Tentativas para expressam a fibrose cística reguladora da condutância transmembrana (CFTR) em<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Têm, até agora, produziu quantidades relativamente baixas de proteína. Este protocolo e os reagentes associados distribuídos através da Fundação de Fibrose Cística deve permitir a preparação de quantidades de miligramas desse "difícil" proteína de membrana eucariótica.
A fibrose cística regulador da condutância transmembranar (CFTR) é um canal de cloreto de que, quando mutado, pode dar origem a fibrose cística em humans.There é, portanto, um interesse considerável na presente proteína, mas os esforços para estudar a sua estrutura e actividade tem sido dificultada pela dificuldade de expressar e purificação de quantidades suficientes de proteína de 1-3. Tal como muitos 'difíceis' proteínas de membrana eucarióticas, a expressão num organismo de crescimento rápido é desejável, mas desafio, e na levedura S. cerevisiae, até agora baixas quantidades foram obtidos e rápida degradação da proteína recombinante foi observada 4-9. Proteínas envolvidas no processamento de CFTR recombinante em levedura foram descritos 6-9. Neste relatório nós descrevemos um método para a expressão de CFTR em levedura e sua purificação em quantidades significativas. O protocolo descreve como os problemas de proteólise anteriores podem ser ultrapassados e os níveis de expressão de comoCFTR pode ser muito melhorada pela modificação das condições de crescimento de células e controlando as condições de indução, em particular o período de tempo antes de a colheita das células. Os reagants associados com este protocolo (CFTR murina expressando células de levedura ou plasmídeos de levedura) serão distribuídos através da Cystic Fibrosis Foundation EUA, que patrocinou a pesquisa. Um artigo descrevendo o projeto e síntese da CFTR construto utilizado neste relatório será publicado separadamente (Urbatsch, I.;. Thibodeau, P. et al, inédito). Neste artigo, vamos explicar o nosso método de início com a transformação das células de levedura com a construção de CFTR – levedura contendo plasmídeo (Fig. 1). A construção tem uma sequência de proteína verde fluorescente (GFP) fundido com CFTR no seu terminal C e segue o sistema desenvolvido por Drew et al. (2008) 10. O GFP permite a expressão e purificação de CFTR a ser seguido de forma relativamente fácil. O protocolo JOVE visualizadosacabamentos ol após a preparação de microssomas a partir das células de levedura, embora incluem algumas sugestões para a purificação da proteína a partir dos microssomas. Os leitores pode desejar adicionar suas próprias modificações ao processo de purificação microssoma, dependente das experiências finais a serem realizadas com a proteína e do equipamento local disponível para eles. A levedura-expressa a proteína CFTR pode ser parcialmente purificada utilizando cromatografia de afinidade de iões metálicos, usando uma marca de purificação intrínseca poli-histidina. Cromatografia de exclusão de tamanho subsequente produz uma proteína que parece ser> 90% pura, conforme avaliado por SDS-PAGE e coloração com Coomassie do gel.
Este documento apresenta um método para a expressão da proteína CFTR murino em células de levedura, que deve facilitar a pesquisa sobre a fibrose cística. O objetivo é vincular esse papel com o lançamento do murino CFTR DNA construção, que estará disponível através da Cystic Fibrosis Foundation ( http://www.cff.org/research/CFFT/ ). Ortólogos outro deve ficar disponível mais tarde. Transformação das células de levedura com o vector contendo CFTR é simples, mas é importante para o rastreio de colónias que expressam níveis elevados de CFTR. Os níveis de expressão variável pode surgir a partir de vários factores, mas o número de cópias do plasmídeo por célula provavelmente representa um grau significativo de variação. As etapas críticas descritas aqui devem permitir a produção de CFTR expressam células de levedura e CFTR contendo membranas microssomais. Uma vez que a transformação, o crescimento da colheita, e lise de células de levedura foram dominados, Purificação da proteína deve ser possível, e na Figura 3, deram um exemplo da pureza que deve ser exequível, neste caso, como valor de referência útil. Não é nossa intenção neste manuscrito para fornecer metodologia detalhada para a purificação da proteína. No entanto, há algumas críticas passos de purificação a jusante que são específicos para o sistema de expressão S.cerevisae, tais como a lise das células e purificação microssoma, e estes foram incluídos em detalhe neste manuscrito. Deve ser mencionado, contudo, que para além dos dois métodos já foram utilizados, alternativas de levedura métodos rompimento celular podem ser empregues, tais como a utilização de uma célula de pressão francesa. A proteína recombinante tem um TEV-clivável domínio GFP C-terminal que permite que a proteína a ser rastreado após a indução (Fig. 4). A levedura tem uma proteína intrínseca 70kDa (provavelmente succinato desidrogenase 12), que fluoresce sob as mesmas condições de 11, e este pode proporcionar um entre útilpadrão de calibração nal para os níveis de expressão relativa da CFTR em extractos de células inteiras ou microssomas (Fig. 3). É evidente a partir dos dados mostrados na Figura 4 que o momento da colheita de células após a indução com galactose é crucial. As produções de gota CFTR precipitadamente após cerca de 16 h de indução, de modo que não há quase qualquer CFTR detectável em células de levedura após 24 h de indução.
