Pogingen om de cystische fibrose transmembraan geleidingsregulator (CFTR) drukken in<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Hebben tot nu toe leverde relatief lage hoeveelheden eiwit. Dit protocol en de bijbehorende reagentia verspreid via de Cystic Fibrosis Foundation moet het mogelijk maken de voorbereiding van milligram hoeveelheden van deze 'moeilijke' eukaryote membraaneiwit.
De cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is een chloride kanaal, dat wanneer gemuteerd, kan aanleiding geven tot cystische fibrose in humans.There is dan ook grote belangstelling voor dit eiwit, maar de inspanningen om de structuur en de activiteit te bestuderen werden gehinderd door de moeilijkheid te drukken en zuiveren voldoende hoeveelheden van het eiwit 1-3. Net als veel andere 'moeilijke' eukaryote membraaneiwitten, expressie in een snel groeiende organisme is wenselijk, maar uitdagend, en in de gist S. cerevisiae, voorzover geringe hoeveelheden werden verkregen en een snelle afbraak van het recombinante eiwit werd waargenomen 4-9. Eiwitten die bij de verwerking van recombinante CFTR in gist zijn beschreven 6-9. In dit verslag een methode beschreven voor de expressie van CFTR in gist en zuivering in significante hoeveelheden. Het protocol beschrijft hoe de eerdere proteolyse problemen kunnen worden opgelost en hoe expressie vanCFTR kan sterk worden verbeterd door aanpassing van de celgroei voorwaarden en het regelen van de inductie omstandigheden, met name de periode vóór cel oogsten. De reagentia in verband met dit protocol (muizen CFTR tot expressie gistcellen of gist plasmiden) zal verdeeld worden via de Amerikaanse Cystic Fibrosis Foundation, die sponsor van het onderzoek. Een artikel beschrijft het ontwerp en de synthese van het CFTR-construct die in dit rapport worden afzonderlijk gepubliceerd (Urbatsch, I.;. Thibodeau, P. et al., niet gepubliceerd). In dit artikel leggen we uit onze methode begint met de transformatie van de gistcellen met de CFTR te bouwen – bevattende gist plasmide (afb. 1). Het construct is een groen fluorescerend eiwit (GFP) sequentie gefuseerd aan CFTR op de C-terminus en volgt ontwikkeld door Drew et al.. (2008) 10. Het GFP kan de expressie en zuivering van CFTR relatief gemakkelijk worden gevolgd. De Jupiter gevisualiseerd protocolol is beëindigd na de bereiding van microsomen van de gistcellen, ook al nemen we een aantal suggesties voor de zuivering van het eiwit uit de microsomen. Lezer wenst eigen wijzigingen aan de microsoom zuiveringsprocedure, afhankelijk van de uiteindelijke experimenten uitgevoerd met het eiwit en de lokale materiaal ter beschikking. De gist-uitgedrukt CFTR eiwit kan gedeeltelijk worden gezuiverd met behulp van metaal-ion affiniteitschromatografie, met behulp van een intrinsieke polyhistidine zuivering tag. Na grootte-exclusie chromatografie levert een eiwit dat lijkt> 90% zuiver zoals beoordeeld door SDS-PAGE en Coomassie-kleuren van de gel.
Dit document verschaft een werkwijze voor de expressie van muizen CFTR-eiwit in gistcellen, die onderzoek te vergemakkelijken cystic fibrosis. Het doel is om dit papier te verbinden met de release van de muis CFTR DNA-constructie, die beschikbaar zijn via de Cystic Fibrosis Foundation ( http://www.cff.org/research/CFFT/ ). Andere orthologen moet later beschikbaar komen. Transformatie van de gistcellen met het CFTR-bevattende vector is eenvoudig, maar het is belangrijk om te screenen op kolonies die hoge niveaus van CFTR. Variabele expressie kunnen voortvloeien uit verschillende factoren, maar het aantal kopieën van het plasmide per cel waarschijnlijk goed voor een belangrijke mate van variatie. Kritische stappen die hier beschreven moet het mogelijk maken de productie van CFTR tot expressie gistcellen en CFTR-bevattende microsomale membranen. Na de transformatie, groei, oogst en lysis van gistcellen zijn knie, Purificatie van het eiwit mogelijk moet zijn en in figuur 3 hebben we een voorbeeld gegeven van de zuiverheid die moeten kunnen worden gehaald in dit geval een nuttig referentie. Het is niet onze bedoeling in dit manuscript aan gedetailleerde methodologie voor zuivering van het eiwit. Er zijn echter enkele kritische downstream zuivering stappen die specifiek zijn voor de S.cerevisae expressiesysteem, zoals mobiele lysis en microsoompreparaten zuivering, en deze zijn opgenomen in detail in dit manuscript. Opgemerkt zij echter dat afgezien van de beide methoden is gebruik kunnen alternatieve gistcel verstoring methoden worden toegepast, zoals het gebruik van een Franse drukcel. Het recombinant eiwit een TEV-splitsbare C-terminale domein GFP waarmee het eiwit te traceren na inductie (Fig. 4). Gist een intrinsieke 70kDa eiwit (waarschijnlijk succinaat dehydrogenase 12) dat fluoresceert onder dezelfde omstandigheden 11 en kan een nuttige onder voorzieninterne standaard voor de kalibratie relatieve expressieniveaus van CFTR geheel celextracten of microsomen (Fig. 3). Uit de gegevens weergegeven in figuur 4 dat het tijdstip van cellen geoogst na inductie met galactose cruciaal. Opbrengsten van CFTR druppel steil na ongeveer 16 uur van inductie, zodat er nauwelijks waarneembaar CFTR in gistcellen na 24 uur van inductie.
