Forsøg på at udtrykke den cystisk fibrose transmembran konduktans regulator (CFTR) i<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Har indtil nu gav relativt lave mængder af protein. Denne protokol og de tilhørende reagenser distribueres via cystisk fibrose Foundation bør tillade udarbejdelse af milligram mængder af denne 'svære' eukaryot membranprotein.
Cystisk fibrose transmembran konduktans regulator (CFTR), er en chlorid-kanal, at når muteret, kan give anledning til cystisk fibrose humans.There er derfor betydelig interesse i dette protein, men bestræbelser på at studere dets struktur og aktivitet er blevet vanskeliggjort af vanskeligheden udtrykke og oprense tilstrækkelige mængder af proteinet 1-3. Ligesom mange 'vanskelige' eukaryote membranproteiner, er udtryk i en hurtigt voksende organisme ønskeligt, men udfordrende, og i gær S. cerevisiae hidtil lave mængder opnåedes og hurtig nedbrydning af det rekombinante protein blev observeret 4-9. Proteiner involveret i behandlingen af rekombinant CFTR i gær er blevet beskrevet 6-9. I denne rapport beskriver vi en metode til ekspression af CFTR i gær og oprensning i signifikante mængder. Protokollen beskriver, hvordan de tidligere proteolyse problemer kan overvindes, og hvordan ekspressionsniveauer afCFTR kan blive kraftigt forbedret ved at ændre celle vækstbetingelser, og ved at styre induktion betingelser, navnlig den periode forud for celle høst. De reagants i forbindelse med denne protokol (murine CFTR-udtrykker gærceller eller gær plasmider), vil blive distribueret via den amerikanske cystisk fibrose Foundation, som har sponsoreret forskning. En artikel, der beskriver design og syntese af CFTR konstruktion anvendt i denne rapport vil blive offentliggjort særskilt (Urbatsch, I.;. Thibodeau, P. et al, upubliceret). I denne artikel vil vi forklare vores metode begynder med transformationen af gærcellerne med CFTR konstruere – indeholder gær-plasmid (fig. 1). Konstruktionen har et grønt fluorescerende protein (GFP)-sekvens fusioneret til CFTR ved sin C-terminus og følger udviklet af Drew et al. (2008) 10. GFP tillader ekspression og oprensning af CFTR følges relativt let. Jové visualiseret protokolol slutter efter fremstillingen af mikrosomer fra gærceller, selv om vi omfatter nogle forslag til oprensning af proteinet fra mikrosomer. Læsere kan ønske at tilføje deres egne modifikationer til mikrosom rensning procedure, afhænger af den endelige eksperimenter, der skal udføres med protein og det lokale udstyr til rådighed for dem. Gær-udtrykt CFTR-protein kan delvist oprenset under anvendelse metalion affinitetskromatografi under anvendelse af en indre polyhistidin rensnings-taggen. Efterfølgende gelpermeationskromatografi giver et protein, som synes at være> 90% rent, som bedømt ved SDS-PAGE og Coomassie-farvning af gelen.
Dette dokument tilvejebringer en fremgangsmåde til ekspression af murint CFTR-proteinet i gærceller, der skulle lette forskning cystisk fibrose. Målet er at knytte dette papir med udgivelsen af det murine CFTR DNA-konstruktion, som vil være tilgængelig via cystisk fibrose Foundation ( http://www.cff.org/research/CFFT/ ). Andre orthologer skulle blive tilgængelig senere. Transformation af gærceller med CFTR-holdige vektor er ligetil, men det er vigtigt at screene for kolonier, der udtrykker høje niveauer af CFTR. Variable ekspressionsniveauer kan skyldes flere faktorer, men antallet af kopier af plasmidet pr celle sandsynligvis udgør en signifikant grad af variation. Kritiske trin, der er beskrevet her, bør muliggøre produktion af CFTR-udtrykkende gærceller og CFTR-holdige mikrosomale membraner. Når transformation, vækst, høst og lysis af gærceller har mestret, purification af proteinet være muligt, og i figur 3 har vi har givet et eksempel på den renhed, der skal kunne opnås i dette tilfælde som en nyttig reference. Det er ikke vores hensigt i dette manuskript at give detaljeret metode til oprensning af proteinet. Imidlertid er der nogle kritiske nedstrøms oprensningstrin, der er specifikke for S.cerevisae ekspressionssystem, såsom cellelyse og mikrosom oprensning, og disse er medtaget i detaljer i dette håndskrift. Det skal imidlertid nævnes, at bortset fra de to metoder, vi har anvendt, kan alternative gær cellesprængning metoder kan anvendes, såsom anvendelse af en fransk trykcelle. Det rekombinante protein har en TEV-spaltelig C-terminale GFP domæne, der tillader at proteinet, der skal spores efter induktion (fig. 4). Gær har en iboende 70kDa protein (formentlig succinatdehydrogenase 12), der fluorescerer under de samme betingelser 11, og det kan give et nyttigt bl.a.Nal kalibreringsstandard til de relative ekspressionsniveauer af CFTR i hele celleekstrakter eller mikrosomer (fig. 3). Det er klart fra dataene vist i figur 4, at timingen af cellehøst efter induktion med galactose er afgørende. Udbytter af CFTR dråbe brat efter ca 16 timer for induktion, således at der næsten ikke noget detekterbart CFTR i gærceller efter 24 timer af induktion.
