Summary
Kistik fibrozis transmembran iletkenlik regülatör (CFTR) ifade etmek için girişimleri
Abstract
Kistik fibrozis transmembran iletkenlik regülatör (CFTR) mutasyon olduğunda, bu nedenle bu proteinin çok büyük bir ilgi olduğunu humans.There kistik fibrozis ortaya çıkmasına neden olabilir bir klor kanalı, ama yapısı ve faaliyet çalışma çabaları zorluk nedeniyle engellense 1-3 protein yeterli miktarda ifade ve arındırma. Birçok 'zor' ökaryotik membran proteinleri gibi, hızlı büyüyen bir organizmanın ifade arzu, ama zorlu ve maya S. cerevisiae, şimdiye kadar düşük miktarda elde edildi ve rekombinant protein hızlı bir degradasyon 4-9 gözlenmiştir. Maya rekombinant CFTR işleme ile ilgili Proteinler 6-9 tarif edilmiştir. Bu raporda, önemli miktarda maya ve arıtma CFTR ifade etmek için bir metodoloji tanıtılmıştır. Protokolü önceki proteoliz sorunların üstesinden nasıl açıklanır ve nasıl ifade seviyelerininCFTR büyük ölçüde hücre hasat öncesinde belirli süre içinde, hücre büyümesi koşulları değiştirerek ve indüksiyon koşulları kontrol ederek geliştirilebilir. Bu protokol (mürin CFTR eksprese maya hücreleri veya maya plazmid) araştırma sponsor oldu ABD Kistik Fibrozis Vakfı aracılığıyla dağıtılacaktır ile ilişkili reagants. CFTR tasarımı ve sentezi bu raporda istihdam oluşum, anlatan bir makale (.; Thibodeau, P. ve arkadaşları, yayınlanmamış Urbatsch, I.) ayrı olarak yayınlanacaktır. Plazmid içeren maya (Şekil 1) - Bu yazıda, CFTR yapı ile maya hücrelerinin dönüşümü ile bizim yöntem başında açıklayacağız. Yapı 10, C-terminalindeki CFTR için kaynaşmış bir yeşil floresan protein (GFP) dizilimi vardır ve Drew ve arkadaşları tarafından geliştirilen sistem kullanılır. (2008). GFP CFTR ifadesi ve saflaştırılması nispeten kolay takip edilmesini sağlar. Vallahi görüntülendi protocmaya hücrelerinden mikrozomal hazırlandıktan sonra ol tamamlandığında, biz mikrozomları gelen protein saflaştırılması için bazı öneriler içermesine rağmen. Okuyucular protein ve kendilerine sunulan yerel ekipman ile yapılacak son deneyler bağımlı mikrozom saflaştırma işlemi, kendi değişiklikler eklemek isteyebilirsiniz. Maya-ifade CFTR proteini kısmen bir içsel polyhistidine saflaştırma etiketi kullanılarak, metal iyonunun afinite kromatografisi kullanılarak saflaştırılabilir. Daha sonraki boyut dışlama kromatografisi olarak SDS-PAGE ve jel Coomassie-boyama tarafından değerlendirilecek,>% 90 saf gibi görünen bir protein üretir.
Protocol
1. Medya ve Tamponlar hazırlanması
- YNB: Bir litre, 1 litre suda urasil olmadan amino asit ve 0.77 g eksiksiz karışımı takviyesi olmadan 6,9 g maya nitrojen baz askıya. Otoklavlayın. 4 ° C'de depolamak
- YNBA: 400 ml için, amino asitler olmadan 2.76 gr maya nitrojen baz askıya alma, 350 ml su içinde urasil ve 8g bakteriyolojik agar olmadan 0.38 g tam ek karışımı. Otoklavlayın. Eriyene kadar yavaşça 50 ml su ve ısı ile 8 g glukoz karıştırın. 0.2 um bir filtre ile sterilize ve agar erimiş olduğunu iken YNBA eklemek. Oda sıcaklığında saklayın.
- % 20 glukoz orta: eriyene kadar 500 ml, 500 ml yavaşça YNB ve ısı ile 100 gr şekeri karıştırın. Steril bir şişeye Duran 0.2 um bir filtreden geçirilir. Oda sıcaklığında saklayın.
- % 20 galaktoz orta: eriyene kadar 2 litre su için, hafifçe 2l YNB ve ısı ile 400 g galaktoz karıştırın. Steril bir şişeye Duran 0.2 um bir filtreden geçirilir. Oda sıcaklığında saklayınızbelgelendiğinden.
