Summary
에 낭성 섬유증의 transmembrane의 전도성 조정기 (CFTR)를 표현하는 시도
Abstract
낭성 섬유증의 transmembrane의 전도성 조정기 (CFTR)가 변이된 때, 따라서이 단백질에 상당한 관심이있다 humans.There의 낭성 섬유증을 야기할 수있는 염화물 채널이지만, 그 구조 및 활동을 연구하기위한 노력이 어려움에 의해 방해되었다 1-3 단백질의 충분한 양을 표현과 정화의. 많은 '어려운'진핵세포 멤브레인 단백질과 마찬가지로 빠르게 성장하는 유기체의 표현이 바람직하지만, 도전이며, 효모 S.의 cerevisiae는 지금까지 낮은 금액이 취득되었으며 재조합 단백질의 급격한 저하는 4-9을 관찰했다. 효모에서 재조합 CFTR의 처리에 관련된 단백질은 6-9를 설명하고있다.이 보고서에 따르면 우리는 상당한 금액의 효모와 정화의 CFTR의 표현을위한 방법론을 설명합니다. 프로토콜은 이전 proteolysis 문제를 극복할 수있는 방법을 설명하는 방법과 표현 수준CFTR은 크게 세포 수확 이전 특정 기간 동안, 세포 성장 조건을 수정하여하고 유도 조건을 제어함으로써 향상시킬 수 있습니다. 이 프로토콜 (murine CFTR은 - 표현 효모 세포 또는 효모 plasmids)이 연구를 후원했다 미국 낭성 섬유증 재단을 통해 배포됩니다 연관된 reagants. CFTR의 디자인과 합성이 보고서에 사용된 개념 설명 문서 (.; Thibodeau, P. 외, 게시되지 않은 Urbatsch, 전) 별도로 게시됩니다. 플라스미드 포함 효모 (그림 1) -이 문서에서 우리는 CFTR은 구조와 효모 세포의 변화와 우리의 방법으로 시작을 설명합니다. 구조는 10의 C-말단에서 CFTR하는 융합 녹색 형광 단백질 (GFP) 시퀀스를 가지고 있으며, 드류 외 개발한 시스템을 따르고 있습니다. (2008). GFP는 CFTR의 표현과 정화가 비교적 쉽게 따라 할 수 있습니다. 주피터 시각 protoc효모 세포로부터 microsomes의 준비 후 똑똑한 마감재, 우리 microsomes에서 단백질의 정화를위한 몇 가지 제안을 포함 있지만. 독자들은 단백질과 그들에게 제공 로컬 장비로 실시되는 최종 실험에 의존 microsome 정화 절차로 자신의 수정 사항을 추가하실 수 있습니다. 효모-표현 CFTR 단백질이 부분적으로 내장 polyhistidine 정화 태그를 사용하여 금속 이온 친화도 크로마 토그래피를 사용하여 투석을 할 수 있습니다. 후속 크기 배제 크로마 토그래피는 SDS-PAGE와 젤의 Coomassie-염색법에 의해 판단,> 90% 순수한 것 같습니다 단백질을 듭니다.
Protocol
1. 미디어와 버퍼의 작성
- YNB : 일리터 들어, 1 난 물속에 uracil없이 아미노산과 0.77 g 완전한 보충 혼합없이 6.9 g 효모 질소 기지를 일시 중지합니다. 압력솥. 4 ° C.에 저장
- YNBA : 400 ML 들어, 아미노산없이 2.76 g 효모 질소 기지를 일시 중지, 350 ML 물에서 uracil과 8g 세균 한천없이 0.38 g 완벽한 보완 혼합물. 압력솥. 녹아 때까지 부드럽게 50 ML 물 및 열로 8g 포도당을 섞는다. 0.2 μm의 필터를 통해 Sterilise과 한천은 용융입니다면서 YNBA에 추가합니다. 상온에서 보관하십시오.
- 20 % 포도당 매체 : 해산까지 500 ML 들어, 부드럽게 500 ML YNB와 더위와 100g의 포도당을 섞는다. 멸균 듀란 병에 0.2 μm의 필터를 통해 전달합니다. 상온에서 보관하십시오.
