에 낭성 섬유증의 transmembrane의 전도성 조정기 (CFTR)를 표현하는 시도<em> Saccharomyces cerevisiae</em> 지금까지, 단백질의 상대적으로 낮은 금액을 굴복했습니다. 낭성 섬유증 재단을 통해 배포되는이 프로토콜과 관련 시약이 '어려운'진핵세포 막 단백질의 밀리그램 양의 준비를 허용해야합니다.
낭성 섬유증의 transmembrane의 전도성 조정기 (CFTR)가 변이된 때, 따라서이 단백질에 상당한 관심이있다 humans.There의 낭성 섬유증을 야기할 수있는 염화물 채널이지만, 그 구조 및 활동을 연구하기위한 노력이 어려움에 의해 방해되었다 1-3 단백질의 충분한 양을 표현과 정화의. 많은 '어려운'진핵세포 멤브레인 단백질과 마찬가지로 빠르게 성장하는 유기체의 표현이 바람직하지만, 도전이며, 효모 S.의 cerevisiae는 지금까지 낮은 금액이 취득되었으며 재조합 단백질의 급격한 저하는 4-9을 관찰했다. 효모에서 재조합 CFTR의 처리에 관련된 단백질은 6-9를 설명하고있다.이 보고서에 따르면 우리는 상당한 금액의 효모와 정화의 CFTR의 표현을위한 방법론을 설명합니다. 프로토콜은 이전 proteolysis 문제를 극복할 수있는 방법을 설명하는 방법과 표현 수준CFTR은 크게 세포 수확 이전 특정 기간 동안, 세포 성장 조건을 수정하여하고 유도 조건을 제어함으로써 향상시킬 수 있습니다. 이 프로토콜 (murine CFTR은 – 표현 효모 세포 또는 효모 plasmids)이 연구를 후원했다 미국 낭성 섬유증 재단을 통해 배포됩니다 연관된 reagants. CFTR의 디자인과 합성이 보고서에 사용된 개념 설명 문서 (.; Thibodeau, P. 외, 게시되지 않은 Urbatsch, 전) 별도로 게시됩니다. 플라스미드 포함 효모 (그림 1) -이 문서에서 우리는 CFTR은 구조와 효모 세포의 변화와 우리의 방법으로 시작을 설명합니다. 구조는 10의 C-말단에서 CFTR하는 융합 녹색 형광 단백질 (GFP) 시퀀스를 가지고 있으며, 드류 외 개발한 시스템을 따르고 있습니다. (2008). GFP는 CFTR의 표현과 정화가 비교적 쉽게 따라 할 수 있습니다. 주피터 시각 protoc효모 세포로부터 microsomes의 준비 후 똑똑한 마감재, 우리 microsomes에서 단백질의 정화를위한 몇 가지 제안을 포함 있지만. 독자들은 단백질과 그들에게 제공 로컬 장비로 실시되는 최종 실험에 의존 microsome 정화 절차로 자신의 수정 사항을 추가하실 수 있습니다. 효모-표현 CFTR 단백질이 부분적으로 내장 polyhistidine 정화 태그를 사용하여 금속 이온 친화도 크로마 토그래피를 사용하여 투석을 할 수 있습니다. 후속 크기 배제 크로마 토그래피는 SDS-PAGE와 젤의 Coomassie-염색법에 의해 판단,> 90% 순수한 것 같습니다 단백질을 듭니다.
본 논문은 낭성 섬유증에 대한 연구를 촉진해야 효모 세포의 murine CFTR 단백질의 표현 방법을 제공합니다. 목적은 낭성 섬유증 재단 (을 통해 사용할 수 murine CFTR 유전자 구조의 릴리스로이 논문을 연결하는 것입니다 http://www.cff.org/research/CFFT/ ). 기타 orthologs 나중에 사용할 수있게됩니다. CFTR 함유 벡터와 효모 세포의 변환은 간단하지만, CFTR 높은 수준을 표현 식민지를위한 화면으로 중요합니다. 가변 표현 수준은 여러 가지 요인에서 발생할 수 있지만, 플라스미드 당 세포의 매수는 아마도 변화의 상당 정도를 차지하고 있습니다. 여기에 설명된 중요한 단계는 CFTR-표현 효모 세포와 microsomal 세포막을 CFTR 함유의 생산을 허용해야합니다. 일단 변형, 성장, 수확 및 효모 세포의 용해는 purif는 마스터했습니다단백질의 ication이 가능해야하고, 그림 3에서 우리는 유용한 벤치 마크로서이 경우에 달성해야 순수의 예제를 받고 있습니다. 그것은 단백질의 정제에 대한 자세한 방법론을 제공하기 위해 본 논문에서 우리 의도는 아닙니다. 그러나, 거기에 이러한 세포 용해 및 microsome 정화 등 S.cerevisae 표현 시스템에만 해당하는 몇 가지 중요한 다운 스트림 정화 단계이며, 이들은이 논문에서 자세히 포함되었습니다. 그것은 언급해야하지만, 따로 우리가 사용한 두 가지 방법에서 대체 효모 세포 파괴 방법은 같은 프랑스 압력 세포의 사용으로, 고용 수있다. 재조합 단백질은 단백질 (그림 4) 유도 후 추적할 수 있도록 TEV-cleavable의 C-말단 GFP 도메인을 가지고 있습니다. 효모 같은 조건 11이 이하 fluoresces는 유용한 상호를 제공할 수있는 고유 70kDa 단백질 (아마도 탈수소 12 호박산)가전체 세포 추출물이나 microsomes에서 CFTR의 상대 발현 레벨 nal 교정 표준 (그림 3). 그것은 갈락토 오스와 유도 후 세포 수확의시기가 중요한 것이 그림 4에 표시된 데이터에서 분명하다. CFTR 드롭의 수확량이 급격히 유도의 16에 대한 시간 후, 효모 세포에 감지 CFTR는 유도 24 시간 후에 거의가되도록.