- Proteaz inhibitörü stokları: CFTR proteoliz 4 derece hassastır. Yazarlar okuyucuların kendi ihtiyaçlarını karşılamak için özel bu listeyi isteyebilirsiniz olsa takip inhibitörleri, proteoliz sınırlandırılmasında etkili olduğu bulundu. Dondurma-eritme problemleri azaltmak için -20 ° C 'de 100 ul hacimde saklanmalıdır. Tüm inhibitörleri stok çözümleri aşağıdaki gibi çalışma konsantrasyonuna dilüe edilmelidir:
| Önleyici | Stok Konsantrasyon | Hamur Hazırlama | Çalışma Konsantrasyon |
| AEBSF | 200 mM | 1 ml distile su içinde eritilir 48mg | 0.2 mM |
| Benzamidin | 300 mM | 1 ml distile su içinde eritilir 36mg | 0.3 mM |
| Kimostatin | 4 mM | 1ml kuru DM 2.5mg eritilirSO | 4 uM |
| D-64 | 7 mM | 1 ml distile su içinde eritilir 2.5mg | 7 mcM |
| Löpeptin | 20 mM | 1 ml distile su içinde eritilir 10mg | 20 uM |
| Pepstatin A | 15 mM | 1 ml kuru DMSO 10mg eritilir | 15 uM |
| PMSF | 1 M | 1 ml kuru DMSO 174mg eritilir | 1 mM |
- DTT (1 M): 1 ml damıtılmış su içinde 154 mg ditiyotretol eritilir. -20 ° C de saklayınız Tamponlarda 1:1000 dilüsyon kullanın belirtti.
- EDTA (0.5 M): 100 ml su ile Karışım 29,22 g etilendiamintetraasetik asit. EDTA her çözülmüş ve pH 8 olana kadar 10 N NaOH çözeltisi damla damla ilave edin. Su ile 200 ml Makyaj ve steril Duran şişeye filtre 0.2 mikron geçer. Oda sıcaklığında saklayın.
- CRB (300 mM Tris-HCl,pH 7.4, 0.56 M sorbitol, 1 mM EDTA): 350 ml su içinde 18.17 g Tris-bazlı bir eritilir ve HCI eklenerek pH 7.4 'e ayarlanır. Sorbitol 51.35 g ekleyin ve su ile 500 ml birimi oluşturacak. Otoklavlayın. 4 az 1 ml EDTA stok solüsyonu ve mağaza ° C ekle
- CFTR tamponu (50 mM Tris, pH 8.0,% 10 v / v gliserol): 500 ml su içinde 6.06 g Tris-bazlı bir eritilir. HCI ile pH 8'e ayarlamak, 100 ml gliserol ekleyin ve su ile 1 L tamamlanır. 4 ° C'de otoklav ve mağaza
- 50 mM Tris-HCl (pH 7.6),% 5 gliserol, 5 mM EDTA (pH 8.0),% 0.02 Bromofenol mavisi, 4% SDS, 0.05 M DTT: yük boya 2x. -20 ° C'de 10 mL, tablet ve saklamak hale
2. Eleme Transformatlar
Bu protokol CFTR-GFP-8His füzyon geni bir GAL1 galaktoz organizatörü (Şekil 1) bir maya plazmid aşağı içine ve bu sokulduğu varsayar plazmid FGY217 hücreleri S. cerevisiae 10 mutant bir Pep4 silme dönüşmüştür ve ark. (2008) 10 ile detaylı olarak tarif edilmektedir.
- Bir dönüşüm plaka 5-10 iyi ayrılmış koloniler seçin. % 20 glükoz orta 9 ml YNB ve 1 ml içeren ayrı bir steril 50 ml Falcon tüp için her bir koloni transfer edin. Bu aşama için, hücre büyümesi korumak için kültürü içinde% 2 glükoz (w / v) bir son konsantrasyon elde edilmesi önemlidir. Orbital çalkalama inkübatöründe 30 ° C'de, 250 rpm'de 16 saat gece boyunca büyür.
- Koloniden her biri için gliserol stokları edin. Aseptik olarak etiketlenmiş vida-üst flakonlarda 0.2 ml steril gliserol, -80 de vorteks kısaca ve mağaza ° C'ye gecede kültürlerin 0.8 mL
- % 20 glükoz besiyeri içeren 250 ul YNB içinde 50 ml nihai hacme kadar, geri kalan bir gece boyunca kültürler, seyreltilir.Yüksek glukoz GAL1 organizatörü 10 bastırmak çünkü bu adım için, bu kültür yaklaşık% 0.1 (w / w) için glukoz konsantrasyonu sulandırmak için önemlidir. Etiketli 250 ml Erlenmeyer kültürler büyümeye 250 rpm, orbital çalkalama inkübatör 30 ° C'de 0,7-0,8 bir OD 600 matara şaşırttı.
