Summary
ניסיונות להביע סיסטיק פיברוזיס הטרנסממברני הרגולטור המוליכות (CFTR) ב
Abstract
סיסטיק פיברוזיס הטרנסממברני הרגולטור המוליכות (CFTR) הוא ערוץ כלוריד, כי כאשר מוטציה, יכול להצמיח סיסטיק פיברוזיס ב humans.There ולכן עניין רב חלבון זה, אבל המאמצים ללמוד את המבנה שלה ואת הפעילות כבר הקשו על ידי קושי להביע וטיהור כמות מספקת של חלבון 1-3. כמו הרבה חלבונים "קשה" קרום האיקריוטים, ביטוי באורגניזם בצמיחה מהירה רצוי, אבל מאתגר, וגם את השמרים ס cerevisiae, עד כה התקבלו סכומים נמוכים והשפלה מהיר של חלבון רקומביננטי נצפתה 4-9. חלבונים המעורבים בעיבוד של CFTR רקומביננטי בשמרים תוארו 6-9. בדו"ח זה אנו מתארים מתודולוגיה ביטוי CFTR בשמרים וטיהור שלה בכמויות משמעותיות. הפרוטוקול מתאר כיצד הבעיות proteolysis קודמות ניתן להתגבר וכיצד רמות הביטוי שלCFTR ניתן לשפר באופן משמעותי את הצמיחה על ידי שינוי תנאי התא על ידי שליטה בתנאי אינדוקציה, בתקופת זמן מסוימת לפני קצירת התא. את reagants הקשורות לפרוטוקול זה (Murine CFTR-לבטא בתאי שמרים או פלסמידים שמרים) יופץ באמצעות פיברוזיס סיסטיק ארה"ב קרן, אשר מימנה את המחקר. מאמר המתאר את עיצוב וסינתזה של CFTR לבנות המועסקים דו"ח זה יפורסם בנפרד (Urbatsch, י,. Thibodeau, פ ואח', לא פורסם). במאמר זה נסביר תחילת השיטה שלנו עם המעבר של התאים שמרים עם CFTR לבנות - השמרים המכיל פלסמיד (איור 1). יש לבנות את חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) רצף התמזגו כדי CFTR בתחנה הסופית C-שלה מלווה את המערכת שפותחה על ידי דרו et al. (2008) 10. GFP מאפשר ביטוי וטיהור של CFTR להיות אחריו בקלות יחסית. Protoc יופיטר דמיינוגימורים ol לאחר הכנת microsomes מן בתאי שמרים, אם כי אנו כוללים מספר הצעות טיהור של חלבון מן microsomes את. לקוראים מומלץ להוסיף שינויים משלהם הליך טיהור גופיפון, תלוי את הניסויים הסופיים להתבצע עם חלבון ו ציוד המקומית לרשותם. שמרים לידי ביטוי חלבון CFTR יכול להיות מטוהרים באופן חלקי מתכת באמצעות יונים זיקה כרומטוגרפיה, באמצעות תג פנימי לטיהור polyhistidine. כרומטוגרפיה לאחר בגודל הדרה מניב חלבון נראה> 90% טהור, נשפט על ידי SDS-PAGE ו-Coomassie מכתים של ג'ל.
Protocol
1. הכנת התקשורת חוצצי
- YNB: עבור 1 ליטר, 6.9 להשעות חנקן גרם שמרים ללא בסיס חומצות אמינו 0.77 גרם תערובת מוסף שלם בלי אורציל במים 1 ליטר. החיטוי. לאחסן ב 4 ° C.
- YNBA: עבור 400 מ"ל, להשעות 2.76 חנקן גרם שמרים ללא בסיס חומצות אמינו, 0.38 גרם תערובת מוסף שלם בלי אורציל ו אגר 8G בקטריולוגית במים 350 מ"ל. החיטוי. מערבבים 8 גרם גלוקוז עם מים 50 מ"ל וחום בעדינות עד שהיא נמסה. Sterilise דרך פילטר 0.2 מיקרומטר ולהוסיף YNBA תוך אגר הוא מותך. אחסן בטמפרטורת החדר.
- גלוקוז בינונית 20%: עבור 500 מ"ל, מערבבים 100 גרם סוכר עם 500 מ"ל YNB וחום בעדינות עד שהיא נמסה. לעבור דרך מסנן מיקרומטר 0.2 לבקבוק דוראן סטרילית. אחסן בטמפרטורת החדר.
- בינוני גלקטוז 20%: עבור 2 ליטר, לערבב 400 גרם עם גלקטוז YNB חום 2L בעדינות עד שהיא נמסה. לעבור דרך מסנן מיקרומטר 0.2 לבקבוק דוראן סטרילית. חנות ב מזג החדרature.
