Non-Essential Amino Acids | Gibco, Invitrogen | 11140-035 | |
beta-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
PBS | Gibco, Invitrogen | 14190-169 | |
DNase I | Sigma | D4527 | |
Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
Basic Fibroblast Growth Factor | PeproTech | 100-18B | |
Biotinylated Anti-human/mouse/rat Activin A Antibody | R&D Systems | BAM3381 | |
Gelatin | Sigma | G9391 | |
Human/Mouse/Rat Activin A MAb | R&D Systems | MAB3381 | |
0.05% Trypsin-EDTA | Gibco, Invitrogen | 25300-054 | |
Extra Thin Iris Scissors | FST | 14088-10 | |
Extra Fine Graefe Forceps | FST | 11150-10 | |
Pierse Fixation Forceps | FST | 18155-13 |