O rendimento de proteína purificada é de cerca de 1-2mg proteína CFTR por 15 cultura fermentador litro. A recuperação pode ser estimada como cerca de 70% da proteína CFTR GFP-total até ao estádio de microssoma, e recuperação de cerca de 25% da proteína purificada. Caracterização da S. cerevisiae, expressa CFTR está em curso. Como visto na fig. 4, a localização da proteína na célula pode ser monitorizada por microscopia de fluorescência. Embora muito da fluorescência é encontrada ao redor da periferia da célula como 10 esperado, alguma da proteína exibe uma localização ponteada, quer em, ouapenas no interior da membrana plasmática, que pode ser devido a CFTR reciclagem através de uma via de Golgi / endossomal tardia 14 ou talvez a jusante compartimento da floração de vesículas de transporte do ER 4. O tratamento com PNGaseF, uma enzima que deglycosylates proteínas, mostraram alteração mínima da migração da banda de proteína CFTR em SDS-PAGE, o que implica que é não glicosilada, ou tem de glicosilação mínimo 15. Experiências sobre o estado de fosforilação da proteína estão em curso. Em alguns dos detergentes testados até à data, a proteína purificada exibe actividade ATPase (que é inibida por um inibidor específico CFTR 16) a taxas que são semelhantes aos anteriormente publicado 2,15. Medição da actividade do canal CFTR exigirá a reconstituição da proteína purificada, o que implicaria um passo de purificação final em um detergente que tem uma relativamente elevada concentração micelar crítica (CMC) 17. Levedura microssomas containing CFTR pode ser solublised com vários detergentes vulgarmente utilizados 18, incluindo detergentes tais como dodecil maltosídeo 2, os quais são geralmente considerados 'suave'. No entanto mais elevados detergentes cmc provaram ser ineficientes para solubilsation, até agora, o que sugere que em troca estes detergentes devem ser considerados numa fase tardia em qualquer esquema de purificação.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Cystic Fibrosis Foundation (CFF) para o financiamento deste trabalho através da sua Consórcio Estrutura CFTR 3D (subvenção número FORD08XX0). Reconhecemos a enorme contribuição de todos os nossos colegas dentro do Consórcio para este trabalho, em particular na concepção dos genes CFTR. Agradecemos também as valiosas contribuições dos drs. James Birtley (NCSR Demokritos, Grécia), Mark Young (Universidade de Cardiff, Reino Unido) e David Drew (Imperial College, Londres, Reino Unido) nos estágios iniciais do trabalho. Agradecemos especialmente a Dra. Ina Urbatsch (Texas Tech. University, Lubbock) para a leitura crítica do manuscrito.
Name of reagent/equipment | Company | Catalogue No |
FGY217 S.cerevisiae strain, with pep4 deletion 10 | ||
Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0410 |
Complete supplement mixture without uracil | Formedium | DCS0169 |
Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306 |
D-galactose | Fisher | BP656-500 |
D-glucose | Fisher | D16-500 |
Pepstatin A | Sigma-Aldrich | P4265 |
Leupeptin | Merck | 108975 |
Chymostatin | Sigma-Aldrich | C7268 |
Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 |
Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64) | Sigma-Aldrich | E3132 |
Aminoethylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF) | Sigma-Aldrich | A8456 |
Benzamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 434760 |
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 |
dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 |
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher | BP120500 |
Tris-base | Formedium | TRIS01 |
Tris-HCl | Fisher | P631 |
D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 |
Glycerol | Fisher | 065017 |
NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 |
n-dodecyl-β-D-maltopyranoside | Affymetrix | D310S |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 |
PageRuler Plus prestained protein standards | Fermentas | SM1811 |
NuSep tris-gly 4-20% gradient gels | NuSep | NB10-420 |
Instant Blue Coomassie Stain | Novexin | ISB1L |
Glass beads, acid washed | Sigma | G8772 |
50ml Sterile Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.254 |
2ml Sterile screw-top vials | Sarstedt | 72.694.005 |
250ml Sterile Erlenmeyer baffled flasks | BD Biosciences | 355119 |
2l Sterile Erlenmeyer baffled flasks | BD Biosciences | 355131 |
2ml microfuge tubes | Sarstedt | 72.695 |
0.2μM syringe filter | Sartorius | FC121 |
ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355618 |
centrifuge tubes | Beckman Coulter | 357000 |
1l centrifuge pots | Beckman Coulter | 969329 |
Orbital shaking incubator with temperature control | New Brunswick Scientific | |
Deltavision RT restoration microscope | Applied Vision | |
Benchtop centrifuge | HERMLE | Z300 |
Benchtop microfuge | Fisher | 13-100-511 |
Vortex mixer | Star Labs | |
Typhoon Trio Scanner | GE Healthcare | 63-0055-87 |
LAS3000 imaging system | Fuji | |
20l fermenter vessel and control unit | Applikon | |
Constant systems cell disrupter | Constant systems | |
Beadbeater cell disrupter | BioSpec | 1107900 |
Mini-beadbeater-16 | BioSpec | 607 |
JA-17 rotor | Beckman Coulter | 369691 |
Optima L-100 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392050 |
50.2Ti rotor | Beckman Coulter | 337901 |