Summary
Kvaliteten på mus embryonale fibroblaster (MEFs) er diktert av rett stamme av mus som CF-1. Pluripotency-støttende MEFs og klimaanlegg media (CM) hentet fra disse bør inneholde optimale konsentrasjoner av activin A, Gremlin og Tgfβ1 nødvendig for activin / Nodal og FGF veier til samarbeide opprettholde selvfornyelse og pluripotency.
Abstract
Generelt humane embryonale stamceller (hESCs) og menneskeskapte pluripotent stamceller (hiPSCs) en kan dyrkes under varierende forhold. Men det er ikke lett å etablere et effektivt system for dyrking disse cellene. Siden kultur forholdene kan påvirke genuttrykket som gir pluripotency i hESCs og hiPSCs, er optimalisering og standardisering av kulturen metoden avgjørende.
Etableringen av hESC linjer ble først beskrevet ved hjelp av MEFs som mater celler og fosterutvikling storfe serum (FBS)-holdig kultur medium to. Deretter ble FBS erstattet med knockout serum erstatning (KSR) og FGF2, som øker spredning av hESCs tre. Til slutt, mater-frie kultur systemer gjør dyrking celler på Matrigel-belagte plater i KSR-inneholder aircondition medium (medium betinget av MEFs) 4. Senere har hESCs kultur forholdene beveget seg mot mater-free kulturen på kjemisk å defineretert forhold 5-7. Dessuten har for å unngå potensiell forurensning av patogener og animalske proteiner kultur metoder ved hjelp av Xeno-frie komponenter er etablert 8.
For å oppnå bedre betingelser mus mater celler har blitt erstattet med menneskelige cellelinjer (f.eks fosterutvikling muskel og hud celler 9, voksne hudceller 10, foreskin fibroblaster 11-12, fostervann mesenkymalceller 13). Imidlertid er effektiviteten av å opprettholde udifferensierte hESCs med humant forhuden fibroblast-deriverte mater lag ikke like høy som fra mus mater celler på grunn av lavere sekresjon av activin En 14. Selvfølgelig, det er en tydelig forskjell i vekst faktor produksjon av mus og menneskelige mater celler.
Analyser av transcriptomes av mus og menneskelige mater celler viste signifikante forskjeller mellom støttende og ikke-støttende celler. Eksogene FGF2 er avgjørende for vedlikeholdening selvfornyelse av hESCs og hiPSCs, og har blitt identifisert som en nøkkelfaktor som regulerer uttrykket av Tgfβ1, activin A og Gremlin (en BMP antagonist) i mater celler. Activin A har vist seg å indusere uttrykk for OCT4, Sox2, og NANOG i hESCs 15-16.
For langsiktig kultur, kan hESCs og hiPSCs dyrkes på mitotisk inaktivert MEFs eller under mater-frie forhold i MEF-CM (MEF-condition Medium) på Matrigel-belagte plater for å opprettholde sin udifferensiert tilstand. Suksess for både kultur forholdene avhenger helt og fullt på kvaliteten av materen cellene, siden de direkte påvirker veksten av hESCs.
Her presenterer vi en optimalisert metode for isolering og kultur av mus embryonale fibroblaster (MEFs), utarbeidelse av kondisjonert medium (CM) og enzym-koblede immunsorbent analyse (ELISA) for å vurdere nivåene av activin A innenfor media.
Protocol
1. Isolering av mus embryonale Fibroblaster (MEFs)
Følgende to trinnene er utført under ikke-aseptiske forhold.
- Ofre en gravid mus (CF1, Harlan, USA) ved 13 eller 14 DPC (dag etter coitum) av cervical forvridning.
- Skjær ut livmor horn, kort skyll i 70% (v / v) etanol og fyll i en falk tube inneholder PBS uten Ca 2 + Mg 2 + (Gibco, Invitrogen).
Følgende trinn utføres i en vevskultur hette under aseptiske forhold og ved hjelp av sterile instrumenter.
- Plasser livmor horn inn i en petriskål, og skille hver embryo fra sin morkake og embryonal sac.
- Dissekere hode og røde organer, vask i PBS og plassere alle embryoer i en ren petriskål. Fint hakke vevet ved hjelp av en steril barberblad inntil det blir mulig å pipetten.