- Her bir şişeye 5 ml% 20 galaktoz ortamı eklenerek kültürler indüklemek ve 16 saat boyunca üzerinde yetişebilir.
- Floresan mikroskobu kullanarak CFTR ifade onaylayın. Kültürünün 100 ul alın ve çözüm hücre hareketliliği sınırlamak için 100 ul gliserol ekleyin. Bir FITC filtresi (490 nm ve 528-538 nm dalga boyunda emisyon dalgaboyu) altında bir mavi lazer kullanarak Delta Vizyon RT restorasyon mikroskobu (veya benzeri) üzerine hücreler, analiz edin. CFTR-GFP füzyon proteininin ifadesi pozitif maya hücrelerinin plazma membranında floresans bir halka olarak görülmelidir. Setinde maya hücreleri, bir kontrol olarak kullanılabilir.
- Aktarın50ml Falcon tüpler içine kültürleri. Bir tezgah üstü santrifüj içinde 10 dakika boyunca 3500 x g'de, 4 ° C'de santrifüje edilerek hücreler hasat. Santrifüj çalışıyor iken, buz üzerinde yaklaşık 500 ul asitle yıkanmış cam boncuk ve yeri içeren vida üstleri ile 2 ml mikrofuge'de tüpler hazırlamak. Süpernatantlar atın ve 500-800 ul buz KİB her pelletini ile proteaz inhibitörleri. Boncuklar içeren mikrofuge'de tüplere süspansiyonlar aktarın ve buz üzerinde tutun.
- Şiddetle dönemleri arasında buz üzerine oturtulmuş, 30 saniye 10 dönem boyunca sallayarak / Her mikrofuge'de tüp vortekslendi tarafından akyuvarlar. Bir beadbeater alternatif olarak istihdam edilebilirler, 3 dakika boyunca işletilen bir BioSpec Mini beadbeater örneğin.
- 5 dakika boyunca 3500 x g'de, 4 ° C de, bir tezgah üstü mikrofuj ve santrifüj tüpü içine yerleştirin. Buz üzerinde mikrofuge'de tüpleri ve yer temizlemek için ham membran nüfus içeren süpernatantlar aktarın. 500 ul taze buz-co ekleld CRB Her tüpe proteaz inhibitörleri ve membranlar birikir işlemi tekrarlayın.
- 2 saat boyunca, bir tezgah üstü mikrofuj maksimum hızı, 4 ° C de iplik ile ham membranları Collect. Süpernatant atın ve 50 ul buz CFTR tampon her pelletini.
- Temiz mikrofuge'de tüplerde, aşağı yukarı pipetleme ve 15 ul 2x yük boya ile her süspansiyon 15 ul karıştırın. Bir 10 dakika için oda sıcaklığında inkübe edilir. Bu SDS-çözünmez agregatlar oluşturması ve aynı zamanda GFP etiketi bozabileceğinden için CFTR ve diğer membran proteinleri neden olacağından, örnekler kaynatmayın.
- 4-20% Tris / glisin gradient jel (NuSep) üzerine PageRuler Artı prestained protein standardı (Fermentas) ile birlikte numuneleri yükleyin ve 40 dakika için 150 V kadar veya boya ön jel dibinde çalıştırın.
- In-jel floresan yüksek salgılayan hücrelerin tanımlayın. Böyle bir Typhoon tarayıcı olarak bir floresan görüntüleme sistemi içine yerleştirin. Jel u tara488 nm dalgaboyu, mavi lazer ve 526 nm emisyon dalga boyu şarkı. CFTR-GFP füzyon yaklaşık 220 kDa görünür olmalıdır. Ayrıca muhtemelen içsel bir maya FAD içeren membran proteini 11,12 (örneğin süksinat dehidrogenaz altbirim A as) yaklaşık 70 kDa görünür zayıf bir floresan bandı olacaktır.
- Uygun bir resim görüntüleme yazılımı paketi kullanılarak floresans tarama ile karşılaştırma yapmak için jel destain ve tarama, Coomassie ile jel Leke. Coomassie lekeli jel jeli, her parça üzerine yüklenen toplam protein miktarı için normalizasyon sonra farklı klonal hatları CFTR-GFP tanımı seviyeleri göreceli bir değerlendirmenin sağlar.
