Попытки выразить муковисцидоз трансмембранного регулятора проводимости (CFTR) в<em> Saccharomyces CEREVISIAE</em> Было, до сих пор, дали сравнительно небольшое количество белка. Этот протокол и связанные с реагентами распространяемых через кистозный фиброз Фонд должен позволить подготовки миллиграмм количество этого «трудных» мембранным белком эукариот.
Муковисцидоз трансмембранного регулятора проводимости (CFTR) является хлорид канала, что, когда мутировал, может привести к муковисцидозом в humans.There Поэтому значительный интерес в этом белке, но усилия, чтобы изучить его структуру и деятельность были затруднены трудности выражения и очистка достаточного количества белка 1-3. Как и во многих «трудных» эукариотических мембранных белков, экспрессия в быстрорастущий организм является желательным, но сложно, и в дрожжей S. CEREVISIAE, до сих пор низкие суммы были получены и быстрой деградации рекомбинантного белка наблюдается 4-9. Белки участвуют в обработке рекомбинантный CFTR у дрожжей были описаны 6-9. В этом докладе мы описываем методологию для выражения CFTR в дрожжах и очистки в значительных количествах. В протоколе описывается, как ранее проблемы протеолиза могут быть преодолены, и как выражение уровняCFTR может быть значительно улучшена путем изменения условий роста клеток и контроля индукции условий, в частности срок до клетки урожая. Reagants, связанных с этим протоколом (мышиные CFTR-экспрессирующих клеток дрожжей или дрожжевого плазмид) будет распространяться через американского Муковисцидоз Фонда, который является спонсором исследований. Статьи о дизайне и синтез CFTR конструкцию, занятых в этом отчет будет опубликован отдельно (Urbatsch И.,. Тибодо, П. и др., не опубликовано). В этой статье мы расскажем нашим методом, начиная с преобразованием дрожжевых клеток с CFTR построить – содержащие дрожжи плазмиды (рис. 1). Конструкция имеет зеленый флуоресцентный белок (GFP), слитый с последовательностью гена CFTR на С-конце и следует система, разработанная Дрю и соавт. (2008) 10. GFP позволяет выражения и очистки CFTR, которым необходимо следовать относительно легко. Юпитер визуализировать protocол заканчивается после подготовки микросом из дрожжевых клеток, хотя мы и включают несколько предложений для очистки белка из микросом. Читатели, возможно, хотели бы добавить свои изменения в микросом процедуры очистки, в зависимости от окончательного эксперимента будет осуществляться с белком и местным оборудованием к ним. Дрожжей выразил CFTR белка может быть частично очищают с использованием ионов металлов аффинной хроматографии, используя внутренние теги очистки polyhistidine. После гель-хроматографии дает белок, который оказывается> 90% чистоты, если судить по SDS-PAGE и Кумасси окрашивания геля.
Эта статья относится к способу выражения мышиный белок CFTR в клетках дрожжей, которые должны содействовать проведению исследований на муковисцидоз. Цель состоит в том, чтобы связать эту бумагу с выходом мышиной ДНК CFTR конструкцию, которая будет доступна через кистозный фиброз Foundation ( http://www.cff.org/research/CFFT/ ). Другие ортологи будут доступны позже. Трансформация клеток дрожжей с CFTR содержащие вектор прост, но очень важно для выявления колоний выражения высокого уровня CFTR. Переменный уровень экспрессии могут возникнуть в результате нескольких факторов, но число копий плазмиды в клетки, вероятно, объясняет в значительной степени вариации. Критические шаги, описанные здесь, должны позволять производство CFTR-экспрессирующих клеток дрожжей и CFTR содержащих микросомальных мембран. После преобразований, роста заготовки и лизис дрожжевых клеток были освоены, purification белка должно быть возможно, и на рисунке 3 мы дали пример чистоты, которые должны быть достигнуты в этом случае в качестве полезного ориентира. Это не наше намерение в этой рукописи предоставить подробную методику для очистки белков. Однако, есть некоторые критические вниз стадий очистки, которые являются специфическими для S.cerevisae система выражения, такие как лизис клеток и микросом очистки, и они были включены в подробности в этой рукописи. Следует отметить, однако, что кроме этих двух методов мы использовали альтернативные методы клетки дрожжей нарушения могут быть использованы, например, использование французской ячейки давления. Рекомбинантного белка имеет TEV-расщепляемого С-концевой домен, GFP позволяет белку отслеживаться после индукции (рис. 4). Дрожжи обладают собственным 70kDa белка (вероятно, сукцинатдегидрогеназы 12), флуоресцирует при тех же условиях 11, и это может стать полезной в томNAL стандартные калибровки для относительного уровня экспрессии гена CFTR в целом клеточных экстрактов или микросомах (рис. 3). Как видно из данных, приведенных на рисунке 4, что сроки уборки клетки после индукции галактозой имеет решающее значение. Урожайность падение CFTR стремительно после того, как около 16 часов индукции, так что едва заметного CFTR в клетках дрожжей после 24 часов индукции.