Udbyttet af oprenset protein er ca en-2 mg CFTR-protein pr 15 liters fermentor kultur. Genvinding kan estimeres som ca 70% af den totale CFTR-GFP-protein op til mikrosom fase og omkring 25% genvinding af oprensede protein. Karakterisering af S. cerevisiae-udtryk CFTR er i gang. Som det ses i fig. 4, kan proteinet placering i cellen monitoreres ved fluorescensmikroskopi. Skønt meget af fluorescens findes omkring periferien af cellen som forventet 10, en del af proteinet udviser en punktformet lokalisering, enten i ellerlige inden for plasmamembranen, som kunne skyldes CFTR genvindes ved hjælp af en forsinket Golgi / endosomale pathway 14 eller måske et rum nedstrøms for spirende af transport vesikler fra ER 4. Behandling med PNGaseF, et enzym, deglycosylates proteiner udviste minimal ændring i migration af CFTR-proteinet på SDS-PAGE, hvilket indebærer, at det er uglycosyleret, eller har minimal glycosylering 15. Forsøg på at phosphoryleringstilstanden af proteinet er i gang. I nogle af de detergenter testede hidtil viser det oprensede protein ATPase-aktivitet (som inhiberes af en CFTR-specifik inhibitor 16) i doseringer, der svarer til de tidligere offentliggjorte 2,15. Måling af CFTR-kanalaktivitet vil kræve rekonstituering af det oprensede protein, hvilket ville indebære et sidste oprensningstrin i et detergent, der har en relativt høj kritisk micellekoncentration (CMC) 17. Gær mikrosomer containing CFTR kan solublised med flere almindeligt anvendte detergenter 18, herunder detergenter såsom dodecyl maltosid 2, som generelt anses for at være "mild". Men de fleste store CMC rengøringsmidler har vist sig at være ineffektiv for solubilsation, så langt, tyder på, at udvekslingen i disse rengøringsmidler bør overvejes på et sent tidspunkt i enhver rensning ordning.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker cystisk fibrose Foundation (CFF) for at finansiere dette arbejde gennem sin CFTR 3D Structure Consortium (tilskud nummer FORD08XX0). Vi anerkender det store bidrag fra alle vores kolleger inden for konsortiet til dette arbejde, især i udformningen af CFTR gener. Vi anerkender også de uvurderlige bidrag Drs. James Birtley (NCSR Demokritos, Grækenland), Mark Young (University of Cardiff, Storbritannien) og David Drew (Imperial College, London, Storbritannien) i de tidlige faser af arbejdet. Vi takker især Dr. Ina Urbatsch (Texas Tech. University, Lubbock) til kritisk læsning af manuskriptet.
Name of reagent/equipment | Company | Catalogue No |
FGY217 S.cerevisiae strain, with pep4 deletion 10 | ||
Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0410 |
Complete supplement mixture without uracil | Formedium | DCS0169 |
Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306 |
D-galactose | Fisher | BP656-500 |
D-glucose | Fisher | D16-500 |
Pepstatin A | Sigma-Aldrich | P4265 |
Leupeptin | Merck | 108975 |
Chymostatin | Sigma-Aldrich | C7268 |
Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 |
Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64) | Sigma-Aldrich | E3132 |
Aminoethylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF) | Sigma-Aldrich | A8456 |
Benzamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 434760 |
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 |
dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 |
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher | BP120500 |
Tris-base | Formedium | TRIS01 |
Tris-HCl | Fisher | P631 |
D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 |
Glycerol | Fisher | 065017 |
NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 |
n-dodecyl-β-D-maltopyranoside | Affymetrix | D310S |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 |
PageRuler Plus prestained protein standards | Fermentas | SM1811 |
NuSep tris-gly 4-20% gradient gels | NuSep | NB10-420 |
Instant Blue Coomassie Stain | Novexin | ISB1L |
Glass beads, acid washed | Sigma | G8772 |
50ml Sterile Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.254 |
2ml Sterile screw-top vials | Sarstedt | 72.694.005 |
250ml Sterile Erlenmeyer baffled flasks | BD Biosciences | 355119 |
2l Sterile Erlenmeyer baffled flasks | BD Biosciences | 355131 |
2ml microfuge tubes | Sarstedt | 72.695 |
0.2μM syringe filter | Sartorius | FC121 |
ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355618 |
centrifuge tubes | Beckman Coulter | 357000 |
1l centrifuge pots | Beckman Coulter | 969329 |
Orbital shaking incubator with temperature control | New Brunswick Scientific | |
Deltavision RT restoration microscope | Applied Vision | |
Benchtop centrifuge | HERMLE | Z300 |
Benchtop microfuge | Fisher | 13-100-511 |
Vortex mixer | Star Labs | |
Typhoon Trio Scanner | GE Healthcare | 63-0055-87 |
LAS3000 imaging system | Fuji | |
20l fermenter vessel and control unit | Applikon | |
Constant systems cell disrupter | Constant systems | |
Beadbeater cell disrupter | BioSpec | 1107900 |
Mini-beadbeater-16 | BioSpec | 607 |
JA-17 rotor | Beckman Coulter | 369691 |
Optima L-100 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392050 |
50.2Ti rotor | Beckman Coulter | 337901 |