- 20 %의 갈락토 오스 매체 : 해산 때까지 2리터의 경우는 부드럽게 2리터 YNB와 더위와 400g의 갈락토 오스를 섞는다. 멸균 듀란 병에 0.2 μm의 필터를 통해 전달합니다. 객실 템퍼에서 스토어ature.
- 테아제 억제제 주식 : CFTR은 proteolysis 4 ~ 매우 쉽습니다. 저자는 독자들이 자신의 요구 사항을 충족 맞게이 목록에하실 수 있지만 다음 억제제가 proteolysis를 제한에 효과 발견. 동결 - 해동 문제를 줄이기 위해 -20 ° C ~ 100 μl aliquots의 상점. 모든 저해제들은 주식 솔루션에서 아래와 같은 작업 농도로 희석되어야합니다
| 억제제 | 주식 농도 | 주식 준비 | 근무 농도 |
| AEBSF | 200 MM | 1ml 증류수에 48mg를 해산 | 0.2 MM |
| Benzamidine | 300 MM | 1ml 증류수에 36mg를 해산 | 0.3 MM |
| Chymostatin | 4 MM | 1ml 건조한 DM에 2.5mg를 해산SO | 4 μm의 |
| E-64 | 7 MM | 1ml 증류수에 2.5mg를 해산 | 7 μm의 |
| 류펩틴 | 20 MM | 1ml 증류수에 10mg를 해산 | 20 μm의 |
| Pepstatin | 15 MM | 1ml 건조 DMSO에 10mg를 해산 | 15 μm의 |
| PMSF | 1 M | 1ml 건조 DMSO에 174mg를 해산 | 1 ㎜ |
- DTT (1 M) : 1ml 증류수 154 MG dithiothreitol을 디졸브. -20 ° C.에 저장 버퍼의 1:1000 희석에 사용 지적했다.
- EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (0.5 M) : 100 ML 워터와 믹스 29.22 g ethylenediaminetetraacetic 산. EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 모두 해산했으며 산도 8에 도달할 때까지 10 N NaOH dropwise를 추가합니다. 물 200 ML까지 만들어 멸균 듀란 병에 필터 0.2 μm의 통과. 상온에서 보관하십시오.
- CRB (300 MM 트리스-HCL,산도 7.4, sorbitol 0.56 M, 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))는 : 350 ML의 물에 18.17 g 트리스베이스를 해산하고 HCL의 추가에 의해 7.4로 산도를 조정합니다. sorbitol 51.35 g을 넣고 물 500 ML에 볼륨을 구성합니다. 압력솥. 4에 1 ML EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 주식 솔루션 및 매장 ° C를 추가
- CFTR 버퍼 (50 MM 트리스, 산도 8.0 10 % V / V 글리세롤) : 500 ML의 물에 6.06 g 트리스베이스를 해산. HCL과 8 산도를 조절, 100 ML의 글리세롤을 추가하고 물 1 개 패까지합니다. 4 ° C.에서 압력솥 및 매장
- 50 MM 트리스-HCL (산도 7.6), 5 % 글리세롤, 5 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (산도 8.0), 0.02 % bromophenol 블루 4 % SDS, 0.05 M DTT :로드 염료를 2X. -20 ° C. 10 ML, 나누어지는 및 매장 만들기
2. 상영 Transformants
이 프로토콜은 CFTR-GFP-8His 융합 유전자가 GAL1 갈락토 오스 프로 모터 (Fig.1)에 효모 플라스미드 스트림에 그 삽입되었음을 가정 플라스미드는 FGY217 세포, S.cerevisiae 10 돌연변이 Pep4 삭제로 변환되었습니다 외. (2008) 10에 의해 상세하게 설명되어 있습니다.
- 변환 접시에서 5-10 잘 구분하여 식민지를 선택하십시오. 20 % 포도당 매체의 9 ML YNB과 1ml를 포함하는 별도의 멸균 50 ML 팔콘 튜브에 각 식민지를 전송합니다. 이 단계의 경우는 세포 성장을 유지하기 위해 문화의 2 % 포도당 (W / V)의 최종 농도가하는 것이 중요합니다. 궤도 떨고 배양기에서 30 ° C, 250 rpm을 16 시간 동안 밤새 성장.