Выход очищенного белка составляет около 1-2 мг CFTR белка на каждые 15 литров культуры ферментер. Восстановление может быть оценена как около 70% от общего CFTR-GFP белка до микросом этапе, и около 25% на восстановление очищенного белка. Характеристика С. CEREVISIAE выраженным CFTR продолжается. Как видно на рис. 4 место белка в клетке можно контролировать с помощью флуоресцентной микроскопии. Хотя большая часть флуоресценции находится на периферии клетки, как ожидалось 10, некоторые из белков показывает точечной локализации, либо, илитолько внутри плазмы мембраны, которая может быть связано с CFTR переработки через поздно Гольджи / эндосом путь 14 или, возможно, отсек вниз по течению от начинающего транспортных везикул с ER 4. Лечение PNGaseF, фермент, который deglycosylates белков, показали минимальные изменения в миграционной группы белка CFTR на SDS-PAGE, подразумевая, что она негликозилированной, или имеет минимальный гликозилирования 15. Эксперименты по фосфорилирования белка продолжаются. В некоторых моющих средств испытания до сих пор, очищенного белка отображает АТФазы (то есть подавляется CFTR-специфического ингибитора 16) по ставкам, которые аналогичны тем, которые ранее опубликованные 2,15. Измерение активности канала CFTR потребует восстановления очищенного белка, который будет означать окончательный этап очистки в моющих средств, который имеет относительно высокую критическую концентрацию мицеллообразования (ККМ) 17. Дрожжи микросомы containinг CFTR могут быть solublised с несколькими обычно используются моющие средства 18, в том числе моющие средства, такие как додецилсульфата maltoside 2, который, как правило, считается "мягкой". Однако наиболее высокие CMC моющих средств оказались неэффективными для solubilsation, до сих пор, предполагая, что обмен в этих моющих средств должен быть рассмотрен на более позднем этапе в какой-либо очистки схеме.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Фонд муковисцидоза (ФФС) для финансирования этой работы через CFTR 3D структура консорциума (грант № FORD08XX0). Мы признаем огромный вклад всех наших коллег в рамках консорциума в этой работе, в частности, в разработке CFTR генов. Мы также признаем, бесценный вклад д-ра. Джеймс Birtley (НЦНИ Демокрита, Греция), Марк Янг (Университет Кардиффа, Великобритания) и Дэвид Дрю (Imperial College, Лондон, Великобритания) на ранних стадиях работы. Мы особенно благодарны д-р Инна Urbatsch (Texas Tech. Университет, Лаббок) за критическое чтение рукописи.
Name of reagent/equipment | Company | Catalogue No |
FGY217 S.cerevisiae strain, with pep4 deletion 10 | ||
Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0410 |
Complete supplement mixture without uracil | Formedium | DCS0169 |
Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306 |
D-galactose | Fisher | BP656-500 |
D-glucose | Fisher | D16-500 |
Pepstatin A | Sigma-Aldrich | P4265 |
Leupeptin | Merck | 108975 |
Chymostatin | Sigma-Aldrich | C7268 |
Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 |
Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64) | Sigma-Aldrich | E3132 |
Aminoethylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF) | Sigma-Aldrich | A8456 |
Benzamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 434760 |
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 |
dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 |
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher | BP120500 |
Tris-base | Formedium | TRIS01 |
Tris-HCl | Fisher | P631 |
D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 |
Glycerol | Fisher | 065017 |
NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 |
n-dodecyl-β-D-maltopyranoside | Affymetrix | D310S |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 |
PageRuler Plus prestained protein standards | Fermentas | SM1811 |
NuSep tris-gly 4-20% gradient gels | NuSep | NB10-420 |
Instant Blue Coomassie Stain | Novexin | ISB1L |
Glass beads, acid washed | Sigma | G8772 |
50ml Sterile Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.254 |
2ml Sterile screw-top vials | Sarstedt | 72.694.005 |
250ml Sterile Erlenmeyer baffled flasks | BD Biosciences | 355119 |
2l Sterile Erlenmeyer baffled flasks | BD Biosciences | 355131 |
2ml microfuge tubes | Sarstedt | 72.695 |
0.2μM syringe filter | Sartorius | FC121 |
ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355618 |
centrifuge tubes | Beckman Coulter | 357000 |
1l centrifuge pots | Beckman Coulter | 969329 |
Orbital shaking incubator with temperature control | New Brunswick Scientific | |
Deltavision RT restoration microscope | Applied Vision | |
Benchtop centrifuge | HERMLE | Z300 |
Benchtop microfuge | Fisher | 13-100-511 |
Vortex mixer | Star Labs | |
Typhoon Trio Scanner | GE Healthcare | 63-0055-87 |
LAS3000 imaging system | Fuji | |
20l fermenter vessel and control unit | Applikon | |
Constant systems cell disrupter | Constant systems | |
Beadbeater cell disrupter | BioSpec | 1107900 |
Mini-beadbeater-16 | BioSpec | 607 |
JA-17 rotor | Beckman Coulter | 369691 |
Optima L-100 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392050 |
50.2Ti rotor | Beckman Coulter | 337901 |