में सिस्टिक फाइब्रोसिस transmembrane प्रवाहकत्त्व नियामक (CFTR) को व्यक्त करने का प्रयास<em> Saccharomyces cerevisiae</em> अब तक, प्रोटीन की अपेक्षाकृत कम मात्रा में मिले. इस प्रोटोकॉल और संबद्ध अभिकर्मकों सिस्टिक फाइब्रोसिस फाउंडेशन के माध्यम से वितरित की इस 'मुश्किल' यूकेरियोटिक झिल्ली प्रोटीन के milligram मात्रा में तैयार करने की अनुमति चाहिए.
The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many ‘difficult’ eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct – containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be >90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.
इस कागज खमीर कोशिकाओं में murine CFTR प्रोटीन है, जो सिस्टिक फाइब्रोसिस पर अनुसंधान की सुविधा चाहिए की अभिव्यक्ति के लिए एक तरीका प्रदान करता है. उद्देश्य इस पत्र के murine CFTR डीएनए का निर्माण, जो सिस्टिक फाइब्रोसिस फाउंडेशन (के माध्यम से उपलब्ध हो जाएगा की रिहाई के साथ लिंक है http://www.cff.org/research/CFFT/ ). अन्य orthologs बाद में उपलब्ध हो जाना चाहिए. खमीर कोशिकाओं के परिवर्तन CFTR युक्त वेक्टर साथ सीधा है, लेकिन यह कालोनियों CFTR के उच्च स्तर को व्यक्त करने के लिए स्क्रीन के लिए महत्वपूर्ण है. चर अभिव्यक्ति के स्तर को कई कारकों से उत्पन्न हो सकता है, लेकिन प्लाज्मिड प्रति सेल की प्रतियों की संख्या शायद बदलाव का एक महत्वपूर्ण डिग्री के लिए खातों. क्रिटिकल यहाँ वर्णित चरणों CFTR व्यक्त खमीर कोशिकाओं और झिल्ली माइक्रोसोमल CFTR युक्त के उत्पादन की अनुमति चाहिए. एक बार परिवर्तन, विकास, कटाई, और खमीर कोशिकाओं के सेल में महारत हासिल किया गया है, purifप्रोटीन का ication संभव होना चाहिए, और चित्रा 3 में हम पवित्रता है कि इस मामले में एक उपयोगी बेंचमार्क के रूप में प्राप्त होना चाहिए का एक उदाहरण दिया है. यह हमारा इरादा इस पांडुलिपि में प्रोटीन की शुद्धि के लिए विस्तृत कार्यप्रणाली प्रदान नहीं है. हालांकि, वहाँ कुछ महत्वपूर्ण अनुप्रवाह शुद्धि कदम कि सेल और microsome शुद्धि जैसे S.cerevisae अभिव्यक्ति प्रणाली, के लिए विशिष्ट हैं, और इन के इस पांडुलिपि में विस्तार में शामिल किया गया है. यह उल्लेख किया जाना चाहिए, तथापि, कि दो तरीकों का इस्तेमाल किया है हम से अलग, वैकल्पिक खमीर सेल विघटन तरीकों एक फ्रेंच दबाव सेल के उपयोग के रूप में हो सकता है, नियोजित कर सकते हैं. पुनः संयोजक प्रोटीन TEV – cleavable GFP सी टर्मिनल डोमेन है कि प्रोटीन प्रेरण के बाद ट्रैक करने के लिए छवि (4) की अनुमति देता है. खमीर एक आंतरिक 70kDa (शायद 12 डिहाइड्रोजनेज succinate) प्रोटीन है कि एक ही 11 की स्थिति, और इस के तहत fluoresces एक उपयोगी अंतर प्रदान कर सकते हैंपूरे सेल अर्क या microsomes के के में CFTR के सापेक्ष अभिव्यक्ति के स्तर के लिए अंतिम अंशांकन मानक छवि (3). चित्रा 4 में दिखाया गया कि galactose के साथ शामिल होने के बाद सेल कटाई के समय महत्वपूर्ण है डेटा से स्पष्ट है. CFTR बूंद के पैदावार precipitously प्रेरण के बारे में 16 घंटे के बाद, तो है कि वहाँ मुश्किल से खमीर कोशिकाओं में शामिल के 24 घंटे के बाद किसी भी detectable CFTR है.