- 스크린 식민지 각각 글리세롤 주식을 만듭니다. 무균 표시된 나사 탑 튜브의 0.2 ML 멸균 글리세롤, -80에서 와동 간략 및 매장 ° C.에 하룻밤 문화의 0.8 ML 추가
- 20 % 포도당 배지 250 μl를 포함한 YNB 50 ML의 최종 볼륨에 남아있는 야간 문화를 희석.높은 포도당이 GAL1 발기인 10을 주체할 수 있기 때문에이 단계를 위해, 그것은 문화의 약 0.1 % (W / W)에 포도당 농도를 희석하는 것이 중요합니다. 분류 250 ML Erlenmeyer의 문화를 성장 250 RPM, 궤도 떨고 인큐베이터에서 30 ° C에서 0.7-0.8의 OD 600 flasks을 당황하고.
- 각 플라스크 5 ML 20 %의 갈락토 오스 매체뿐만하여 문화를 유도 및 16 시간 동안의 성장.
- 형광 현미경을 사용하여 CFTR의 표현을 확인합니다. 문화 100 μl를 타고 용액에 세포 이동성을 제한하여 100 μl 글리세롤을 추가합니다. FITC 필터 (490 nm의 및 528-538 nm의의 방출 파장의 여기 파장)에서 청색 레이저를 사용하여 델타 비전 RT 복원 현미경 (또는 이와 유사한 것)에 세포를, Analyse. CFTR-GFP 융합 단백질의 긍정적인 표현은 효모 세포의 플라즈마 막에서 형광 고리로서 표시한다. Untransformed 효모 세포는 컨트롤로 사용할 수 있습니다.
- 전송50ml 팔콘 튜브에 문화. 벤치 톱 원심 분리기에서 10 분 동안 3,500 XG, 4 ° C에서 원심 분리하여 세포를 수확. 원심 분리기가 실행되고 수시로 찾아내는 '얼음 약 500 μl 산성 입힌 유리 구슬과 장소를 포함하는 나사 상판 2 개 ML의 microfuge 튜브를 준비합니다. supernatants을 취소하고 500-800 μl 심심풀이 CRB 각 펠릿을 resuspend 과 단백 분해 효소 억제제. 구슬을 포함 microfuge 튜브로 현탁액을 전송 얼음 계속.
- 노골적인 협상 기간 사이에 얼음 쉬고 30 초 10 시간 동안 흔들어 / 각 microfuge 튜브를 vortexing하여 세포를 Lyse. beadbeater가 대안으로 고용 수 있고, 3 분 동안 운항 BioSpec 미니 beadbeater을 예.
- 5 분 3,500 XG, 4 ° C에서 benchtop microfuge 및 원심 분리기로 튜브를 놓습니다. 얼음 microfuge 튜브와 장소를 청소하기 위해 원유 멤브레인 인구를 포함 supernatants을 전송합니다. 500 μl 신선한 아이스 공동 추가신분증 CRB 각 튜브에 테아제 저해제와의 세포막을 축적하는 과정을 반복합니다.
- 2 시간 benchtop microfuge에서 최대 속도, 4 ° C에서 회전하여 원유 세포막을 수집합니다. 뜨는을 취소하고 50 μl 얼음 추위 CFTR 버퍼에있는 각 펠렛을 resuspend.
- 깨끗한 microfuge 튜브에서 아래로 pipetting과이 15 μl 2X로드 염료 각 정지 15 μl를 섞는다. 10 분 동안 상온에서 품어. 이것은 SDS-불용성 집계를 형성하고 또한 GFP 태그를 변성하는 CFTR 및 기타 멤브레인 단백질의 원인이되므로, 샘플을 끓여야하지 마십시오.
- 4-20% 트리스 / 글리신 구배 겔 (NuSep)쪽으로 PageRuler 플러스 prestained 단백질 기준 (Fermentas)와 함께 샘플을 로드할 40 분 150 V 혹은 때까지 염료 전면 겔의 하단에 있습니다 실행합니다.
