Kvaliteten hos mus embryonala fibroblaster (MEF) bestäms av den högra musstam såsom CF-1. Pluripotens-stödjande MEF och konditionerat medium (CM) som erhållits från dessa bör innehålla optimala koncentrationer av Aktivin A, Gremlin och Tgfβ1 behövs för Activin / Nodal och FGF vägar till kooperativt hålla självförnyelse och pluripotens.
I allmänhet (hiPSCs) humana embryonala stamceller (hESCs) och humana inducerade pluripotenta stamceller 1 kan odlas under varierande förhållanden. Det är dock inte lätt att skapa ett effektivt system för odling av dessa celler. Eftersom odlingsbetingelser kan påverka genuttryck som ger pluripotens i hESCs och hiPSCs är optimering och standardisering av odlingsmetoden avgörande.
Upprättande av hESC linjer beskrevs först genom användning av MEF som matarceller och fetalt bovint serum (FBS)-innehållande odlingsmedium 2. Därefter FBS ersattes med knockout serumersättning (KSR) och FGF2, vilket ökar spridningen av hESCs 3. Slutligen, matare-fria kultur gör det möjligt för odling av celler på Matrigel-belagda plattor i KSR-innehållande medium (medium beroende av MEF) 4. Därefter har hESCs odlingsbetingelser rört sig mot feeder-fri kultur i kemiskt tydligt definieraed förhållanden 5-7. Dessutom har för att undvika eventuella föroreningar av patogener och animaliskt protein kultur metoder med xeno-fria komponenter fastställts 8.
För att få förbättrade villkor mus feeder celler har ersatts med humana cellinjer (t.ex. foster muskel-och hudceller 9, vuxna hudceller 10, förhudsfibroblaster 11-12, amniotiska mesenkymala celler 13). Emellertid är effektiviteten hos bibehålla odifferentierade hESCs med användning av humant förhudsfibroblast-härledda matarskikt inte så hög som den från musceller feeder på grund av den lägre nivån av utsöndring av Aktivin A 14. Uppenbarligen finns det en uppenbar skillnad i tillväxtfaktor produktion av mus-och humana matarceller.
Analyser av transcriptomes av mus-och humana celler feeder avslöjade signifikanta skillnader mellan stöd-och icke-stödjande celler. Exogena FGF2 är avgörande för bibeNing självförnyelse av hESCs och hiPSCs och har identifierats som en viktig faktor som reglerar uttrycket av Tgfβ1, Activin A och Gremlin (en BMP-antagonist) i matarceller. Aktivin A har visat sig inducera uttryck av Oct4, SOX2, och NANOG i hESCs 15-16.
För långsiktig kultur kan hESCs och hiPSCs odlas på mitotiskt inaktiverat MEF eller under matare-fria förhållanden i MEF-CM (MEF-konditionerat medium) på Matrigel-belagda plattor för att behålla sin odifferentierade tillstånd. Framgång för både odlingsbetingelser beror helt på kvaliteten på feeder celler, eftersom de direkt påverkar tillväxten av hESCs.
Här presenterar vi en optimerad metod för isolering och odling av mus embryonala fibroblaster (MEF), förberedelse av konditionerat medium (CM) och enzym-linked immunosorbent analys (ELISA) för att bedöma halterna av Aktivin A inom media.
Det MEF isoleringsförfarandet presenteras här gör det möjligt att inrätta en standardiserad kultur förutsättning för hESCs och hiPSCs. Dessutom ELISA-system användes för att utvärdera cytokinproduktion genom matarceller är en användbar indikator på kvaliteten av de MEF-härledda konditionerade media. Rutinen underhållet av musstammen (CF1) tillhandahålla styrkande fibroblaster är nödvändigt för att undvika sats till sats variation av kultur media. Vidare är det rekommenderat att isolera embryon från flera möss samtidigt för att erhålla en jämn kvalitet hos celler. Visst nyisolerade MEF kan hållas frysta vid P0 och P1. Även inaktiveras MEF kan förvaras fryst i portioner av lämpliga mängder beroende på kraven för cellodling. Vanligen ca 250,000 celler bör pläterades i en enda brunn av en 6-brunnsplatta för att odla hESCs och iPS-celler. Den etablerade och optimeras metod kan rutinmässigt används för att minimera variabiliteten melhyra experiment.
The authors have nothing to disclose.
Speciellt tack till Dr Boris Greber för att ställa in Aktivin A ELISA-protokoll som publiceras i Greber et al. 2007. Vi är särskilt tacksamma för Mrs Monica Shevack för att förbereda grafisk översikt. Vi är mycket tacksamma till Dr Heiko Fuchs för all hjälp och värdefulla förslag före och under filmandet. Vi vill tacka alla medlemmar i Adjaye laboratoriet, särskilt Elisabeth Socha för att bibehålla en konstant tillförsel av MEF och CM. Vi erkänner också våra kollegor på djuret anläggningen av MPIMG för deras permanent stöd. Detta arbete har delvis finansierats av Max Planck-sällskapet och [BMBF, licensnummer 0315717A], partner inom ERASysBio + initiativet att stödjas av EU ERA-NET plus i FP7.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
DMEM (High Glucose) | Gibco, Invitrogen | 41966-052 | |
FBS | Biochrom | S0115 | |
L-glutamine | Gibco, Invitrogen | 25030-024 | |
Penicillin-streptomycin | Gibco, Invitrogen | 15140-122 | |
Vacuum filter system | Corning | 431097 | 500 ml, 0.22 μm, PAS |
DMSO | Sigma | D2650 | |
Knockout DMEM | Gibco, Invitrogen | 10829-018 | |
Knockout Serum Replacement | Gibco, Invitrogen | 10828-028 | |
Non-Essential Amino Acids | Gibco, Invitrogen | 11140-035 | |
beta-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
PBS | Gibco, Invitrogen | 14190-169 | |
DNase I | Sigma | D4527 | |
Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
Basic Fibroblast Growth Factor | PeproTech | 100-18B | |
Biotinylated Anti-human/mouse/rat Activin A Antibody | R&D Systems | BAM3381 | |
Gelatin | Sigma | G9391 | |
Human/Mouse/Rat Activin A MAb | R&D Systems | MAB3381 | |
0.05% Trypsin-EDTA | Gibco, Invitrogen | 25300-054 | |
Extra Thin Iris Scissors | FST | 14088-10 | |
Extra Fine Graefe Forceps | FST | 11150-10 | |
Pierse Fixation Forceps | FST | 18155-13 |