- Taze bir YNBA üstünde onun gliserol stok (2.2) yüksek eksprese eden hücre hat çıkışı Streak 2-3 gün süreyle 30 ° C'de inkübe ve plaka. Bu plaka daha sonra 4 ° C'de 2 hafta için kadar saklanabilir
3. Büyük ölçekli Fermentör Culture
- Fermentör için ön-kültür hazırlayın. YNBA bir hücre 1cm 2 alana Sıyırmak plakası (2,13) steril bir döngü kullanılarak ve 45 ml YNB ve 5 ml% 20 glükoz orta OD 600 yaklaşık 0.1 olduğu gibi ekleyin. OD 600 1 ulaşıncaya kadar orbital çalkalama inkübatörde 250 rpm, 30 ° C'de 250 ml Erlenmeyer şaşkın şişeler büyür.
- Baffled iki 2 l Erlenmeyer arasında bölünür, her kültürü içeren 450 ml'lik YNB ve 25 ml% 20 glükoz, orta şişeler. 250 rpm, orbital çalkalama inkübatör 30 ° C OD 600 1.2 ulaşıncaya kadar da bu büyümeye.
- Bu ön kültürler büyüyor olsa da, fermentör kurdu. 1,1 olarak tarif YNB arasında 11.2l hale, fakat ek bir 8.28 g YNB ve indüksiyon azından gliserol ilave telafi etmek için ek dışarı 0.95 g damla çözülür. Aseptik olarak steril bir 20l fermentör gemi için 11.2 l YNB ve 75 ml% 20 glukoz orta eklemek ve çalışan sıcaklığını ayarlamak30 ° C.
- Aseptik fermentasyon precultures ekleyin ve karıştırarak hızını yaklaşık 800 rpm ve 30 ° C sıcaklıkta muhafaza Basınçlı hava yaklaşık 15 dm 3 dk -1 akmalıdır. Fermentör kültürü 1.2 bir OD 600 ulaştığında, neden aseptik olarak 1,5 l YNB% 20 galaktoz solüsyon ve 1.2 l gliserol ekleyerek. 25 ° C sıcaklıkta azaltmak ve 16 saat boyunca kültürün büyür.
- Bir peristaltik pompa kullanılarak buz üzerinde soğutulmuş 1l santrifüj kapları içine fermentör aktarın. Büyük bir kapasite rotor (ör. 6 litre) içinde 30 dakika boyunca 3500 x g'de, 4 ° C'de santrifüje edilerek hücreler hasat. Proteaz inhibitörleri ile 150 ml buzlu soğuk CRB içinde tekrar süspansiyon hücreleri. Burada itibaren, tüm iş 4 ° C de yapılmalıdır
- Her iki durumda da buz üzerinde lizat toplanması, 25, 30, 32 ve 35 kPa'dan az 4 geçer bir sabit Systems hücre bozucu geçerek hücreleri Lyse. Alternatif olarak, bir boncuk Beate kullanımıasitle yıkanmış 0.5 mm cam boncuklar eşit hacmi ile r (Biospec) ve tam güç ile 3 dakika için ajitasyon. 3500 xg, bir tezgah üstü santrifüj içinde 15 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüje edilerek 50ml Falcon tüpler ve pellet hücre enkazları için lizat transfer edin.
- Soğutulmuş santrifüj tüplerine süpernatant aktarın. Mitokondri kaldırmak için bir santrifüj içinde 30 dakika süreyle 14,000 xg, 4 ° C'de santrifüje.
- Soğutulmuş ultrasantrifüjdeki tüplere süpernatant aktarın. Mikrozomlan toplamak için bir ultrasantrifüjdeki 90 dakika boyunca 200,000 xg, 4 ° C'de santrifüje.
- Dikkatle boşaltmak ve supernatant atmak ve her tüpe proteaz inhibitörleri ve 1 mM DTT ile 2ml buz CFTR tamponu ekleyin. Yavaşça bir girdap mikser kullanarak CFTR tampon ve karışımı ile her tüpe kadar üst bir fırça kullanarak pelet yeniden süspanse.
- Bir ultrasantrifüjdeki 60 dakika boyunca 200,000 xg, 4 ° C'de santrifüje süspansiyon, 2 ml buzda soğutulmuş tampon CFTR w süpernatan ve Pastör pipetiyle peletler atmakITH proteaz inhibitörleri Bir fırça kullanarak (hiçbir DTT).