- 인 겔 형광에 의해 가장 높은 표현하는 세포를 식별합니다. 이러한 태풍 스캐너와 같은 형광 이미징 시스템에 장소. 젤 u를 스캔488 NM의 여기 파장의 청색 레이저와 526 nm의의 방출 파장을 노래. CFTR-GFP 융합은 약 220 kDa에서 볼 수 있어야합니다. 또한, 아마 본질적인 효모 유행 함유 멤브레인 단백질 11,12 (예 : 호박산 탈수소 효소의 subunit 등)은 약 70 kDa에서 보이는 약한 형광 밴드가 될 것입니다.
- 편리한 이미지보기 소프트웨어 패키지를 사용하여 형광 검사에 대한 비교를위한 젤 destain 및 스캔, Coomassie로 젤 청바지. Coomassie 묻은 겔은 겔의 각 트랙에 싣게되는 총 단백질의 양에 대한 정상화 후 다른 clonal 라인에서 CFTR-GFP 표현 수준의 상대적인 평가를하실 수 있습니다.
- 신선한 YNBA 진입은 글리세롤 주식 (2.2)에서 가장 높은 표현 세포주 밖으로 행진 2-3 일동안은 30 ° C에서 플레이트와 부화. 이 플레이트는 다음 4 ° C.에서 2 주간에 저장될 수 있습니다
3. 대형 발효기 컬트우레
- 발효기에 대한 사전 문화를 준비합니다. YNBA에서 세포 1cm 두 영역을 다쳤어요 플레이트 (2.13)은 살균 루프를 사용하고, 45 ML YNB 5 ML 20 % 포도당 매체로 OD 600 약 0.1이라는 등의 추가합니다. OD 600 1 도달할 때까지 궤도 떨고 배양기에서 250 rpm을, 30 ° C ~ 250 ML Erlenmeyer 당황하고 flasks 성장.
- 실패하는이 2리터 Erlenmeyer 사이의 문화를 분할은 각 포함 450 ML YNB 25 ML 20 % 포도당 매체를 flasks. 250 RPM, 궤도 떨고 배양기에서 30 ° C에서 OD 600 1.2에 도달할 때까지에서 이걸 성장.
- 이러한 사전 문화가 성장하고 수시로 찾아내는 '발효기를 설정합니다. 같은 1.1에서 설명한 YNB의 11.2l 만들기 있지만, 추가로 8.28 g YNB과 유도에서 글리세롤의 추가 보상하기위한 보충 밖으로 0.95 g 강하를 해산. 무균 멸균 20리터 발효기 용기에 11.2 리터 YNB 75 ML 20 % 포도당 매체를 추가하고 실행 온도를 조절30 ° C.
- 무균 발효기에 precultures를 추가하고 저어 속도를 설정 약 800 RPM으로 30에서 온도를 유지 ° C. 압축 공기는 약 15 DM 3 분 -1에서 흘러한다. 발효기 문화는 1.2 OD 600에 도달할 유발 무균 1.5 리터 YNB 20 %의 갈락토 오스 솔루션과 1.2 리터의 글리세롤을 추가하여. 25 ° C로 온도를 감소 및 16 시간 동안 문화를 성장.
- 연동 펌프를 사용하여 얼음에 냉장 1리터 원심의 냄비에 발효기 내용을 전송합니다. 대용량 로터 (예 : 6리터)에서 30 분간 3,500 XG, 4 ° C에서 원심 분리하여 세포를 수확. 테아제 억제제 150 ML 얼음 추위 CRB에서 셀을 Resuspend. 여기서부터 모든 작업은 4 ° C.에 실시하여야한다
- 각각의 경우에 얼음 lysate를 수집, 25, 30, 32 35 kPa 4 패스의 지속적인 시스템 셀 계 장애 통과하여 세포를 Lyse. 또는 구슬 비테를 사용하여산성 입힌 0.5 밀리미터 유리 구슬의 동일한 볼륨 R (Biospec)와 전체 전원 3 분 동안 선동. 3500 XG, benchtop의 원심 분리기에서 15 분 동안 4 ° C에서 원심 분리하여 50ml 팔콘 튜브 및 펠렛 세포 파편에 lysate를 전송합니다.
