Los intentos para expresar la transmembrana de la fibrosis quística regulador de la conductancia (CFTR) en<em> Saccharomyces cerevisiae</em>, Hasta ahora, dado cantidades relativamente bajas de proteína. Este protocolo y los reactivos asociados distribuidos a través de la Fundación de Fibrosis Quística debe permitir la preparación de cantidades de miligramos de esta "difícil" proteína de la membrana eucariota.
La fibrosis quística transmembrana regulador de la conductancia (CFTR) es un canal de cloruro, que cuando está mutado, puede dar lugar a la fibrosis quística en humans.There es por lo tanto, un considerable interés en esta proteína, pero los esfuerzos para estudiar su estructura y actividad se han visto obstaculizados por la dificultad de expresión y purificación de cantidades suficientes de la proteína 1-3. Al igual que muchos de los difíciles de proteínas de membrana eucariotas, la expresión en un organismo de crecimiento rápido es deseable, pero difícil, y en la levadura S. cerevisiae, hasta ahora cantidades bajas se obtuvieron y una rápida degradación de la proteína recombinante se observó 4-9. Las proteínas involucradas en el procesamiento de CFTR en la levadura recombinante se han descrito 6.9. En este informe se describe una metodología para la expresión de CFTR en la levadura y su purificación en cantidades significativas. El protocolo describe cómo los problemas de la proteólisis anteriores se pueden superar y cómo los niveles de expresión deCFTR puede ser mejorado mediante la modificación de las condiciones de crecimiento de células y mediante el control de las condiciones de inducción, en particular, el período de tiempo antes de la recolección de células. Los reagants asociados con este protocolo (CFTR murino que expresan las células de levadura o plásmidos de levadura) se distribuyen a través de los EE.UU. Fundación de Fibrosis Quística, que ha patrocinado la investigación. Un artículo que describe el diseño y síntesis de la CFTR constructo empleado en el presente informe se publicará por separado (Urbatsch, I.;. Thibodeau, P. et al, inédito). En este artículo vamos a explicar nuestro método de inicio de la transformación de las células de levadura con la construcción de CFTR – la levadura que contiene el plásmido (Fig. 1). La construcción cuenta con una proteína verde fluorescente (GFP) fusionada a la secuencia CFTR en su extremo C-terminal y sigue el sistema desarrollado por Drew et al. (2008) 10. El GFP permite la expresión y purificación de CFTR que debe seguirse con relativa facilidad. El protoc Jove visualizaracabados ol después de la preparación de microsomas de las células de levadura, aunque incluyen algunas sugerencias para la purificación de la proteína a partir de los microsomas. Los lectores pueden añadir sus propias modificaciones en el procedimiento de purificación de microsomas, depende de los experimentos finales que se llevarán a cabo con la proteína y el equipo local a su disposición. La levadura expresa la proteína CFTR puede ser parcialmente purificada usando iones metálicos cromatografía de afinidad, usando una etiqueta polihistidina depuración intrínseca. Después de exclusión por tamaño cromatografía produce una proteína que parece ser> 90% de pureza, según se juzga por SDS-PAGE y tinción con Coomassie del gel.
Este documento proporciona un método para la expresión de proteína CFTR murino en células de levadura, que debería facilitar la investigación sobre la fibrosis quística. El objetivo es vincular este trabajo con el lanzamiento de la construcción de ratón CFTR ADN, que estará disponible a través de la Fundación de Fibrosis Quística ( http://www.cff.org/research/CFFT/ ). Otros orthologs debería estar disponible más tarde. La transformación de las células de levadura con el vector que contiene CFTR es sencillo, pero es importante para la detección de colonias que expresan altos niveles de CFTR. Niveles variables de expresión pueden derivarse de varios factores, pero el número de copias del plásmido por célula probablemente representa un importante grado de variación. Los pasos críticos que se describen aquí debe permitir la producción de CFTR que expresan las células de levadura y que contienen membranas microsomales CFTR. Una vez que la transformación, crecimiento, cosecha y la lisis de las células de levadura han sido dominadas, Purificación de la proteína debe ser posible, y en la Figura 3 se ha dado un ejemplo de la pureza que debe ser alcanzable en este caso como una referencia útil. No es nuestra intención en este manuscrito para proporcionar una metodología detallada para la purificación de la proteína. Sin embargo, hay algunos pasos críticos intermedios de purificación que son específicos para el sistema de expresión S.cerevisae, tales como la lisis celular y purificación microsoma, y éstos se han incluido en detalle en este manuscrito. Cabe mencionar, sin embargo, que, aparte de los dos métodos que hemos utilizado, alternativas de levadura métodos ruptura celular pueden ser empleados, tales como el uso de una célula de presión Francesa. La proteína recombinante tiene una TEV-escindible dominio C-terminal GFP que permite que la proteína a ser rastreados después de la inducción (fig. 4). La levadura tiene una proteína intrínseca 70kDa (probablemente succinato deshidrogenasa 12) que presenta fluorescencia bajo las mismas condiciones 11, y esto puede proporcionar una herramienta útil entreestándar de calibración nal para los niveles de expresión relativos de CFTR en extractos de células enteras o microsomas (fig. 3). Es evidente a partir de los datos mostrados en la Figura 4 que el momento de la recolección de células después de la inducción con galactosa es crucial. Los rendimientos de caída de CFTR precipitadamente después de aproximadamente 16 horas de inducción, de modo que apenas hay CFTR detectable en células de levadura después de 24 horas de inducción.