- Havuz süspanse mikrozomları, CFTR tamponu ile 50 ml'ye son ses seviyesini ayarlamak ve iyice karıştırın. Rezerv olarak 2,9 tarif SDS-PAGE jeli analizi için bir 1 ml bir örnek, - 2.11. Mikrozomları şimdi flaş sıvı nitrojen içinde dondurulmuş olması ve sonra gerektiği kadar -80 ° C'de muhafaza edebilirsiniz.
- Lityum perfluorooctonoate asit (LiPFO), tetradecanoly-lyso-phosphatidylglycerol (LPG14), n-dodesil-β-D-maltoside (DDM): CFTR Aşağıdaki deterjan biri kullanılarak mikrozomlan elde edilebilir. CFTR tamponu, proteaz inhibitörleri ve% 5 deterjan (w / w) ile mikrozomlan karıştırılır. DDM kullanılması durumunda, aynı zamanda tampon NaCl 300 mM ekleyebilir. Bir tüp döndürücü üzerinde 15 dakika boyunca 4 ° C'de çalkalayın.
- Bir ultrasantrifüjdeki 1 saat için 100,000 xg, 4 ° C'de santrifüje örnekleri. Süpernatan korumak ve SDS-PAGE jeli analizi için, küçük bir alikotu alır. CFTR artık immobilize metal solublised malzemeden saflandırılabilirafinite kromatografisi boyut harici kromatografi ile izledi.
4. Temsilcisi Sonuçlar
CFTR içeren plazmid ile maya Dönüşüm% 100 verimli değildir. Bir dönüşüm deney seçilen koloniler CFTR ifade temsilcisi küçük ölçekli ekran proteini ifade 4 koloni yaklaşık 1 verecektir. Bir tabaktan aldı 5 koloni bir ekran tipik bir sonucu A Şekil panelinde gösterilir. 3. Koloniler biri tipik olarak gösterildiği gibi, 250 kDa ve 130 kDa belirteçler arasında çalışan CFTR-GFP füzyon proteininin ifadesi bir kuvvetli seviyesini göstermektedir. CFTR-GFP floresans seviyeleri Şekil koloni 4, deneyler arasında önemli farklılıklar olacaktır. Hakkında 70kDa de içsel floresan grubundan çok 3 gösteren en az 10 kat daha fazla floresans. CFTR-GFP ifade seviyeleri 70 kDa bandı daha az floresans vermek görünüyorsa, o zaman muhtemelen yeniden dönüşüm ve bir koloni seçerken değerCFTR-GFP tanımının yüksek seviyeleri ile. Şek. 3A, bu CFTR-GFP grubu Coomassie boyama ile hücre özütü olarak ayırt olacağı, hatta CFTR-GFP yüksek bir seviyede ifade ile, pek mümkün değildir.
Şekil olarak Seçildikten sonra koloniler, mikrozomları içinde CFTR-GFP varlığının değerlendirilmesi gerekir, izole mikrozomları daha büyük ölçekli deneyler yetişen ve edilmiştir. 3B. Bu deneyin sonuçları mikrozomlan dikkatli bir şekilde hazırlanmış ve bu proteoliz en aza indirgenmiştir olmadığını kontrol etmek için önemlidir, sadece ifade indüksiyon etkinliğini değerlendirmek için, hem de vardır. Sonuçlar Şek. 3B Bu deneyde CFTR-GFP Ancak bu izlenim bu floresans dedektör aşırı maruz tarafından önyargılı paneli A. gösterilen küçük ölçekli deneme daha (as içsel 70kDa bant göre değerlendirilecektir) biraz daha düşük olduğunu ima ölçümü. Deneyci checki Bunun nedeni olduCFTR oluşturmak proteolitik parçalarının varlığı için ng. Orada 130 kDa ve 100 kDa işaretleri arasında bazı floresan proteolitik parçaları için bu deneyde bazı kanıtlar vardır, ancak bu tam boy CFTR-GFP bandına göre çok zayıftır. Proteaz inhibitörleri burada açıklanan, biz hücre kırılması sonra CFTR proteolitik yıkımı için çok az delil bulmak. Önemli proteoliz görülürse, taze proteaz inhibitörü stok çözümler yapma öneririz. Ayrıca ticari proteaz inhibitörü kokteyl tabletler bu sistem için etkili olmadığını bulduk. Şekil 4 'de gösterildiği gibi 16 ötesine hücrelerinin büyümesini saat (post-indüksiyon) azalmıştır CFTR ekspresyonuna sebep olur. Bu muhtemelen belki de protein devir, maya proteini kalite kontrol makine 6-9,13 upregülasyonunun nedeniyle kaynaklanmaktadır. Mümkünse en uygun zaman hücreleri ma hasat gibi bu, galaktoz ile indüksiyon sonrası CFTR ifade düzeyleri izlemek için bu nedenle tavsiye ediliry bir laboratuvar diğerine değişir.
