企图表达的囊性纤维化跨膜电导调节器(CFTR)<em>酿酒酵母</em>,到现在为止,已产生的蛋白质含量相对较低。通过囊性纤维化基金会分发本协议及相关的试剂应允许毫克这个'困难'真核生物膜蛋白的准备。
囊性纤维化跨膜电导调节器(CFTR)是氯离子通道,如果发生变异,可引起囊性纤维化humans.There是相当大的兴趣因此,在这种蛋白质,但研究其结构和活动的努力,已困难的阻碍表达和纯化足够数量的蛋白质1-3。像许多“困难”的真核生物膜蛋白,在一个快速增长的有机体表达是可取的,但具有挑战性的,在酵母学酵母 ,到目前为止,低量得到快速降解的重组蛋白,观察4-9。已在处理重组CFTR基因在酵母中的蛋白质参与6-9。在这份报告中,我们描述了一种方法在酵母和大量的净化CFTR的表达。协议描述如何可以克服早期的水解问题及如何表达水平通过修改细胞的生长条件,并通过控制诱导条件,CFTR可大大改善,特别是细胞收获前的一段时间。 reagants协议(CFTR的表达酵母细胞或酵母质粒)将通过美国囊性纤维化基金会,该基金会已赞助这一研究的分布式小鼠与此相关的。文章描述在本报告采用的设计和合成的CFTR结构将另行公布(Urbatsch,一;锡伯杜,体育等 ,未发表)。在这篇文章中,我们将解释我们的酵母细胞的CFTR建设与改造的方法开始 – 含有酵母质粒(图1)。该结构具有绿色荧光蛋白(GFP)序列融合在其C-末端CFTR如下德鲁等人开发的系统。(2008)10。允许CFTR的表达和纯化的GFP应遵循相对容易。朱庇特的可视化protocOL结束后,准备从酵母细胞中的微粒,虽然我们包括从微粒的蛋白质纯化的一些建议。读者不妨给自己加修改微粒净化过程,依赖于与蛋白质和向他们提供本地设备进行最后的实验。酵母表达的CFTR蛋白可以部分使用金属离子亲和层析纯化,用一种内在的多聚组氨酸纯化标签。随后体积排阻色谱产生一种蛋白质,它似乎是纯> 90%,经SDS-PAGE和凝胶考马斯染色判断。
本文提供了一个表达小鼠CFTR蛋白在酵母细胞中,它应该促进囊性纤维化研究的方法。这样做的目的是连接释放小鼠的CFTR基因的DNA结构,这将是通过囊性纤维化基金会(本文http://www.cff.org/research/CFFT/ )。其他同源应成为晚些时候推出。的与CFTR含载体的酵母细胞的转化是简单的,但重要的是屏幕CFTR的表达水平高的殖民地。可变的表达水平可能出现的几个因素,但质粒每个细胞的副本的数量可能占了显著的变化程度。这里所描述的关键步骤,应该允许CFTR的表达酵母细胞的CFTR含有微粒膜的生产。一旦转型,酵母细胞的生长,收获和裂解已掌握,purification的蛋白质应该是可能的,并在图3中,我们作为一个有用的基准,应该在这种情况下实现的纯度的一个例子。这不是我们在这个手稿的意向,提供详细的方法,蛋白质纯化。不过,也有一些关键的下游纯化步骤是特定的S.cerevisae表达系统,如细 胞裂解和微粒净化,这些都被包括在这个手稿的详细。然而,应该提到的是,除了我们使用这两个方法,替代酵母细胞破碎方法可以聘用,如使用了法国的压力细胞。重组蛋白的裂解1 TEV-C-末端的绿色荧光蛋白域,使蛋白质被诱导后跟踪(图4)。酵母有一种内在的70kDa蛋白(有可能琥珀酸脱氢酶12)荧光在相同条件下11,这可以提供一个有用的跨CFTR的相对表达水平,在全细胞提取物或微粒的信号校准标准(图3)。它是由半乳糖诱导后,细胞收获时间是至关重要的,如图4所示的清晰数据。 CFTR的下降的产量急剧诱导后约16小时,以便有诱导24小时后检测的CFTR在酵母细胞中的任何勉强。
纯化蛋白的产量大约是1 – 2毫克每15升发酵罐培养的CFTR蛋白。可以恢复估计约70%的总CFTR的绿色荧光蛋白微粒阶段,纯化的蛋白质和25%左右恢复。表征的的S.酵母表达的CFTR是正在进行中。正如图。 4,蛋白质在细胞内的位置可通过荧光显微镜监测。虽然大部分的荧光预期10细胞的边缘周围发现,一些蛋白质会显示一个点状的本地化,无论是在或内质膜这可能是由于CFTR通过后期高尔基/内体通路14或者出芽从ER 4运输囊泡下游舱室回收。治疗与PNGaseF,的酶deglycosylates蛋白质,在SDS-PAGE电泳迁移的CFTR蛋白带的最小变化表明,这意味着它是unglycosylated,或具有最小的糖基化15。蛋白磷酸化状态的实验正在进行中。到目前为止测试的一些洗涤剂,纯化的蛋白显示ATP酶活性的(即由16的 CFTR特定抑制剂抑制)率是相似的原样2,15。的CFTR通道活性的测量,需要重组的纯化蛋白,这将意味着在最后一个洗涤剂的净化步骤,有相对较高的临界胶束浓度(CMC)17。酵母微粒containinĞ,CFTR可solublised几个普遍采用的洗涤剂18,包括清洁剂,如十二烷基麦芽糖2,被普遍认为是“温和”。然而,最高CMC洗涤剂已被证明是solubilsation低效,到目前为止,交流,到这些洗涤剂,应考虑在后期在任何净化计划。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢为这项工作的资金通过其CFTR的三维结构联合会(授予数量FORD08XX0)的囊性纤维化基金会(CFF)。我们承认在这项工作的协会全体同仁的巨大贡献,特别是在设计的CFTR基因。我们也承认博士的宝贵贡献。詹姆斯·伯特利(NCSR Demokritos,希腊),马克·扬(英国卡迪夫大学,英国)和大卫·德鲁(伦敦帝国学院,英国),在工作的早期阶段。我们特别感谢手稿的关键读博士伊娜Urbatsch(德州理工大学,拉伯克)。
Name of reagent/equipment | Company | Catalogue No |
FGY217 S.cerevisiae strain, with pep4 deletion 10 | ||
Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0410 |