- מעכבי פרוטאז מניות: CFTR הוא רגיש מאוד proteolysis 4. החוקרים מצאו את מעכבי הבאים כדי להיות יעיל הגבלת proteolysis, אם כי הקוראים מומלץ להתאים ברשימה זו כדי לענות על הדרישות שלהם. חנות aliquots 100 μl ב -20 ° C כדי להפחית להקפיא ההפשרה בעיות. מעכבי כל יש לדלל מן הפתרונות מניות לריכוז עבודה להלן:
| מעכב | המניות ריכוז | המניות הכנה | עבודה ריכוז |
| AEBSF | 200 מ"מ | ממיסים 48mg במים מזוקקים 1ml | 0.2 מ"מ |
| Benzamidine | 300 מ"מ | ממיסים 36mg במים מזוקקים 1ml | 0.3 מ"מ |
| Chymostatin | 4 מ"מ | ממיסים 2.5mg ב 1ml DM יבשSO | 4 מיקרומטר |
| E-64 | 7 mM | ממיסים 2.5mg במים מזוקקים 1ml | 7 מיקרומטר |
| Leupeptin | 20 מ"מ | להמיס 10 מ"ג במים מזוקקים 1ml | 20 מיקרומטר |
| Pepstatin | 15 מ"מ | להמיס 10 מ"ג ב 1ml DMSO יבש | 15 מיקרומטר |
| PMSF | 1 M | ממיסים 174mg ב 1ml DMSO יבש | 1 mM |
- DTT (1 מ '): ממיסים 154 מ"ג dithiothreitol במים מזוקקים 1ml. חנות ב -20 ° C. השתמש בדילול 1:1000 ב מאגרים ציין.
- EDTA (0.5 מ '): לערבב 29.22 גרם חומצת ethylenediaminetetraacetic עם 100 מ"ל מים. הוסף 10 N NaOH dropwise עד שכל EDTA נמס ו-pH מגיע ל 8. לעשות עד 200 מ"ל מים עוברים דרך של 0.2 מיקרומטר לסנן לתוך בקבוק דוראן סטרילית. אחסן בטמפרטורת החדר.
- CRB (300 mM Tris-HCl,pH 7.4, 0.56 מ 'סורביטול, 1 mM EDTA): להמיס 18.17 גרם טריס בסיס מים 350 מ"ל ולהתאים את ה-pH על ידי תוספת של 7.4 HCl. הוסף 51.35 גרם סורביטול ולעשות בנפח עד 500 מ"ל מים. החיטוי. הוסף 1 מ"ל EDTA פתרון במלאי החנות ב 4 ° C.
- CFTR חיץ (50 מ"מ טריס, pH 8.0, 10% V / V גליצרול): ממיסים 6.06 גרם טריס בסיס מים 500 מ"ל. התאם את ה-pH עד 8 עם HCl, מוסיפים 100 מ"ל גליצרול ולעשות עד 1 ליטר מים. החיטוי וחנות ב 4 ° C.
- פי 2 צבע עומס: 50 מ"מ טריס-HCl (pH 7.6), גליצרול 5%, 5 מ"מ EDTA (pH 8.0), 0.02% bromophenol כחול, SDS 4%, 0.05 מ 'DTT. לעשות 10, מ"ל aliquot וחנות ב -20 ° C.
2. ההקרנה Transformants
פרוטוקול זה מבוסס על ההנחה כי הגן CFTR-GFP-8His Fusion שובצה במורד הזרם שמרים פלסמיד אל האמרגן גלקטוז GAL1 (תמונה 1), וכי פלסמיד כבר הפך FGY217 תאים, מחיקה Pep4 מוטציה של S.cerevisiae 10 et al. (2008) 10.
- לקחת 5-10 היטב מופרדים מושבות מהצלחת שינוי. להעביר את כל המושבה כדי צינור סטרילי נפרד פלקון 50 מ"ל המכיל 9 מ"ל YNB ו 1ml של המדיום גלוקוז 20%. לצעד זה, חשוב שיהיה ריכוז סופי של גלוקוז 2% (w / v) בתרבות לשמור על גדילת התאים. לגדול בן לילה במשך 16 שעות ב 250 סל"ד, 30 ° C באינקובטור רועד מסלולית.
- הפוך את מניות וגליצרול לכל אחת המושבות הוקרן. בסביבה נקייה מחיידקים, להוסיף 0.8 מ"ל של התרבויות לילה גליצרול 0.2 מ"ל סטרילי בתוך פקק הברגה צלוחיות שכותרתו, בקצרה חנות מערבולת ב -80 ° C.