De opbrengst van het gezuiverde eiwit is over 1-2mg CFTR eiwit per 15 liter fermentor cultuur. Herstel kan worden geraamd ongeveer 70% van de totale CFTR-eiwit GFP tot microsoom fase en ongeveer 25% terugwinning van gezuiverd eiwit. Karakterisering van de S. cerevisiae-uitdrukking CFTR is aan de gang. Zoals in Fig. 4 kan het eiwit in de cel gelegen gecontroleerd door fluorescentiemicroscopie. Hoewel veel van de fluorescentie in de omgeving van de omtrek van de cel als verwachte 10 enkele eiwit geeft een gestippelde lokalisatie, in ofnet binnen de plasmamembraan die zou kunnen te wijten zijn aan recycling CFTR door middel van een late Golgi / endosomale route 14 of misschien wel een compartiment stroomafwaarts van het ontluiken van het vervoer blaasjes uit het ER 4. Behandeling met PNGaseF, een enzym dat proteïnen deglycosylates toonde minimale verandering in de migratie van het CFTR-eiwit band op SDS-PAGE, hetgeen inhoudt dat het unglycosylated of een minimale glycosylering 15. Experimenten op de fosforylatie toestand van het eiwit zijn aan de gang. In sommige wasmiddelen geteste dusver het gezuiverde eiwit wordt ATPase activiteit (die wordt geremd door een CFTR-specifieke remmer 16) met een snelheid die gelijk zijn aan die als eerder gepubliceerd 2,15. Meting van CFTR kanaal activiteit vereist oplossen van het gezuiverde eiwit dat een laatste zuiveringsstap in een wasmiddel, dat een relatief hoge kritische micelconcentratie (CMC) 17 heeft zou betekenen. Gist microsomen containing CFTR te solublised met verschillende gewoonlijk toegepast wasmiddelen 18 met detergenten, zoals dodecyl maltoside 2, die algemeen beschouwd als "licht". Maar de meeste hoge cmc wasmiddelen blijken te zijn inefficiënt voor solubilsation, tot nu toe, wat erop wijst dat de uitwisseling in deze wasmiddelen moet worden beschouwd in een laat stadium in een zuivering regeling.
The authors have nothing to disclose.
Wij danken de Cystic Fibrosis Foundation (CFF) voor de financiering van dit werk door middel van haar CFTR 3D-structuur Consortium (licentienummer FORD08XX0). Wij erkennen de enorme bijdrage van al onze collega's binnen het Consortium om dit werk, met name in het ontwerp van het CFTR-genen. We erkennen ook de waardevolle bijdragen van Drs. James Birtley (NCRO Demokritos, Griekenland), Mark Young (Universiteit van Cardiff, Verenigd Koninkrijk) en David Drew (Imperial College, Londen, VK) in de vroege stadia van het werk. We zijn vooral dank Dr Ina Urbatsch (Texas Tech. University, Lubbock) voor het kritisch lezen van het manuscript.
Name of reagent/equipment | Company | Catalogue No |
FGY217 S.cerevisiae strain, with pep4 deletion 10 | ||
Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0410 |
Complete supplement mixture without uracil | Formedium | DCS0169 |
Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306 |
D-galactose | Fisher | BP656-500 |
D-glucose | Fisher | D16-500 |
Pepstatin A | Sigma-Aldrich | P4265 |
Leupeptin | Merck | 108975 |
Chymostatin | Sigma-Aldrich | C7268 |
Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 |
Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64) | Sigma-Aldrich | E3132 |
Aminoethylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF) | Sigma-Aldrich | A8456 |
Benzamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 434760 |
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 |
dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 |
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher | BP120500 |
Tris-base | Formedium | TRIS01 |
Tris-HCl | Fisher | P631 |
D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 |
Glycerol | Fisher | 065017 |
NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 |
n-dodecyl-β-D-maltopyranoside | Affymetrix | D310S |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 |
PageRuler Plus prestained protein standards | Fermentas | SM1811 |
NuSep tris-gly 4-20% gradient gels | NuSep | NB10-420 |
Instant Blue Coomassie Stain | Novexin | ISB1L |
Glass beads, acid washed | Sigma | G8772 |
50ml Sterile Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.254 |
2ml Sterile screw-top vials | Sarstedt | 72.694.005 |
250ml Sterile Erlenmeyer baffled flasks | BD Biosciences | 355119 |
2l Sterile Erlenmeyer baffled flasks | BD Biosciences | 355131 |
2ml microfuge tubes | Sarstedt | 72.695 |
0.2μM syringe filter | Sartorius | FC121 |
ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355618 |
centrifuge tubes | Beckman Coulter | 357000 |
1l centrifuge pots | Beckman Coulter | 969329 |
Orbital shaking incubator with temperature control | New Brunswick Scientific | |
Deltavision RT restoration microscope | Applied Vision | |
Benchtop centrifuge | HERMLE | Z300 |
Benchtop microfuge | Fisher | 13-100-511 |
Vortex mixer | Star Labs | |
Typhoon Trio Scanner | GE Healthcare | 63-0055-87 |
LAS3000 imaging system | Fuji | |
20l fermenter vessel and control unit | Applikon | |
Constant systems cell disrupter | Constant systems | |
Beadbeater cell disrupter | BioSpec | 1107900 |
Mini-beadbeater-16 | BioSpec | 607 |
JA-17 rotor | Beckman Coulter | 369691 |
Optima L-100 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392050 |
50.2Ti rotor | Beckman Coulter | 337901 |