शुद्ध प्रोटीन की उपज 1-2mg 15 लीटर किण्वक संस्कृति के प्रति CFTR प्रोटीन के बारे में है. वसूली कुल CFTR GFP microsome चरण के लिए ऊपर प्रोटीन के बारे में 70% के रूप में अनुमान लगाया जा सकता है, और शुद्ध प्रोटीन के बारे में 25% वसूली. एस के विशिष्ट वर्णन cerevisiae-व्यक्त CFTR चल रही है. के रूप में छवि में देखा. 4, सेल में प्रोटीन के स्थान प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा नजर रखी जा सकती है. हालांकि प्रतिदीप्ति बहुत उम्मीद 10 के रूप में सेल की परिधि के आसपास पाया जाता है, प्रोटीन के कुछ कबरा स्थानीयकरण प्रदर्शित करता है या तो में, याबस जो एक देर से 14 / Golgi endosomal मार्ग या शायद ईआर से 4 परिवहन vesicles की नवोदित के एक डिब्बे के बहाव के माध्यम से रीसाइक्लिंग CFTR के कारण हो सकता है प्लाज्मा झिल्ली के अंदर. उपचार के साथ, एक एंजाइम है कि प्रोटीन deglycosylates PNGaseF, एसडीएस पृष्ठ पर CFTR प्रोटीन बैंड के प्रवास में मामूली बदलाव से पता चला जिसका अर्थ कि यह unglycosylated है, या कम से कम ग्लाइकोसिलेशन 15 है. प्रोटीन की phosphorylation राज्य पर प्रयोग चल रहे हैं. अब तक परीक्षण किया डिटर्जेंट के कुछ में, शुद्ध प्रोटीन कि पहले 2,15 प्रकाशित उन लोगों के लिए समान दर पर ATPase गतिविधि प्रदर्शित करता है (कि CFTR विशेष 16 अवरोध करनेवाला से हिचकते हैं). CFTR चैनल गतिविधि की माप शुद्ध प्रोटीन है, जो एक साबुन में एक अंतिम शोधन कदम है कि एक अपेक्षाकृत उच्च महत्वपूर्ण micelle (सीएमसी) एकाग्रता 17 मतलब होगा के पुनर्गठन की आवश्यकता होगी. खमीर containin microsomesजी CFTR कई आमतौर पर कार्यरत 18 में dodecyl maltoside 2, जो आम तौर पर 'हल्के' माना जाता है जैसे डिटर्जेंट सहित डिटर्जेंट, के साथ solublised जा सकता है. हालांकि सबसे उच्च सीएमसी डिटर्जेंट solubilsation के लिए अक्षम हो सिद्ध कर दिया है, अब तक, सुझाव है कि इन डिटर्जेंट में विनिमय किसी भी शुद्धि योजना में देर से मंच पर विचार किया जाना चाहिए.
The authors have nothing to disclose.
हम अपने CFTR 3D संरचना कंसोर्टियम (अनुदान FORD08XX0 संख्या) के माध्यम से इस काम के वित्तपोषण के लिए सिस्टिक फाइब्रोसिस फाउंडेशन (CFF) धन्यवाद. हम यह काम करने के लिए कंसोर्टियम भीतर CFTR जीनों के डिजाइन में विशेष रूप से हमारे सभी सहयोगियों का बड़ा योगदान को स्वीकार करते हैं. हम भी डीआरएस का अमूल्य योगदान को स्वीकार करते हैं. Birtley जेम्स (NCSR Demokritos, ग्रीस), मार्क (कार्डिफ विश्वविद्यालय, ब्रिटेन) युवा और काम की प्रारंभिक अवस्था में डेविड (इंपीरियल कॉलेज, लंदन, ब्रिटेन) आकर्षित किया. हम विशेष रूप से पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए धन्यवाद में डा. Ina Urbatsch (टेक्सास टेक विश्वविद्यालय, Lubbock).
Name of reagent/equipment | Company | Catalogue No |
FGY217 S.cerevisiae strain, with pep4 deletion 10 | ||
Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0410 |
Complete supplement mixture without uracil | Formedium | DCS0169 |
Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306 |
D-galactose | Fisher | BP656-500 |
D-glucose | Fisher | D16-500 |
Pepstatin A | Sigma-Aldrich | P4265 |
Leupeptin | Merck | 108975 |
Chymostatin | Sigma-Aldrich | C7268 |
Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 |
Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64) | Sigma-Aldrich | E3132 |
Aminoethylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF) | Sigma-Aldrich | A8456 |
Benzamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 434760 |
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 |
dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 |
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher | BP120500 |
Tris-base | Formedium | TRIS01 |
Tris-HCl | Fisher | P631 |
D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 |
Glycerol | Fisher | 065017 |
NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 |
n-dodecyl-β-D-maltopyranoside | Affymetrix | D310S |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 |
PageRuler Plus prestained protein standards | Fermentas | SM1811 |
NuSep tris-gly 4-20% gradient gels | NuSep | NB10-420 |
Instant Blue Coomassie Stain | Novexin | ISB1L |
Glass beads, acid washed | Sigma | G8772 |
50ml Sterile Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.254 |
2ml Sterile screw-top vials | Sarstedt | 72.694.005 |
250ml Sterile Erlenmeyer baffled flasks | BD Biosciences | 355119 |
2l Sterile Erlenmeyer baffled flasks | BD Biosciences | 355131 |
2ml microfuge tubes | Sarstedt | 72.695 |
0.2μM syringe filter | Sartorius | FC121 |
ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355618 |
centrifuge tubes | Beckman Coulter | 357000 |
1l centrifuge pots | Beckman Coulter | 969329 |
Orbital shaking incubator with temperature control | New Brunswick Scientific | |
Deltavision RT restoration microscope | Applied Vision | |
Benchtop centrifuge | HERMLE | Z300 |
Benchtop microfuge | Fisher | 13-100-511 |
Vortex mixer | Star Labs | |
Typhoon Trio Scanner | GE Healthcare | 63-0055-87 |
LAS3000 imaging system | Fuji | |
20l fermenter vessel and control unit | Applikon | |
Constant systems cell disrupter | Constant systems | |
Beadbeater cell disrupter | BioSpec | 1107900 |
Mini-beadbeater-16 | BioSpec | 607 |
JA-17 rotor | Beckman Coulter | 369691 |
Optima L-100 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392050 |
50.2Ti rotor | Beckman Coulter | 337901 |