- Tilsett 1 ml 0,05% trypsin / EDTA (Gibco, Invitrogen), inklusivrende 100 Kunitz enheter av DNase I (USB), Per embryo.
- Overfør vevet inn i en 50 ml falk rør og inkuber i 15 min ved 37 ° C. Etter hver 5 min av inkubasjon, distansere celler ved pipettering opp og ned grundig.
- Inaktivere trypsin ved å legge om en mengde nylaget MEF medium.
MEF kultur medium (komponenter for å gjøre 500 ml media, bland alle komponenter og filter):
450 ml DMEM, 50 ml av FBS (10% (v / v)), 5 ml 200 mM L-glutamin (1/100 (v / v)), 5 ml Penicillin-streptomycin (1/100 (v / v)). - Sentrifuger cellene med lav hastighet (300 xg), 5 min, forsiktig fjerne supernatanten og resuspender cellepelleten i varm MEF medium.
- Plate omtrent en rekke celler som tilsvarer 3-4 embryoer i hver T150 (TPP) kolbe belagt med 0,2% gelatin (Gelatin fra storfe hud,, Sigma Type B) for 2 hr. De fibroblaster (P0, passasje 0) er de eneste cellene som har evnen til å feste til gelatin-belagte kolber. Ideelt sett celler er 80-90% konfluent etter 24 timer og på dette stadiet en stor del av P0 cellene er frosset for fremtidig bruk.
- Utvid resterende T150 kolben (e) P0 celler till P3 eller P4, så inaktivere og bruke som feeders til replate hESCs eller for å produsere kondisjonert medium (CM).
2. Inaktivering og Plating MEFs (mater Cells Klargjøring)
Alle trinn er gjennomført i en vevskultur hette under aseptiske forhold.
- Coat T150 kolber med 0,2% gelatin og Inkuber ved RT i minst 2 timer.
- Fortynn mitomycin C i PBS (1 mg / ml) og filter.
- Sug media fra MEFs og vask med PBS uten Ca 2 + Mg 2 +.
- Place 20 ml medium som inneholder 10 mikrogram / ml av mitomycin C på MEFs.
- Inkuber for 2 timer ved 37 ° C med mitomycin C inneholder medium vask deretter to ganger med PBS, trypsinize, sentrifuge (for 5 min ved 300 xg) og Resuspender celler i varm medium.
- Telle celler og plate på en tetthet på 56.000 celler / cm 2 i T150 kolber og bruke for CM produksjon for følgende 6 dager.
3. Kondisjonert Medium (CM) Forberedelser
Alle trinn er gjennomført i en vevskultur hette under aseptiske forhold.
- Dagen etter plating inaktivert MEFs ved en tetthet på 56.000 celler / cm 2 erstatte MEF medium med hESC medium (UM, unconditioned medium) (0,5 ml / cm 2) supplert med ferske 4 ng / ml FGF2.
- Samle CM fra mater kolbene etter 24 timers inkubering og legg frisk hESC medium inneholder 4 ng / ml av FGF2 til feeders.
- Gjenta denne prosedyren for de neste 6 dagene. Hver dag butikken samlet CM ved -20 ° C.
- Etter 6 dager Bland alle alikvoter av medium og filter (Corning, 0,22 mikrometer, PAS). Lag 50 ml alikvoter og oppbevares ved -80 ° C.
- Supplere CM med ytterligere 4 ng / ml FGF2 før du legger til hESCs dyrket på Matrigel. </ Li>
4. Måling av activin A i det betingede Media (ELISA) 15
- Bring alle prøver og reagenser til romtemperatur.
- Fortynn fange antistoff (Human \ Mouse \ Rat activin A MAB, R & D Systems) i PBS med 1% BSA, legge til mikroplate (100 mL / brønn) og inkuber overnatting på RT.
- Etter 24 timers vaske brønnene tre ganger med PBST (PBS med 0,05% Tween 20) (300 mL / brønn) da blokk (1% BSA / PBS, 300 mL / brønn) for en time ved RT.
- I denne tiden forberede en activin A (R & D Systems) standardkurve, inkludert 7 fortynninger (konsentrasjon under 30 ng / ml) og blindprøve. Den lineære rekkevidden av activin A er mellom 0,25 og 32 ng / ml.