- 냉장 원심 분리기 튜브에 뜨는을 전송합니다. mitochondria 제거하는 원심 분리기에서 30 분 동안 14,000 XG, 4 ° C에서 원심 분리기.
- 냉장 ultracentrifuge 튜브에 뜨는 전송합니다. microsomes를 수집 ultracentrifuge 90 분 동안 200,000 XG, 4 ° C에서 원심 분리기.
- 조심스럽게 가만히 따르다와 뜨는을 버리고 각각의 튜브로 프로 테아제 억제제와 1mM DTT와 2ml 얼음 추위 CFTR 버퍼를 추가합니다. 부드럽게 와동 믹서를 사용하여 CFTR 버퍼와 혼합 사용하여 각 튜브를 지상에서 페인트 브러시를 사용하여 알약을 resuspend.
- ultracentrifuge 60 분 200,000 XG, 4 ° C에서 현탁액을 원심 분리기, 2 ML 얼음 추위 CFTR 버퍼 w에서 뜨는 및 resuspend 알약을 버리고ith 테아제 억제제 페인트 브러시를 사용하여 (아무 DTT).
- 풀 resuspended microsomes, CFTR 버퍼 함께 50 ML에 최종 볼륨을 조절하고 잘 섞는다. 예약과 같은 2.9에서 설명한 SDS-PAGE 젤 분석을위한 1 ML의 나누어지는 - 2.11. microsomes 이제 플래시는 액체 질소에 냉동 있어야하고 필요한 ° C까지 -80에 저장하실 수 있습니다.
- 리튬 perfluorooctonoate 산성 (LiPFO), tetradecanoly-리소 - phosphatidylglycerol (LPG14), N-dodecyl-β-D-maltoside (DDM) : CFTR은 다음 세제 중 하나를 사용 microsomes에서 추출 할 수 있습니다. CFTR 버퍼, 테아제 저해제와 5 %의 세제 (W / W)로 microsomes를 섞습니다. DDM을 사용하는 경우에도 버퍼에 NaCl 300 밀리미터를 추가합니다. 튜브 회전에서 15 분 동안 4 ° C에서 선동.
- ultracentrifuge 1 시간 동안 100,000 XG, 4 ° C에서 샘플을 원심 분리기. 뜨는을 유지하고 SDS-PAGE 젤 분석을위한 작은 나누어지는 가져가라. CFTR 이제 고정화 금속으로 solublised 자료에서 정화 수 있습니다친화성 크로마 토그래피는 크기 배제 크로마 토그래피에 의해 따라갔다.
4. 대표 결과
CFTR 함유 플라스미드와 효모의 변환은 100 % 효율적이지 않습니다. 변환 실험에서 선택된 식민지에서 CFTR의 표현의 대표적인 소규모 스크린 단백질을 표현 4 식민지에서 이런것에 대해서를 얻을 것입니다. 접시에서 고른 다섯 식민지의 화면에서 전형 결과는 그림의 패널에 표시됩니다. 3. 식민지 중 하나는 일반적으로 그림과 같이, 250 kDa 및 130 kDa 마커 사이에 실행 CFTR-GFP 융합 단백질의 표현의 강한 수준을 보여줍니다. CFTR-GFP 형광 수준은 그림의 식민지 4, 실험 사이에 상당히 다릅니다. 약 70kDa의 본질적인 형광 밴드보다 3 상영은 적어도 10 배 더 큰 형광. CFTR-GFP의 발현 수준은 70 kDa 밴드 미만 형광 줄 것으로 보인다면, 아마 다시 변화하고 식민지를 선택 가치CFTR-GFP의 표현의 높은 수준. 다른 이름으로 그림. 3A, 이건 CFTR-GFP 밴드는 Coomassie 염색법에 의한 세포 추출물에서 뚜렷한 것임에도 CFTR-GFP의 높은 발현 수준과 함께하지 않을 수 있습니다.