- לדלל את התרבויות לילה שנותרו לנפח סופי של 50 מ"ל ב YNB, כולל 250 μl של המדיום גלוקוז 20%.לצעד זה, חשוב לדלל את ריכוז הסוכר עד כ 0.1% (w / w) בתרבות, כי גלוקוז גבוהה יכול להדחיק את האמרגן GAL1 10. לגדול התרבויות שכותרתו 250 מ"ל Erlenmeyer מבולבל צלוחיות ל OD 600 של 0.7-0.8 ב 250 סל"ד, 30 ° C באינקובטור רועד מסלולית.
- להשפיע על תרבויות על ידי תוספת של 5 מ"ל בינוני גלקטוז 20% עד בקבוק אחד ולגדול במשך 16 שעות.
- אשר את הביטוי של CFTR באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. קח 100 μl של התרבות ולהוסיף 100 גליצרול μl להגביל את ניידות תא בתמיסה. נתח את התאים על מיקרוסקופ חזון דלתא שיקום RT (או דומה), באמצעות לייזר כחול תחת מסנן FITC (אורך גל עירור של 490 nm ואת אורך הגל פליטה של 528-538 ננומטר). ביטוי חיובי של חלבון CFTR-GFP היתוך צריך להיות גלוי כמו טבעת של הקרינה על הממברנה של התאים שמרים. בתאי שמרים Untransformed עשוי לשמש כביקורת.
- להעביר אתתרבויות לתוך 50 מ"ל צינורות פלקון. למסוק את התאים על ידי צנטריפוגה ב 3500 XG, 4 ° C למשך 10 דקות צנטריפוגות העליון הספסל. בעוד צנטריפוגות פועל, להכין 2 microfuge צינורות מ"ל עם ראשי בורג המכילים כ 500 μl חומצה שטוף חרוזי זכוכית ומניחים על קרח. מחק את supernatants ו resuspend כל גלולה ב CRB 500-800 קר כקרח μl עם מעכבי פרוטאז. להעביר את המתלים כדי צינורות microfuge המכילים את החרוזים ולשמור על הקרח.
- Lyse את התאים על ידי במרץ רועד / vortexing כל צינור microfuge במשך 10 תקופות של 30 שניות, נח על הקרח בין תקופות. Beadbeater יכול להיות מועסק כאלטרנטיבה, למשל beadbeater מיני BioSpec פעלה במשך 3 דקות.
- מניחים את צינורות לתוך microfuge צנטריפוגות benchtop ובו 3500 XG, 4 ° C במשך 5 דקות. להעביר את supernatants המכילים אוכלוסייה קרום גולמי לנקות צינורות microfuge ומניחים על קרח. הוסף 500 μl טרי קרח שיתוףLD CRB עם מעכבי פרוטאז לצינור כל לחזור על התהליך לצבור את הקרומים.
- לאסוף את ממברנות הגולמי ידי מסתובב במהירות מקסימלית, 4 ° C ב microfuge benchtop למשך 2 שעות. מחק supernatant ו resuspend כל גלולה ב 50 μl חיץ CFTR קר קרח.
- במבחנות microfuge נקיים, מערבבים 15 μl של השעיה כל אחד עם צבע עומס μl 15 2x ידי pipetting מעלה ומטה. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. אין להרתיח את הדוגמאות, כמו זה יגרום חלבונים בממברנה CFTR ואת השני כדי ליצור SDS-מסיסים אגרגטים וגם לפגל את תג ה-GFP.
- טען דגימות יחד עם PageRuler פלוס סטנדרטים חלבון prestained (Fermentas) על 4-20% טריס / גליצין צבע ג'ל (NuSep) ולהפעיל ב V 150 במשך 40 דקות או עד לפני צבען הוא בחלק התחתון של ג'ל.
- לזהות את התאים המבטאים הגבוהים ביותר על ידי הקרינה בתוך הג'ל. מקום במערכת דימות פלואורסצנטי כגון סורק טייפון. סרוק u ג'ללשיר לייזר כחולה באורך גל עירור של 488 ננומטר אורך גל הפליטה של 526 ננומטר. היתוך CFTR-GFP צריך להיות גלוי על כ 220 kDa. תהיה גם להקת ניאון חלשה הנראה בסביבות 70 kDa וזה כנראה שמרים מהותי FAD המכילים חלבון קרום (כגון למקטע דהידרוגנז succinate) 11,12.