- Legg duplikater av standarder og prøver å brønnene (100 mL / brønn) og inkuber for to timer på RT.
- Vask brønner tre ganger (300 mL av PBST).
- Legg den sekundære (biotinylated) antistoff (Human / Mus / Rotte Biotinylated activin A MAB, R & D Systems) (0.25 mikrogram / ml i 1% BSA / PBS) og inkuberes i 2 timer på RT.
- Vask brønner tre ganger (300 mL av PBST), legg streptavidin-HRP (utvannet i 1% BSA / PBS, R & D Systems) og inkuberes i 20 min ved RT.
- Vask brønner tre ganger (300 mL av PBST), tilsett 100 mL av substrat løsning (Quantikine, FoU Systems) og inkuberes i 30 min ved RT i mørket.
- Tilsett 100 mL av stop-løsning (Quantikine, R & D Systems) til hver brønn og bland forsiktig.
- Set Mikroplate leser (molekylære enheter Spectra 250 Max, Global Medical Instrumentation, Inc., Minnesota) til 450 nm, med bølgelengde korreksjon på 540 eller 570 nm, å bestemme optisk tetthet på hver brønn.
5. Representative Resultater
Den generelle ordningen for isolasjon prosedyren er presentert i Figur 1. Den typiske morfologi hESCs og hiPSCs dyrket under forskjellige forhold er presentert i figur 2. Den morfologi MEFs og inaktiverte mater celler som brukes til å forberede CM er presentert i figur 3. Generelt bør celler være konfluent 24 timer etter isolasjon og klar til å bli frosset eller utvides. Men noen ganger kan det ta 2-3 dager før du skaffer konfluent kulturer. Den CM bør være forberedt fra cellene ved passasje fire og ikke senere. Dette er avgjørende fordi primære celler kan bare bygges ut for 4-5 passeringer før utbruddet av senescence.
Cytokin, activin A, regnes som den mest kritiske faktoren utskilt av mater celler for støtte av udifferensiert vekst av pluripotent celler 14. Målingen av nivået på activin A i CM (figur 4) er en meget praktisk kvantitativ analyse for å overvåke kvaliteten på MEFs.
Figur 1. En skjematisk fremstilling av MEFs isolasjon prosedyren.
Figur 2. Den typiske morfologi udifferensierte hESCs dyrket i nærvær av (A) mater celler, (B) kondisjonert medium og (C) definert medium. Den typiske morfologi hiPSCs dyrket i nærvær av (D, E) mater celler.
Figur 3. Den typiske morfologi mus embryonale fibroblaster (MEFs). (A) Passage 0 (P0) to dager etter plating / isolering, (B) inaktivert mater lag ved en tetthet på 56.000 celler / cm. 2
Figur 4. Enzyme-linked immunsorbent analyse (ELISA)-baserte målinger av konsentrasjonen av activin A i kondisjonert medium (CM) prepared med mus embryonale fibroblaster derivert fra den CF1 mus belastning. CM var samlet i 6 dager og deretter samlet. CM "1" og CM "2" refererer til ulike grupper av medier og UM til unconditioned media. Som funksjon condition prosessen activin En utskillelse i medium ved MEFs, activin En er nesten umulig å oppdage i UM.