Complete supplement mixture without uracil | Formedium | DCS0169 |
Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306 |
D-galactose | Fisher | BP656-500 |
D-glucose | Fisher | D16-500 |
Pepstatin A | Sigma-Aldrich | P4265 |
Leupeptin | Merck | 108975 |
Chymostatin | Sigma-Aldrich | C7268 |
Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 |
Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64) | Sigma-Aldrich | E3132 |
Aminoethylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF) | Sigma-Aldrich | A8456 |
Benzamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 434760 |
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 |
dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 |
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher | BP120500 |
Tris-base | Formedium | TRIS01 |
Tris-HCl | Fisher | P631 |
D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 |
Glycerol | Fisher | 065017 |
NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 |
n-dodecyl-β-D-maltopyranoside | Affymetrix | D310S |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 |
PageRuler Plus prestained protein standards | Fermentas | SM1811 |
NuSep tris-gly 4-20% gradient gels | NuSep | NB10-420 |
Instant Blue Coomassie Stain | Novexin | ISB1L |
Glass beads, acid washed | Sigma | G8772 |
50ml Sterile Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.254 |
2ml Sterile screw-top vials | Sarstedt | 72.694.005 |
250ml Sterile Erlenmeyer baffled flasks | BD Biosciences | 355119 |
2l Sterile Erlenmeyer baffled flasks | BD Biosciences | 355131 |
2ml microfuge tubes | Sarstedt | 72.695 |
0.2μM syringe filter | Sartorius | FC121 |
ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355618 |
centrifuge tubes | Beckman Coulter | 357000 |
1l centrifuge pots | Beckman Coulter | 969329 |
Orbital shaking incubator with temperature control | New Brunswick Scientific | |
Deltavision RT restoration microscope | Applied Vision | |
Benchtop centrifuge | HERMLE | Z300 |
Benchtop microfuge | Fisher | 13-100-511 |
Vortex mixer | Star Labs | |
Typhoon Trio Scanner | GE Healthcare | 63-0055-87 |
LAS3000 imaging system | Fuji | |
20l fermenter vessel and control unit | Applikon | |
Constant systems cell disrupter | Constant systems | |
Beadbeater cell disrupter | BioSpec | 1107900 |
Mini-beadbeater-16 | BioSpec | 607 |
JA-17 rotor | Beckman Coulter | 369691 |
Optima L-100 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392050 |
50.2Ti rotor | Beckman Coulter | 337901 |