Şekil 1.. Plazmid CFTR yapı ihtiva eden mantar. CFTR-GFP füzyon-8His bir galaktoz (GAL1) arttırıcının kontrolü altında, 2μ p424GAL1 ifade vektörünün içine sokulur. Vektör, aynı zamanda, bir urasil seçim işaretleyici (URA) ve Ampisilin direnç geni (Amp) içerir.
Şekil 2. Görselleştirildiği protokolü özetleyen akış şeması.
Şekil 3. CFTR ifade ve arınma Temsilcisi SDS-poliakrilamid. Panel A beş rastgele CFTR ifade için tarandı transformant koloniler (şerit 1-5) aldı gösterir. Panel B 15L ferm izole edildi mikrozomları gösterirkültür girin. Panel C boyut dışlama kromatografisi takip afinite kromatografisi ile iki aşamalı arıtma sonrası elde edilen fare CFTR saflaştırılmış gösterir. Tüm jeller GFP alanı (solda) ve Coomassie sonra heyecan verici floresans (sağ) leke aydınlatma koşulları altında gösterilir. Moleküler ağırlık standartları göreceli konumları sol (kDa) üzerinde yer almaktadır.
Şekil 4. Maya CFTR ifade Temsilcisi verileri. Panel A galaktoz ile indüksiyon sonrası CFTR ifade bir zaman kurs gösterir. Hücre ekstreleri SDS-PAGE ile analiz edildi ve CFTR-GFP protein bandı için GFP floresans entegre edildi. Panel B hücreleri 16 saat sonrası indüksiyon GFP-ifade floresan mikroskobu için tipik sonuçlarını gösterir. Tipik olarak, hücrelerin sadece bir kısmını, yüksek seviyelerde ifade CFTR.
Discussion
Bu makale, kistik fibroz araştırma kolaylaştırmalıdır maya hücreleri murin CFTR proteini ifade etmek için bir yöntem sağlar. Amaç Kistik Fibrozis Vakfı (aracılığıyla sunulacaktır murin CFTR DNA yapı, serbest bırakılması ile bu kağıt bağlamak için http://www.cff.org/research/CFFT/ ). Diğer orthologs sonra kullanılabilir hale gelmelidir. CFTR içeren vektör ile maya hücrelerinin dönüşümü basit, ancak CFTR yüksek seviyelerde ifade koloniler için ekranda için önemlidir. Değişken ifade seviyeleri çeşitli faktörler ortaya çıkabilir, ancak plazmid başına hücre kopya sayısını muhtemelen varyasyonun önemli bir derecesine oluşturuyor. Burada anlatılan Kritik adımları CFTR eksprese maya hücreleri ve mikrozomal membran CFTR içeren üretim izin vermelidir. Bir kez değişim, büyüme, hasat ve maya hücrelerinin parçalanması purif, hakim olmuşturProteinin ication mümkün olmalıdır, ve Şekil 3'te çok faydalı bir referans olarak, bu durumda olmak üzere açıkça saflıkta bir örnek verdi. Bu proteinin saflaştırılması için detaylı metodoloji sağlamak için bu yazının bizim niyeti yoktur. Ancak, bu tür hücre parçalama ve mikrozom arınma gibi S.cerevisae ifade sistemine özgü bazı kritik aşağı arıtma adımlar vardır ve bunlar bu yazının ayrıntılı olarak dahil edilmiştir. Bu, belirtilmelidir ki, bu dışında kullanılacak olan iki yöntem ile, alternatif bir mantar hücre parçalama yöntemler böyle bir Fransız basınç hücrenin kullanımını olarak, kullanılan edilebilir. Rekombinant proteinin proteine (Şekil 4) indüksiyonundan sonra izlenebilir olanak sağlayan bir TEV-yarılabilir C-terminal GFP alanı vardır. Maya aynı koşullar 11, ve bu altında fluoresces yararlı bir arası sağlayabilir bir içsel 70kDa proteini (muhtemelen dehidrogenaz 12 süksinat) sahiptam hücre ekstreleri ya mikrozomlan CFTR bağıl ifade seviyelerinin için nal kalibrasyon standart (Şekil 3). Bu, galaktoz ile indüksiyonundan sonra hücre hasat zamanlama önemli olduğunu Şekil 4'te gösterilen veriler açıkça bellidir. CFTR damla verim precipitously indüksiyon yaklaşık 16 saat sonra, maya hücrelerinin herhangi bir tespit edilebilir CFTR indüksiyon 24 saat sonra çok az olacak şekilde.