Discussion
Den MEFs isolasjon prosedyren som presenteres her gjør etableringen av en standardisert kultur betingelse for hESCs og hiPSCs. Videre ELISA-baserte system som brukes til å evaluere cytokin produksjon av mater celler er en nyttig indikator på kvaliteten på MEF-deriverte klimaanlegg media. Den rutinemessig vedlikehold av musa stamme (CF1) gir støtte fibroblaster er nødvendig for å unngå batch-til-batch variasjon av kultur media. Videre anbefales det å isolere embryoer fra flere mus samtidig å få konsistent kvalitet av celler. Gjerne fersk isolert MEFs kan fryses ved P0 og P1. Også inaktiveres MEFs kan fryses i alikvoter av passende mengder avhengig av hvilke krav til cellekultur. Vanligvis ca 250.000 celler bør belagt i en enkelt brønn av en 6-brønns plate til kultur hESCs og IPS celler. Det etablerte og optimalisert metode kan rutinemessig brukt for å minimere variasjonen mellom diffeleie eksperimenter.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Spesiell takk til Dr. Boris Greber for å sette opp activin A ELISA protokoll som er offentliggjort i Greber et al. 2007. Vi er spesielt takknemlige til fru Monica Shevack for å utarbeide grafisk oversikt. Vi er veldig takknemlige til Dr Heiko Fuchs for all hjelp og verdifulle innspill før og under filming. Vi ønsker å takke alle medlemmer av Adjaye laboratoriet, spesielt Elisabeth Socha for å opprettholde en konstant tilførsel av MEFs og CM. Vi erkjenner også våre kolleger ved Dyreavdelingen av MPIMG for deres permanent støtte. Dette arbeidet ble delvis finansiert av The Max Planck Society og [BMBF; stipend nummer 0315717A], partnere av ERASysBio + initiativet støttes under EUs ERA-NET Plus ordningen i FP7.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (High Glucose) | Gibco, Invitrogen | 41966-052 | |
| FBS | Biochrom | S0115 | |
| L-glutamine | Gibco, Invitrogen | 25030-024 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco, Invitrogen | 15140-122 | |
| Vacuum filter system | Corning | 431097 | 500 ml, 0.22 μm, PAS |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Knockout DMEM | Gibco, Invitrogen | 10829-018 | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco, Invitrogen | 10828-028 | |
| Non-Essential Amino Acids | Gibco, Invitrogen | 11140-035 | |
| beta-Mercapt–thanol | Sigma | M7522 | |
| PBS | Gibco, Invitrogen | 14190-169 | |
| DNase I | Sigma | D4527 | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor | PeproTech | 100-18B | |
| Biotinylated Anti-human/mouse/rat Activin A Antibody | R&D Systems | BAM3381 | |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| Human/Mouse/Rat Activin A MAb | R&D Systems | MAB3381 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco, Invitrogen | 25300-054 | |
| Extra Thin Iris Scissors | FST | 14088-10 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | FST | 11150-10 | |
| Pierse Fixation Forceps | FST | 18155-13 |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Amit, M. Clonally derived human embryonic stem cell lines maintain pluripotency and proliferative potential for prolonged periods of culture. Dev. Biol. 227, 271-278 (2000).
- Xu, C. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).
- Ludwig, T. E. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat. Biotechnol. 24, 185-187 (2006).
- Yao, S. Long-term self-renewal and directed differentiation of human embryonic stem cells in chemically defined conditions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 6907-6912 (2006).
- Lu, J., Hou, R., Booth, C. J., Yang, S. H., Snyder, M. Defined culture conditions of human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 5688-5693 (2006).
- Skottman, H., Hovatta, O. Culture conditions for human embryonic stem cells. Reproduction. 132, 691-698 (2006).
- Richards, M., Fong, C. Y., Chan, W. K., Wong, P. C., Bongso, A. Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 20, 933-936 (2002).
- Richards, M. Comparative evaluation of various human feeders for prolonged undifferentiated growth of human embryonic stem cells. Stem Cells. 21, 546-556 (2003).
- Amit, M. Human feeder layers for human embryonic stem cells. Biol. Reprod. 68, 2150-2156 (2003).
- Inzunza, J. Derivation of human embryonic stem cell lines in serum replacement medium using postnatal human fibroblasts as feeder cells. Stem Cells. 23, 544-549 (2005).
- Zhang, K. Utilization of Human Amniotic Mesenchymal Cells as Feeder Layers to Sustain Propagation of Human Embryonic Stem Cells in the Undifferentiated State. Cell Reprogram. , (2011).
- Eiselleova, L. Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells. Int. J. Dev. Biol. 52, 353-363 (2008).
- Greber, B., Lehrach, H., Adjaye, J. Fibroblast growth factor 2 modulates transforming growth factor beta signaling in mouse embryonic fibroblasts and human ESCs (hESCs) to support hESC self-renewal. Stem Cells. 25, 455-464 (2007).
- Vallier, L., Alexander, M., Pedersen, R. A. Activin/Nodal and FGF pathways cooperate to maintain pluripotency of human embryonic stem cells. J. Cell Sci. 118, 4495-4509 (2005).