- כתם ג'ל עם Coomassie, destain ולסרוק ג'ל להשוואה לסריקה הקרינה באמצעות תמונה נוחה לצפייה חבילת תוכנה. ג'ל Coomassie מוכתם מאפשר הערכה יחסית של CFTR-GFP רמות ביטוי בקווים משובטים שונים לאחר נורמליזציה עבור הסכום הכולל של חלבון הועמסו על כל מסלול של ג'ל.
- רצף את קו תא הגבוהה ביותר להביע את ממלאי גליצרול שלה (2.2) על YNBA טרי הצלחת דגירה על 30 מעלות צלזיוס במשך 2-3 ימים. צלחת זו עלולה להיות מאוחסן עד 2 שבועות 4 ° C.
3. בקנה מידה גדול Fermenter פולחןיור
- הכן מראש תרבויות עבור fermenter. לגרד באזור 1cm 2 של תאים YNBA צלחת (2.13) באמצעות לולאה סטרילית ומוסיפים 45 מ"ל YNB ו 5 בינוני מ"ל גלוקוז 20%, כך OD 600 הוא כ 0.1. גדלים 250 מ"ל צלוחיות Erlenmeyer נבוך לנוכח 250 סל"ד, 30 ° C באינקובטור רועד מסלולית עד OD 600 מגיע 1.
- פיצול בין התרבות 2 2 Erlenmeyer אני מבולבל צלוחיות כל אחת מכילה 450 מ"ל YNB ו 25 בינוני מ"ל גלוקוז 20%. גדלים אלה על על 250 סל"ד, 30 ° C באינקובטור רועד מסלולית עד OD 600 מגיע 1.2.
- בעוד אלה מראש תרבויות גדלים, להגדיר fermenter. הפוך את 11.2l של YNB כמתואר 1.1, אבל לפרק נוסף 8.28 גרם YNB ו 0.95 גרם לירידה את תוספת כדי לפצות על תוספת של גליצרול על אינדוקציה. בסביבה נקייה מחיידקים, להוסיף 11.2 אני YNB ו 75 בינוני מ"ל גלוקוז 20% לכלי fermenter סטרילית 20l ולהתאים את הטמפרטורה רצים30 ° C.
- בסביבה נקייה מחיידקים, להוסיף את precultures כדי fermenter ולהגדיר את מהירות ערבוב כ 800 סל"ד ולשמור את הטמפרטורה על 30 ° C. אוויר דחוס צריך לזרום על כ 15 DM 3 דקות -1. ברגע תרבות fermenter מגיע OD של 600 1.2, לגרום בסביבה נקייה מחיידקים, על ידי הוספת 1.5 ליטר YNB 20% גלקטוז פתרון 1.2 גליצרול אני. מנמיכים את הטמפרטורה ל 25 מעלות צלזיוס ולגדול התרבות במשך 16 שעות.
- להעביר את התוכן לתוך fermenter מצוננים סירים צנטריפוגות 1 ליטר על הקרח באמצעות משאבת peristaltic. למסוק את התאים על ידי צנטריפוגה ב 3500 XG, 4 ° C למשך 30 דקות הרוטור קיבולת גדולה (למשל 6 ליטר). Resuspend התאים CRB 150 מ"ל קרח קר עם מעכבי פרוטאז. מכאן ואילך, כל העבודה צריכה להתבצע על 4 ° C.
- Lyse את התאים על ידי עובר דרך משבש מערכות קבוע תא 4 עובר של 25, 30, 32 ו 35 kPa, איסוף lysate על הקרח בכל מקרה ומקרה. לחלופין, להשתמש ביאטה חרוזr (Biospec) עם נפח שווה של חומצה שטוף חרוזי זכוכית 0.5 מ"מ ו להתסיס במשך 3 דקות על מלוא העוצמה. העברת lysate ל 50 מ"ל פלקון צינורות ו גלולה פסולת התא על ידי צנטריפוגה ב 3500 XG, 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות צנטריפוגות benchtop.
- העברת supernatant לצינורות צנטריפוגות מצוננים. סרכזת על 14,000 XG, 4 ° C למשך 30 דקות צנטריפוגות כדי להסיר את המיטוכונדריה.
- העברת supernatant לצינורות ultracentrifuge מצוננים. סרכזת ב 200.000 XG, 4 ° C למשך 90 דקות ultracentrifuge לאסוף microsomes.
- למזוג בזהירות וזורקים supernatant ולהוסיף קרח 2ml קר חיץ CFTR עם מעכבי פרוטאז ו 1 מ"מ DTT לצינור אחד. Resuspend בעדינות את כדורי באמצעות מכחול, מלמעלה את צינור כל אחד עם מאגר CFTR ומערבבים בעזרת מערבל מערבולת.