Saflaştırılmış proteini verim 15 litre başına 1 fermentör kültürü-2 mg CFTR proteini ile ilgilidir. Kurtarma mikrozom aşamasına toplam CFTR-GFP protein kadar yaklaşık% 70 olarak tahmin edilmekte ve saflaştırılmış protein yaklaşık% 25 oranında iyileşme olabilir. S. Karakterizasyonu cerevisiae-ifade CFTR devam etmektedir. Şekil görülmektedir. 4, hücre proteinin yerini floresan mikroskobu ile izlenebilir. Floresans çok beklenen 10 gibi hücre çevresi etrafına bulunmasına rağmen, protein bazı, bir noktalı Lokalizasyon görüntüler, ya, ya daSadece geç bir Golgi / endosome yolu 14 veya belki de ER 4 ulaşım vezikül tomurcuklanan bir bölmesi aşağı aracılığıyla geri dönüşüm CFTR bağlı olabilir plazma zarı içinde. PNGaseF, proteinler deglycosylates bir enzim tedavisi bu unglycosylated olduğunu ima, SDS-PAGE üzerindeki CFTR proteini grubun göç minimal değişiklik gösterdi, ya da çok az glikozilasyon 15 vardır. Protein fosforilasyon durumu üzerinde deneyler devam etmektedir. Şimdiye kadar test deterjanların bazı olarak, daha önceden saflaştırılmış protein 2,15 yayınlanan benzemektedir oranlarda (bir CFTR spesifik inhibitör 16 ile engellenir) ATPaz aktivite gösterir. CFTR kanalı aktivitesinin belirlenmesi nispeten yüksek bir kritik misel konsantrasyonu (CMC) 17 olan bir deterjan nihai bir saflaştırma adım anlamına gelir saflaştırılmış protein, rekonstitüsyon gerektirecektir. Maya containin mikrozomlarıg CFTR gibi, genellikle "yumuşak" olarak kabul edilir dodesil maltoside 2 gibi deterjanlar dahil olmak üzere çeşitli yaygın olarak kullanılan deterjan 18 ile solublised edilebilir. Ancak en yüksek cmc deterjanları Bu deterjanların içine döviz herhangi bir arıtma düzeni geç bir aşamada düşünülmelidir düşündüren, şimdiye kadar, solubilsation için verimsiz olduğu kanıtlanmıştır.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz, CFTR 3D-Yapı Konsorsiyumu (hibe sayısı FORD08XX0) aracılığıyla bu iş için fon Kistik Fibrozis Vakfı (CFF) teşekkür ederim. Biz CFTR gen tasarım, özellikle bu iş için Konsorsiyum içinde tüm meslektaşlarımızın büyük katkılarından dolayı teşekkür. Ayrıca Drs çok değerli katkılarından dolayı. James Birtley (NCSR Demokritos, Yunanistan), Mark Genç (Cardiff Üniversitesi, Birleşik Krallık) ve David Drew (Imperial College, Londra, Birleşik Krallık) çalışmalarının ilk aşamalarında. Özellikle yazının eleştirel okuma Dr Ina Urbatsch (Texas Tech. Üniversitesi, Lubbock) teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FGY217 S.cerevisiae strain, with pep4 deletion 10 | |||
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0410 | |
| Complete supplement mixture without uracil | Formedium | DCS0169 | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306 | |
| D-galactose | Fisher | BP656-500 | |
| D-glucose | Fisher | D16-500 | |
| Pepstatin A | Sigma-Aldrich | P4265 | |
| Leupeptin | Merck | 108975 | |
| Chymostatin | Sigma-Aldrich | C7268 | |
| Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64) | Sigma-Aldrich | E3132 | |
| Amin–thylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF) | Sigma-Aldrich | A8456 | |
| Benzamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 434760 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher | BP120500 | |
| Tris-base | Formedium | TRIS01 | |
| Tris-HCl | Fisher | P631 | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| Glycerol | Fisher | 065017 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| n-dodecyl-β-D-maltopyranoside | Affymetrix | D310S | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| PageRuler Plus prestained protein standards | Fermentas | SM1811 | |
| NuSep tris-gly 4-20% gradient gels | NuSep | NB10-420 | |
| Instant Blue Coomassie Stain | Novexin | ISB1L | |
| Glass beads, acid washed | Sigma | G8772 | |
| 50ml Sterile Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.254 | |
| 2ml Sterile screw-top vials | Sarstedt | 72.694.005 | |
| 250ml Sterile Erlenmeyer baffled flasks | BD Biosciences | 355119 | |
| 2l Sterile Erlenmeyer baffled flasks | BD Biosciences | 355131 | |