그림과 같이 일단 선택한 식민지, microsomes 이내 CFTR-GFP의 존재가 평가해야합니다, 고립 microsomes 큰 규모의 실험 재배하고있다. 3B. 본 실험의 결과는 microsomes가 신중하게 준비하고 있으며 그 proteolysis가 최소화되었는지 확인하는 것이 중요뿐만 아니라, 표현의 유도의 효율성을 평가하기 위해, 또한 있습니다. 결과는 그림. 3B는이 실험에서 CFTR-GFP 발현은 그러나 이번 인상이의 형광 검출기의 노출 과도에 의해 편향된되는 패널 A에서 표시된 소규모 실험에 비해 (같은 본질적인 70kDa 밴드에 대해 상대적 판단) 다소 낮은 것을 의미하지 측정. 실험자들이 checki 있었기 때문이였다CFTR이 구조의 proteolytic 조각의 존재에 대한 NG. 가 130 kDa과 100 kDa 마커 사이 형광 proteolytic 조각이 실험의 일부 증거이지만, 이들은 전체 길이 CFTR-GFP 대역에 비해 매우 약하다. 단백 분해 효소 억제제는 여기에 언급된, 우리는 세포 파손 후 CFTR의 proteolytic 저하에 대한 약간의 증거를 찾으십시오. 상당한 proteolysis가 관찰되는 경우, 우리는 신선한 테아제 억제제 주식 솔루션을 만드는 것이 좋습니다. 우리는 또한 상업 테아제 억제제 칵테일 알약이 체제에 효과적이지 않을 것으로 나타났습니다. 그림 4와 같이 16 넘어서 세포의 성장은 시간 (사후 유도)은 감소 CFTR 표현을 야기할 것입니다. 이것은 아마도 아마도 단백질의 매출, 효모 단백질 품질 관리 기계 6-9,13의 upregulation에 의한 때문입니다. 가능하면 최적의 시간이 세포에게 교장 기증이되어서, 갈락토 오스와 유도 후 CFTR 표현 수준을 모니터링하는 것이 바람직하다y를 한 연구실에서 다른 다릅니다.
1 그림. 플라스미드 CFTR 구조 함유 효모. CFTR-GFP-8His 융합은 갈락토 오스 (GAL1) 발기인의 통제하에, 2μ p424GAL1 발현 벡터에 삽입됩니다. 벡터는 또한 uracil 선택 마커 (우라)와 암피실린 저항 유전자 (앰프)가 포함되어 있습니다.
그림 2. 시각화된 프로토콜을 요약 흐름도.
그림 3. CFTR 표현과 정화의 대표 SDS-PAGE의 젤. 패널은 다섯 무작위 CFTR 표현을 위해 상영되었다 transformant의 식민지를 (차선 1-5) 포착 보여줍니다. 패널 B는 15리터 잠겼어으로부터 격리되었다 microsomes을 보여줍니다문화를 입력하십시오. 패널 C는 크기 배제 크로마 토그래피 다음 친화성 크로마 토그래피를 사용하여 2 단계 정화 후 얻은 murine CFTR 투석을 보여줍니다. 모든 젤류는 GFP 도메인 (왼쪽)에서와 Coomassie 후 흥미로운 형광이 (오른쪽) 얼룩 조명 조건에서 표시됩니다. 분자량 표준의 상대적인 위치는 왼쪽 (kDa)에 나열됩니다.
4 그림. 효모에서 CFTR의 표현을위한 대표적인 데이터입니다. 패널은 갈락토 오스와 유도 후 CFTR의 표현의 시간 과정을 보여줍니다. 세포 추출물을 SDS-PAGE로 분석되었으며, CFTR-GFP 단백질 밴드 GFP의 형광이 통합되었습니다. 패널 B는 세포를 16 시간 게시물 유도를 GFP-표현의 형광 현미경을위한 전형 결과를 보여줍니다. 일반적으로 세포의 일부만 높은 수준에서 CFTR을 표현.