단백질 정제의 수율은 15리터 발효기 배양 당 1-2mg CFTR 단백질에 관한 것입니다. 복구는 microsome 무대로 총 CFTR-GFP 단백질 최대의 70 % 정도로 추산하고, 단백질을 정제의 약 25 %의 복구를 할 수 있습니다. S.의 Characterisation cerevisiae – 표현 CFTR가 아직 진행 중입니다. 다른 이름으로 그림에서 본. 4 세포에서 단백질의 위치는 형광 현미경으로 모니터링할 수 있습니다. 형광의 정도가 예상되는 10 셀 주변으로 발견되지만 단백질 중 일부는 작은 반점이있는 로컬 라이제이션을 표시에서하거나, 또는단지 늦게 잠돌군 Zz / endosomal 통로 14 아마 응급실 4 교통 vesicles의 신진의 구획 스트림을 통해 재활용 CFTR 때문에 될 수 플라즈마 막 내부. PNGaseF, 단백질 deglycosylates 효소와 치료가 unglycosylated되는 뜻인, SDS-PAGE에서 CFTR 단백질 밴드의 마이 그 레이션에 최소한의 변화를 보여주거나 최소한의 글리코 실화 15있다. 단백질의 인산화 상태에 대한 실험이 진행되고 있습니다. 지금까지 테스트한 세제의 일부에 정화 단백질은 이전에 2,15을 발표 이들과 유사한 속도로 (그것은 CFTR 특정 억제제를 16에 의해 저해되는) ATPase의 활동을 표시합니다. CFTR 채널 활동의 측정은 비교적 높은 임계 마이셀 농도 (CMC) 17이 세제의 마지막 정화 단계를 의미하는 것이 정화 단백질의 reconstitution 필요합니다. 효모는 containin을 microsomesg CFTR 같은 일반적으로 '약한'것으로 간주되어 dodecyl maltoside 2 등 세제를 포함한 여러 일반적으로 고용 세제 18로 solublised 수 있습니다. 그러나 가장 높은 CMC 세제는 이러한 세제로 그 교류는 어떠한 정화 체계의 늦은 단계에서 고려되어야 제안, 지금까지 solubilsation 대한 비효율적일 수있다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 CFTR 3D 구조 컨소시엄 (보조금 번호 FORD08XX0)를 통해이 작품을 자금에 대한 낭성 섬유증 재단 (CFF)을 감사드립니다. 우리는 CFTR 유전자의 디자인 특히,이 작품에 대한 컨소시엄 내의 모든 동료들의 거대한 공헌을 인정합니다. 우리는 또한 Drs의 소중한 기여를 인정합니다. 제임스 Birtley (NCSR Demokritos, 그리스), 마크 영 (카디프 대학교, 영국)과 데이비드 드류 (임페리얼 칼리지, 런던, 영국) 작업의 초기 단계 인치 우리는 특히 원고의 비판적 읽기를 위해 박사 인애 Urbatsch (텍사스 테크. 대학, Lubbock)에 감사드립니다.
Name of reagent/equipment | Company | Catalogue No |
FGY217 S.cerevisiae strain, with pep4 deletion 10 | ||
Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0410 |
Complete supplement mixture without uracil | Formedium | DCS0169 |
Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306 |
D-galactose | Fisher | BP656-500 |
D-glucose | Fisher | D16-500 |
Pepstatin A | Sigma-Aldrich | P4265 |
Leupeptin | Merck | 108975 |
Chymostatin | Sigma-Aldrich | C7268 |
Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 |
Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64) | Sigma-Aldrich | E3132 |
Aminoethylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF) | Sigma-Aldrich | A8456 |
Benzamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 434760 |
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 |
dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 |
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher | BP120500 |
Tris-base | Formedium | TRIS01 |
Tris-HCl | Fisher | P631 |
D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 |
Glycerol | Fisher | 065017 |
NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 |
n-dodecyl-β-D-maltopyranoside | Affymetrix | D310S |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 |
PageRuler Plus prestained protein standards | Fermentas | SM1811 |
NuSep tris-gly 4-20% gradient gels | NuSep | NB10-420 |
Instant Blue Coomassie Stain | Novexin | ISB1L |
Glass beads, acid washed | Sigma | G8772 |
50ml Sterile Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.254 |
2ml Sterile screw-top vials | Sarstedt | 72.694.005 |
250ml Sterile Erlenmeyer baffled flasks | BD Biosciences | 355119 |
2l Sterile Erlenmeyer baffled flasks | BD Biosciences | 355131 |
2ml microfuge tubes | Sarstedt | 72.695 |
0.2μM syringe filter | Sartorius | FC121 |
ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355618 |
centrifuge tubes | Beckman Coulter | 357000 |
1l centrifuge pots | Beckman Coulter | 969329 |
Orbital shaking incubator with temperature control | New Brunswick Scientific | |
Deltavision RT restoration microscope | Applied Vision | |
Benchtop centrifuge | HERMLE | Z300 |
Benchtop microfuge | Fisher | 13-100-511 |
Vortex mixer | Star Labs | |
Typhoon Trio Scanner | GE Healthcare | 63-0055-87 |
LAS3000 imaging system | Fuji | |
20l fermenter vessel and control unit | Applikon | |
Constant systems cell disrupter | Constant systems | |
Beadbeater cell disrupter | BioSpec | 1107900 |
Mini-beadbeater-16 | BioSpec | 607 |
JA-17 rotor | Beckman Coulter | 369691 |
Optima L-100 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392050 |
50.2Ti rotor | Beckman Coulter | 337901 |