| 2ml microfuge tubes | Sarstedt | 72.695 | |
| 0.2μM syringe filter | Sartorius | FC121 | |
| ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355618 | |
| centrifuge tubes | Beckman Coulter | 357000 | |
| 1l centrifuge pots | Beckman Coulter | 969329 | |
| Orbital shaking incubator with temperature control | New Brunswick Scientific | ||
| Deltavision RT restoration microscope | Applied Vision | ||
| Benchtop centrifuge | HERMLE | Z300 | |
| Benchtop microfuge | Fisher | 13-100-511 | |
| Vortex mixer | Star Labs | ||
| Typhoon Trio Scanner | GE Healthcare | 63-0055-87 | |
| LAS3000 imaging system | Fuji | ||
| 20l fermenter vessel and control unit | Applikon | ||
| Constant systems cell disrupter | Constant systems | ||
| Beadbeater cell disrupter | BioSpec | 1107900 | |
| Mini-beadbeater-16 | BioSpec | 607 | |
| JA-17 rotor | Beckman Coulter | 369691 | |
| Optima L-100 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392050 | |
| 50.2Ti rotor | Beckman Coulter | 337901 |
References
- Ford, R. C., Birtley, J., Rosenberg, M. F., Zhang, L. CFTR three-dimensional structure. Methods Mol. Biol. 741, 329-346 (2011).
- Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. CFTR). J. Biol. Chem. 279, 39051-39051 (2004).
- Zhang, L., Aleksandrov, L. A., Riordan, J. R., Ford, R. C. Domain location within the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein investigated by electron microscopy and gold labelling. Biochim. Biophys. Acta. 1808, 399-404 (2011).
- Kiser, G. L. Expression and degradation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in Saccharomyces cerevisiae. Arch. Biochem. Biophys. 390, 195-205 (2001).
- Huang, P., Stroffekova, K., Cuppoletti, J., Mahanty, S. K., Scarborough, G. A. Functional expression of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in yeast. Biochim. Biophys. Acta. 1281, 80-90 (1996).
- Ahner, A., Nakatsukasa, K., Zhang, H., Frizzell, R. A., Brodsky, J. L. Small heat-shock proteins select deltaF508-CFTR for endoplasmic reticulum-associated degradation. Mol. Biol. Cell. 18, 806-814 (2007).
- Fu, L., Sztul, E. ER-associated complexes (ERACs) containing aggregated cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are degraded by autophagy. Eur. J. Cell. Biol. 88, 215-226 (2009).
- Sun, F. Derlin-1 promotes the efficient degradation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and CFTR folding mutants. J. Biol. Chem. 281, 36856-36863 (2006).
- Zhang, Y., Michaelis, S., Brodsky, J. L. CFTR expression and ER-associated degradation in yeast. Methods Mol. Med. 70, 257-2565 (2002).
- Drew, D. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nat. Protoc. 3, 784-798 (2008).
- Knight, A. W., Billinton, N. Seeing the wood through the trees: A review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence. Anal. Biochem. 291, 175-197 (2001).
- Robinson, K. M., Lemire, B. D. Isolation and nucleotide sequence of the Saccharomyces cerevisiae gene for the succinate dehydrogenase flavoprotein subunit. J. Biol. Chem. 267, 10101-10107 (1992).
- Gnann, A., Riordan, J. R., Wolf, D. H. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator degradation depends on. the lectins Htm1p/EDEM and the Cdc48 protein complex in. 15, 4125-4135 (2004).
- Yoo, J. S. Non-conventional trafficking of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator through the early secretory pathway. J. Biol. Chem. 277, 11401-11409 (2002).
- Zhang, L. Architecture of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein and structural changes associated with phosphorylation and nucleotide binding. Journal of Structural Biology. 167, 242-251 (2009).
- Wellhauser, L. A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability. Mol. Pharmacol. 75, 1430-148 (2009).
- Ramjeesingh, M. A monomer is the minimum functional unit required for channel and ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Biochemistry. 40, 10700-10706 (2001).
- Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Anal. Biochem. 259, 89-97 (1998).