- בצנטריפוגה ההשעיה על 200,000 XG, 4 ° C למשך 60 דקות ultracentrifuge, להשליך את כדורי supernatant ו resuspend ב 2 מ"ל קרח קר CFTR חיץ Wמעכבי פרוטאז ith (ללא DTT) באמצעות מכחול.
- ביליארד את microsomes resuspended, להתאים את עוצמת הקול האחרון 50 מ"ל עם חיץ CFTR ומערבבים היטב. שמורת aliquot 1 מ"ל לניתוח SDS-PAGE ג'ל, כמתואר 2.9-2.11. Microsomes ניתן כעת פלאש קפואים בחנקן נוזלי ואז מאוחסן ב -80 ° C עד הצורך.
- CFTR ניתן להפיק microsomes באמצעות אחד חומרי ניקוי הבאים: ליתיום perfluorooctonoate חומצה (LiPFO), tetradecanoly-lyso-phosphatidylglycerol (LPG14), N-dodecyl-β-D-maltoside (DDM). מערבבים את microsomes עם חיץ CFTR, מעכבי פרוטאז חומרי ניקוי 5% (w / w). אם DDM משמש, גם להוסיף 300 מ"מ NaCl למאגר. להתסיס על 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות על הכתף צינור.
- צנטריפוגות מדגמים ב 100.000 XG, 4 ° C למשך שעה 1 ב ultracentrifuge. לשמור על supernatant ולקחת aliquot קטן לניתוח SDS-PAGE ג'ל. CFTR יכול עכשיו להיות מטוהרים מחומר solublised ידי מתכת משותקתזיקה כרומטוגרפיה ואחריו כרומטוגרפיה הדרה גודל.
4. נציג תוצאות
טרנספורמציה של שמרים עם CFTR המכיל פלסמיד הוא לא 100% יעיל. מסך נציג בקנה מידה קטן של ביטוי CFTR במושבות נבחרים מתוך ניסוי טרנספורמציה תניב 1 ל 4 מושבות המבטאים את החלבון. תוצאה אופיינית ממסך 5 מושבות הרים מהצלחת מוצג בלוח של איור. 3. אחת המושבות מראה על רמה חזקה של ביטוי של חלבון CFTR-GFP היתוך אשר בדרך כלל רץ בין 250 ו -130 סמנים kDa KDA, כמוצג. את CFTR-GFP רמות הקרינה משתנה באופן ניכר בין ניסויים, עם המושבה 4 באיור. 3 מראה לפחות הקרינה גדול פי 10 מאשר להקת ניאון פנימי בסביבות 70kDa. אם רמות הביטוי של CFTR-GFP מופיעים לתת הקרינה פחות הלהקה 70 kDa, אז זה כנראה שווה מחדש הפיכת ובחירת המושבהעם רמות גבוהות יותר של ביטוי CFTR-GFP. כפי שמוצג באיור. 3 א, אין זה סביר, גם עם רמת ביטוי גבוהה של CFTR-GFP, כי הלהקה CFTR-GFP יהיה להבחין בקטע התא על ידי צביעה Coomassie.
פעם מושבות שנבחרו כבר גדל בניסויים בקנה מידה גדול יותר, ואת microsomes מבודדים, הנוכחות של CFTR-GFP בתוך microsomes יהיה צריך להיות מוערך, כפי שמוצג באיור. 3 ב. את התוצאות של הניסוי הזה חשובות לא רק כדי להעריך את היעילות של אינדוקציה של הביטוי, אלא גם כדי לבדוק את microsomes הוכנו בקפידה וכי proteolysis מוזער. התוצאות באיור. 3 ב מרמזים כי בניסוי זה ביטוי CFTR-GFP הוא מעט נמוך יותר (כמו לשפוט ביחס הלהקה 70kDa מהותי) מאשר בניסוי בקנה מידה קטן שמוצג בלוח א 'אולם רושם זה מוטה על ידי חשיפה של גלאי הקרינה הזה המדידה. זה היה בגלל הניסוי היה checking נוכחות של שברים פרוטאוליטים של CFTR לבנות. ישנן עדויות על ניסוי זה כמה שברים פרוטאוליטים ניאון בין 130 ו -100 סמנים kDa KDA, אך אלה חלשים מאוד לעומת הלהקה CFTR-GFP באורך מלא. עם מעכבי פרוטאז המתואר כאן, אנו מוצאים עדויות רבות על הירידה באיכות פרוטאוליטים של CFTR לאחר שבירה התא. אם proteolysis משמעותי הוא ציין, אנו ממליצים על ביצוע טריים מעכבי פרוטאז פתרונות המניות. מצאנו גם כי מסחר מעכבי פרוטאז טבליות קוקטייל אינן יעילות עבור מערכת זו. הצמיחה של תאים מעבר 16 שעות (לאחר הגיוס) יהיה להצמיח ביטוי CFTR ירד כפי שמוצג באיור 4. זה כנראה בגלל התחלופה של החלבון, אולי בשל upregulation של מכונות חלבון שמרים בקרת איכות 6-9,13. על כן מומלץ לעקוב אחר רמות ביטוי CFTR לאחר אינדוקציה עם גלקטוז, אם אפשר, כמו זמן אופטימלי למסוק את התאים תואר שניY להשתנות ממעבדה אחת לאחרת.