El rendimiento de proteína purificada es de aproximadamente 1-2mg proteína CFTR por 15 litros cultura fermentador. La recuperación puede ser estimado como aproximadamente 70% del total de CFTR-proteína GFP hasta la fase de microsoma, y alrededor del 25% de recuperación de la proteína purificada. Caracterización de la S. cerevisiae, expresó CFTR está en curso. Como se ve en la fig. 4, la localización de la proteína en la célula puede ser controlado por microscopía de fluorescencia. Aunque gran parte de la fluorescencia se encuentra alrededor de la periferia de la célula como se esperaba 10, parte de la proteína muestra una localización puntiforme, ya sea en ojusto dentro de la membrana plasmática, que podría ser debido a CFTR de reciclaje a través de una tarde de Golgi / endosomal vía 14 o tal vez un compartimiento posterior de la brotación de las vesículas de transporte de la sala de emergencia 4. El tratamiento con PNGasaF, una enzima que deglycosylates proteínas, mostró un cambio mínimo en la migración de la banda de proteína CFTR en SDS-PAGE, lo que implica que se no glicosilada, o tiene glicosilación mínima 15. Los experimentos en el estado de fosforilación de la proteína están en marcha. En algunos de los detergentes ensayadas hasta ahora, la proteína purificada muestra la actividad de ATPasa (que es inhibida por un inhibidor específico CFTR 16) a tasas que son similares a los publicados anteriormente 2,15. Medición de la actividad del canal CFTR requerirá la reconstitución de la proteína purificada, lo que implica una etapa de purificación final en un detergente que tiene una concentración crítica de micelas relativamente alta (CMC) 17. Levadura microsomas containing CFTR puede solublised con varios detergentes comúnmente empleados 18, incluyendo detergentes como dodecilsulfato maltósido 2, que son generalmente considerados como "suave". Sin embargo la mayoría de los detergentes cmc alta han demostrado ser ineficientes para solubilsation, hasta ahora, lo que sugiere que el intercambio en estos detergentes deben ser considerados en una etapa tardía en cualquier esquema de purificación.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a la Fundación de Fibrosis Quística (CFF) para la financiación de este trabajo a través de su Consorcio CFTR Estructura 3D (el número de concesión FORD08XX0). Reconocemos la enorme contribución de todos nuestros colegas en el Consorcio a este trabajo, en particular en el diseño de los genes CFTR. También reconocemos la valiosa contribución de los Dres. James Birtley (NCSR Demócrito, Grecia), Mark Young (Universidad de Cardiff, Reino Unido) y David Drew (Imperial College de Londres, Reino Unido) en las primeras etapas de la obra. Agradecemos especialmente a la Dra. Ina Urbatsch (Texas Tech. Universidad de Lubbock) para la lectura crítica del manuscrito.
Name of reagent/equipment | Company | Catalogue No |
FGY217 S.cerevisiae strain, with pep4 deletion 10 | ||
Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0410 |
Complete supplement mixture without uracil | Formedium | DCS0169 |
Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306 |
D-galactose | Fisher | BP656-500 |
D-glucose | Fisher | D16-500 |
Pepstatin A | Sigma-Aldrich | P4265 |
Leupeptin | Merck | 108975 |
Chymostatin | Sigma-Aldrich | C7268 |
Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 |
Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64) | Sigma-Aldrich | E3132 |
Aminoethylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF) | Sigma-Aldrich | A8456 |
Benzamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 434760 |
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 |
dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 |
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher | BP120500 |
Tris-base | Formedium | TRIS01 |
Tris-HCl | Fisher | P631 |
D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 |
Glycerol | Fisher | 065017 |
NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 |
n-dodecyl-β-D-maltopyranoside | Affymetrix | D310S |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 |
PageRuler Plus prestained protein standards | Fermentas | SM1811 |
NuSep tris-gly 4-20% gradient gels | NuSep | NB10-420 |
Instant Blue Coomassie Stain | Novexin | ISB1L |
Glass beads, acid washed | Sigma | G8772 |
50ml Sterile Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.254 |
2ml Sterile screw-top vials | Sarstedt | 72.694.005 |
250ml Sterile Erlenmeyer baffled flasks | BD Biosciences | 355119 |
2l Sterile Erlenmeyer baffled flasks | BD Biosciences | 355131 |
2ml microfuge tubes | Sarstedt | 72.695 |
0.2μM syringe filter | Sartorius | FC121 |
ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355618 |
centrifuge tubes | Beckman Coulter | 357000 |
1l centrifuge pots | Beckman Coulter | 969329 |
Orbital shaking incubator with temperature control | New Brunswick Scientific | |
Deltavision RT restoration microscope | Applied Vision | |
Benchtop centrifuge | HERMLE | Z300 |
Benchtop microfuge | Fisher | 13-100-511 |
Vortex mixer | Star Labs | |
Typhoon Trio Scanner | GE Healthcare | 63-0055-87 |
LAS3000 imaging system | Fuji | |
20l fermenter vessel and control unit | Applikon | |
Constant systems cell disrupter | Constant systems | |
Beadbeater cell disrupter | BioSpec | 1107900 |
Mini-beadbeater-16 | BioSpec | 607 |
JA-17 rotor | Beckman Coulter | 369691 |
Optima L-100 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392050 |
50.2Ti rotor | Beckman Coulter | 337901 |