Discussion
본 논문은 낭성 섬유증에 대한 연구를 촉진해야 효모 세포의 murine CFTR 단백질의 표현 방법을 제공합니다. 목적은 낭성 섬유증 재단 (을 통해 사용할 수 murine CFTR 유전자 구조의 릴리스로이 논문을 연결하는 것입니다 http://www.cff.org/research/CFFT/ ). 기타 orthologs 나중에 사용할 수있게됩니다. CFTR 함유 벡터와 효모 세포의 변환은 간단하지만, CFTR 높은 수준을 표현 식민지를위한 화면으로 중요합니다. 가변 표현 수준은 여러 가지 요인에서 발생할 수 있지만, 플라스미드 당 세포의 매수는 아마도 변화의 상당 정도를 차지하고 있습니다. 여기에 설명된 중요한 단계는 CFTR-표현 효모 세포와 microsomal 세포막을 CFTR 함유의 생산을 허용해야합니다. 일단 변형, 성장, 수확 및 효모 세포의 용해는 purif는 마스터했습니다단백질의 ication이 가능해야하고, 그림 3에서 우리는 유용한 벤치 마크로서이 경우에 달성해야 순수의 예제를 받고 있습니다. 그것은 단백질의 정제에 대한 자세한 방법론을 제공하기 위해 본 논문에서 우리 의도는 아닙니다. 그러나, 거기에 이러한 세포 용해 및 microsome 정화 등 S.cerevisae 표현 시스템에만 해당하는 몇 가지 중요한 다운 스트림 정화 단계이며, 이들은이 논문에서 자세히 포함되었습니다. 그것은 언급해야하지만, 따로 우리가 사용한 두 가지 방법에서 대체 효모 세포 파괴 방법은 같은 프랑스 압력 세포의 사용으로, 고용 수있다. 재조합 단백질은 단백질 (그림 4) 유도 후 추적할 수 있도록 TEV-cleavable의 C-말단 GFP 도메인을 가지고 있습니다. 효모 같은 조건 11이 이하 fluoresces는 유용한 상호를 제공할 수있는 고유 70kDa 단백질 (아마도 탈수소 12 호박산)가전체 세포 추출물이나 microsomes에서 CFTR의 상대 발현 레벨 nal 교정 표준 (그림 3). 그것은 갈락토 오스와 유도 후 세포 수확의시기가 중요한 것이 그림 4에 표시된 데이터에서 분명하다. CFTR 드롭의 수확량이 급격히 유도의 16에 대한 시간 후, 효모 세포에 감지 CFTR는 유도 24 시간 후에 거의가되도록.
단백질 정제의 수율은 15리터 발효기 배양 당 1-2mg CFTR 단백질에 관한 것입니다. 복구는 microsome 무대로 총 CFTR-GFP 단백질 최대의 70 % 정도로 추산하고, 단백질을 정제의 약 25 %의 복구를 할 수 있습니다. S.의 Characterisation cerevisiae - 표현 CFTR가 아직 진행 중입니다. 다른 이름으로 그림에서 본. 4 세포에서 단백질의 위치는 형광 현미경으로 모니터링할 수 있습니다. 형광의 정도가 예상되는 10 셀 주변으로 발견되지만 단백질 중 일부는 작은 반점이있는 로컬 라이제이션을 표시에서하거나, 또는단지 늦게 잠돌군 Zz / endosomal 통로 14 아마 응급실 4 교통 vesicles의 신진의 구획 스트림을 통해 재활용 CFTR 때문에 될 수 플라즈마 막 내부. PNGaseF, 단백질 deglycosylates 효소와 치료가 unglycosylated되는 뜻인, SDS-PAGE에서 CFTR 단백질 밴드의 마이 그 레이션에 최소한의 변화를 보여주거나 최소한의 글리코 실화 15있다. 단백질의 인산화 상태에 대한 실험이 진행되고 있습니다. 지금까지 테스트한 세제의 일부에 정화 단백질은 이전에 2,15을 발표 이들과 유사한 속도로 (그것은 CFTR 특정 억제제를 16에 의해 저해되는) ATPase의 활동을 표시합니다. CFTR 채널 활동의 측정은 비교적 높은 임계 마이셀 농도 (CMC) 17이 세제의 마지막 정화 단계를 의미하는 것이 정화 단백질의 reconstitution 필요합니다. 효모는 containin을 microsomesg CFTR 같은 일반적으로 '약한'것으로 간주되어 dodecyl maltoside 2 등 세제를 포함한 여러 일반적으로 고용 세제 18로 solublised 수 있습니다. 그러나 가장 높은 CMC 세제는 이러한 세제로 그 교류는 어떠한 정화 체계의 늦은 단계에서 고려되어야 제안, 지금까지 solubilsation 대한 비효율적일 수있다.
Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
우리는 CFTR 3D 구조 컨소시엄 (보조금 번호 FORD08XX0)를 통해이 작품을 자금에 대한 낭성 섬유증 재단 (CFF)을 감사드립니다. 우리는 CFTR 유전자의 디자인 특히,이 작품에 대한 컨소시엄 내의 모든 동료들의 거대한 공헌을 인정합니다. 우리는 또한 Drs의 소중한 기여를 인정합니다. 제임스 Birtley (NCSR Demokritos, 그리스), 마크 영 (카디프 대학교, 영국)과 데이비드 드류 (임페리얼 칼리지, 런던, 영국) 작업의 초기 단계 인치 우리는 특히 원고의 비판적 읽기를 위해 박사 인애 Urbatsch (텍사스 테크. 대학, Lubbock)에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FGY217 S.cerevisiae strain, with pep4 deletion 10 | |||
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0410 | |
| Complete supplement mixture without uracil | Formedium | DCS0169 | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306 | |
| D-galactose | Fisher | BP656-500 | |
| D-glucose | Fisher | D16-500 | |
| Pepstatin A | Sigma-Aldrich | P4265 | |
| Leupeptin | Merck | 108975 | |
| Chymostatin | Sigma-Aldrich | C7268 | |
| Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64) | Sigma-Aldrich | E3132 | |
| Amin–thylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF) | Sigma-Aldrich | A8456 | |
| Benzamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 434760 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher | BP120500 | |
| Tris-base | Formedium | TRIS01 | |
| Tris-HCl | Fisher | P631 | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| Glycerol | Fisher | 065017 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| n-dodecyl-β-D-maltopyranoside | Affymetrix | D310S | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| PageRuler Plus prestained protein standards | Fermentas | SM1811 | |
| NuSep tris-gly 4-20% gradient gels | NuSep | NB10-420 | |
| Instant Blue Coomassie Stain | Novexin | ISB1L | |
| Glass beads, acid washed | Sigma | G8772 | |
| 50ml Sterile Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.254 | |
| 2ml Sterile screw-top vials | Sarstedt | 72.694.005 | |
| 250ml Sterile Erlenmeyer baffled flasks | BD Biosciences | 355119 | |
| 2l Sterile Erlenmeyer baffled flasks | BD Biosciences | 355131 | |
| 2ml microfuge tubes | Sarstedt | 72.695 | |
| 0.2μM syringe filter | Sartorius | FC121 | |
| ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355618 | |
| centrifuge tubes | Beckman Coulter | 357000 | |
| 1l centrifuge pots | Beckman Coulter | 969329 | |
| Orbital shaking incubator with temperature control | New Brunswick Scientific | ||
| Deltavision RT restoration microscope | Applied Vision | ||
| Benchtop centrifuge | HERMLE | Z300 | |
| Benchtop microfuge | Fisher | 13-100-511 | |
| Vortex mixer | Star Labs | ||
| Typhoon Trio Scanner | GE Healthcare | 63-0055-87 | |
| LAS3000 imaging system | Fuji | ||
| 20l fermenter vessel and control unit | Applikon | ||
| Constant systems cell disrupter | Constant systems | ||
| Beadbeater cell disrupter | BioSpec | 1107900 | |
| Mini-beadbeater-16 | BioSpec | 607 | |
| JA-17 rotor | Beckman Coulter | 369691 | |
| Optima L-100 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392050 | |
| 50.2Ti rotor | Beckman Coulter | 337901 |
References
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