באיור 1. מבנה המכיל CFTR פלסמיד שמרים. היתוך CFTR-GFP-8His מוכנס לתוך וקטור p424GAL1 2μ הביטוי, בשליטת היזם גלקטוז (GAL1). וקטור מכיל גם מבחר אורציל סמן (עורה) ואת הגן התנגדות ampicillin (AMP).
איור 2. תרשים זרימה המסכם את פרוטוקול דמיינו.
איור 3. נציג SDS-עמוד ג'לים של ביטוי CFTR וטיהור. לוח 5 מראה באופן אקראי הרים מושבות transformant (מסלולים 1-5), כי הוקרנו ביטוי CFTR. לוח ב 'מראה microsomes כי נותקו מן ferm 15lהזן התרבות. לוח ג מראה מטוהרים CFTR Murine המתקבל לאחר טיהור 2 שלבים באמצעות כרומטוגרפיה זיקה ואחריו כרומטוגרפיה הדרה גודל. ג'ל כל מוצגים תחת תנאי תאורה פלואורסצנטי מרגש מתחום ה-GFP (משמאל) ואחרי Coomassie להכתים (מימין). המיקומים היחסיים של אמות המידה משקל מולקולרי מפורטים בצד ימין (KDA).
באיור 4. הנתונים מייצגים לביטוי של CFTR בשמרים. לוח מראה זמן כמובן הביטוי CFTR לאחר אינדוקציה עם גלקטוז. תמציות תאים נותחו על ידי-SDS, ואת הקרינה GFP ללהקה CFTR-GFP חלבון היה משולב. ב לוח התוצאות מראה טיפוסי של מיקרוסקופ פלואורסצנטי של ה-GFP-להביע תאים 16 שעות אינדוקציה הודעה. בדרך כלל, רק חלק קטן מן התאים לבטא CFTR ברמות גבוהות.
Discussion
מאמר זה מספק שיטה ביטוי של חלבון CFTR Murine בתאי שמרים, שאמור להקל על מחקר על סיסטיק פיברוזיס. המטרה היא לקשר את הנייר עם שחרורו של Murine CFTR מבנה ה-DNA, אשר יהיה זמין דרך סיסטיק פיברוזיס קרן ( http://www.cff.org/research/CFFT/ ). Orthologs אחר צריך להיות זמין במועד מאוחר יותר. טרנספורמציה של תאים שמרים עם וקטור המכיל CFTR היא פשוטה, אך חשוב למסך המושבות המבטאים רמות גבוהות של CFTR. רמות הביטוי משתנים עשוי לנבוע ממספר גורמים, אבל מספר העותקים של התא לכל פלסמיד כנראה אחראית במידה לא מבוטלת של וריאציה. השלבים הקריטיים המתוארים כאן אמור לאפשר ייצור של CFTR-לבטא בתאי שמרים CFTR, המכילים ממברנות microsomal. לאחר השינוי, הצמיחה, קציר תמוגה של תאים שמרים כבר שולט, purification של החלבון צריך להיות אפשרי, באיור 3 נתנו דוגמה של טוהר, כי צריך להיות בר השגה במקרה זה כאמת מידה שימושי. אין בכוונתנו בכתב היד הזה כדי לספק מתודולוגיה מפורטת טיהור של החלבון. עם זאת, ישנם כמה צעדים קריטיים טיהור במורד הזרם ספציפיים במערכת ביטוי S.cerevisae, כגון תמוגה התא וטיהור גופיפון, ואלה נכללו בפירוט כתב היד הזה. יש לציין, עם זאת, כי מלבד שתי השיטות בהן השתמשנו, שיטות חלופיות תא שמרים שיבוש יכול להיות מועסק, כגון שימוש של תא הלחץ הצרפתי. חלבון רקומביננטי יש TeV-cleavable בטרמינל C-GFP מושלם המאפשר לחלבון להיות במעקב אחרי הגיוס (איור 4). שמרים יש חלבון 70kDa פנימי (כנראה succinate dehydrogenase 12), מאיר, בתנאים זהים 11, וזה יכול לספק בין שימושיכיול סטנדרטי NAL את רמות הביטוי היחסיות של CFTR של תמציות תאים או microsomes שלמים (איור 3). ברור מהנתונים שמוצג בתרשים 4, כי העיתוי של קצירת התא לאחר אינדוקציה עם גלקטוז הוא קריטי. תשואות ירידה CFTR בתלילות לאחר שעות על 16 האינדוקציה, כך שיש כמעט בכל CFTR להבחין בתאי שמרים לאחר 24 שעות של אינדוקציה.
תשואה של חלבונים מטוהרים הוא על חלבון 1 2mg-CFTR לכל תרבות fermenter 15 ליטר. השחזור ניתן להעריך גם על 70% של חלבון CFTR-GFP הכולל עד שלב גופיפון, והתאוששות על 25% מטוהרים חלבון. אפיון של ס ' cerevisiae, הביע CFTR היא מתמשכת. כפי שניתן לראות באיור. 4, מיקום של חלבונים בתוך התא יכול להיות פיקוח על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. אמנם רוב הקרינה נמצא סביב בפריפריה של התא כמו 10 הצפויה, כמה חלבון מציג לוקליזציה punctate, או, אורק בתוך קרום הפלזמה אשר יכול להיות בגלל CFTR מיחזור דרך מסלול Golgi / endosomal בסוף 14 או אולי במורד הזרם של תא נביטה של שלפוחית התחבורה של ER 4. טיפול PNGaseF, אנזים deglycosylates חלבונים, הראה שינוי מינימלי ההגירה של הלהקה חלבון CFTR על SDS-PAGE, רומז כי הוא unglycosylated, או שיש לו glycosylation מינימלי 15. ניסויים המדינה זירחון של חלבון נמצאים בעיצומם. בכמה חומרי ניקוי שנבדקו עד כה, חלבונים מטוהרים מציג פעילות ATPase (כי הוא עצור על ידי מעכבי CFTR ספציפי 16) במחירים דומים לאלה שפורסמו בעבר 2,15. מדידה של פעילות הערוץ CFTR ידרוש הכינון מחדש של חלבונים מטוהרים, שפירושה צעד לטיהור הסופי חומר ניקוי בעל ריכוז גבוה יחסית קריטי micelle (CMC) 17. שמרים microsomes containinגרם CFTR ניתן solublised עם חומרי ניקוי המועסקים בדרך כלל מספר 18, כולל חומרי ניקוי כגון dodecyl maltoside 2, אשר נחשבים בדרך כלל להיות "מתונה". אולם חומרי ניקוי CMC עליון הוכיחו להיות יעיל עבור solubilsation, עד כה, טוען כי חילופי לתוך חומרי ניקוי אלה יש לשקול בשלב מאוחר בתוכנית כלשהי טיהור.
Disclosures
אין ניגוד עניינים הצהיר.
Acknowledgments
אנו מודים סיסטיק פיברוזיס קרן (CFF) למימון עבודה זו דרך CFTR Consortium שלה מבנה 3D (מספר מענק FORD08XX0). אנו מכירים את התרומה הענקית של כל עמיתינו בתוך Consortium לעבודה זו, בעיקר בעיצוב של הגנים CFTR. כמו כן, אנו מכירים את תרומתם שלא תסולא בפז של בני הזוג. ג'יימס Birtley (NCSR Demokritos, יוון), מארק יאנג (אוניברסיטת קרדיף, אנגליה) ודוד דרו (אימפריאל קולג', לונדון, בריטניה) בשלבים המוקדמים של העבודה. אנחנו במיוחד להודות לד"ר אינה Urbatsch (טקסס טק. אוניברסיטת Lubbock) לקריאה ביקורתית של כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FGY217 S.cerevisiae strain, with pep4 deletion 10 | |||
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0410 | |
| Complete supplement mixture without uracil | Formedium | DCS0169 | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306 | |
| D-galactose | Fisher | BP656-500 | |
| D-glucose | Fisher | D16-500 | |
| Pepstatin A | Sigma-Aldrich | P4265 | |
| Leupeptin | Merck | 108975 | |
| Chymostatin | Sigma-Aldrich | C7268 | |
| Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64) | Sigma-Aldrich | E3132 | |
| Amin–thylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF) | Sigma-Aldrich | A8456 | |
| Benzamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 434760 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher | BP120500 | |
| Tris-base | Formedium | TRIS01 | |
| Tris-HCl | Fisher | P631 | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| Glycerol | Fisher | 065017 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| n-dodecyl-β-D-maltopyranoside | Affymetrix | D310S | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| PageRuler Plus prestained protein standards | Fermentas | SM1811 | |
| NuSep tris-gly 4-20% gradient gels | NuSep | NB10-420 | |
| Instant Blue Coomassie Stain | Novexin | ISB1L | |
| Glass beads, acid washed | Sigma | G8772 | |
| 50ml Sterile Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.254 | |
| 2ml Sterile screw-top vials | Sarstedt | 72.694.005 | |
| 250ml Sterile Erlenmeyer baffled flasks | BD Biosciences | 355119 | |
| 2l Sterile Erlenmeyer baffled flasks | BD Biosciences | 355131 | |
| 2ml microfuge tubes | Sarstedt | 72.695 | |
| 0.2μM syringe filter | Sartorius | FC121 | |
| ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355618 | |
| centrifuge tubes | Beckman Coulter | 357000 | |
| 1l centrifuge pots | Beckman Coulter | 969329 | |
| Orbital shaking incubator with temperature control | New Brunswick Scientific | ||
| Deltavision RT restoration microscope | Applied Vision | ||
| Benchtop centrifuge | HERMLE | Z300 | |
| Benchtop microfuge | Fisher | 13-100-511 | |
| Vortex mixer | Star Labs | ||
| Typhoon Trio Scanner | GE Healthcare | 63-0055-87 | |
| LAS3000 imaging system | Fuji | ||
| 20l fermenter vessel and control unit | Applikon | ||
| Constant systems cell disrupter | Constant systems | ||
| Beadbeater cell disrupter | BioSpec | 1107900 | |
| Mini-beadbeater-16 | BioSpec | 607 | |
| JA-17 rotor | Beckman Coulter | 369691 | |
| Optima L-100 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392050 | |
| 50.2Ti rotor | Beckman Coulter | 337901 |
References
- Ford, R. C., Birtley, J., Rosenberg, M. F., Zhang, L. CFTR three-dimensional structure. Methods Mol. Biol. 741, 329-346 (2011).
- Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. CFTR). J. Biol. Chem. 279, 39051-39051 (2004).
- Zhang, L., Aleksandrov, L. A., Riordan, J. R., Ford, R. C. Domain location within the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein investigated by electron microscopy and gold labelling. Biochim. Biophys. Acta. 1808, 399-404 (2011).
- Kiser, G. L. Expression and degradation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in Saccharomyces cerevisiae. Arch. Biochem. Biophys. 390, 195-205 (2001).
- Huang, P., Stroffekova, K., Cuppoletti, J., Mahanty, S. K., Scarborough, G. A. Functional expression of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in yeast. Biochim. Biophys. Acta. 1281, 80-90 (1996).
- Ahner, A., Nakatsukasa, K., Zhang, H., Frizzell, R. A., Brodsky, J. L. Small heat-shock proteins select deltaF508-CFTR for endoplasmic reticulum-associated degradation. Mol. Biol. Cell. 18, 806-814 (2007).
- Fu, L., Sztul, E. ER-associated complexes (ERACs) containing aggregated cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are degraded by autophagy. Eur. J. Cell. Biol. 88, 215-226 (2009).
- Sun, F. Derlin-1 promotes the efficient degradation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and CFTR folding mutants. J. Biol. Chem. 281, 36856-36863 (2006).
- Zhang, Y., Michaelis, S., Brodsky, J. L. CFTR expression and ER-associated degradation in yeast. Methods Mol. Med. 70, 257-2565 (2002).
- Drew, D. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nat. Protoc. 3, 784-798 (2008).
- Knight, A. W., Billinton, N. Seeing the wood through the trees: A review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence. Anal. Biochem. 291, 175-197 (2001).
- Robinson, K. M., Lemire, B. D. Isolation and nucleotide sequence of the Saccharomyces cerevisiae gene for the succinate dehydrogenase flavoprotein subunit. J. Biol. Chem. 267, 10101-10107 (1992).
- Gnann, A., Riordan, J. R., Wolf, D. H. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator degradation depends on. the lectins Htm1p/EDEM and the Cdc48 protein complex in. 15, 4125-4135 (2004).
- Yoo, J. S. Non-conventional trafficking of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator through the early secretory pathway. J. Biol. Chem. 277, 11401-11409 (2002).
- Zhang, L. Architecture of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein and structural changes associated with phosphorylation and nucleotide binding. Journal of Structural Biology. 167, 242-251 (2009).
- Wellhauser, L. A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability. Mol. Pharmacol. 75, 1430-148 (2009).
- Ramjeesingh, M. A monomer is the minimum functional unit required for channel and ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Biochemistry. 40, 10700-10706 (2001).
- Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Anal. Biochem. 259, 89-97 (1998).
