Kistik fibrozis transmembran iletkenlik regülatör (CFTR) ifade etmek için girişimleri<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Şimdiye kadar protein nispeten düşük miktarda vermiştir. Kistik Fibrozis Vakfı aracılığıyla dağıtılan Bu protokol ve ilgili reaktifler bu 'zor' ökaryotik membran proteini miligram miktarlarda hazırlanması izin vermelidir.
Kistik fibrozis transmembran iletkenlik regülatör (CFTR) mutasyon olduğunda, bu nedenle bu proteinin çok büyük bir ilgi olduğunu humans.There kistik fibrozis ortaya çıkmasına neden olabilir bir klor kanalı, ama yapısı ve faaliyet çalışma çabaları zorluk nedeniyle engellense 1-3 protein yeterli miktarda ifade ve arındırma. Birçok 'zor' ökaryotik membran proteinleri gibi, hızlı büyüyen bir organizmanın ifade arzu, ama zorlu ve maya S. cerevisiae, şimdiye kadar düşük miktarda elde edildi ve rekombinant protein hızlı bir degradasyon 4-9 gözlenmiştir. Maya rekombinant CFTR işleme ile ilgili Proteinler 6-9 tarif edilmiştir. Bu raporda, önemli miktarda maya ve arıtma CFTR ifade etmek için bir metodoloji tanıtılmıştır. Protokolü önceki proteoliz sorunların üstesinden nasıl açıklanır ve nasıl ifade seviyelerininCFTR büyük ölçüde hücre hasat öncesinde belirli süre içinde, hücre büyümesi koşulları değiştirerek ve indüksiyon koşulları kontrol ederek geliştirilebilir. Bu protokol (mürin CFTR eksprese maya hücreleri veya maya plazmid) araştırma sponsor oldu ABD Kistik Fibrozis Vakfı aracılığıyla dağıtılacaktır ile ilişkili reagants. CFTR tasarımı ve sentezi bu raporda istihdam oluşum, anlatan bir makale (.; Thibodeau, P. ve arkadaşları, yayınlanmamış Urbatsch, I.) ayrı olarak yayınlanacaktır. Plazmid içeren maya (Şekil 1) – Bu yazıda, CFTR yapı ile maya hücrelerinin dönüşümü ile bizim yöntem başında açıklayacağız. Yapı 10, C-terminalindeki CFTR için kaynaşmış bir yeşil floresan protein (GFP) dizilimi vardır ve Drew ve arkadaşları tarafından geliştirilen sistem kullanılır. (2008). GFP CFTR ifadesi ve saflaştırılması nispeten kolay takip edilmesini sağlar. Vallahi görüntülendi protocmaya hücrelerinden mikrozomal hazırlandıktan sonra ol tamamlandığında, biz mikrozomları gelen protein saflaştırılması için bazı öneriler içermesine rağmen. Okuyucular protein ve kendilerine sunulan yerel ekipman ile yapılacak son deneyler bağımlı mikrozom saflaştırma işlemi, kendi değişiklikler eklemek isteyebilirsiniz. Maya-ifade CFTR proteini kısmen bir içsel polyhistidine saflaştırma etiketi kullanılarak, metal iyonunun afinite kromatografisi kullanılarak saflaştırılabilir. Daha sonraki boyut dışlama kromatografisi olarak SDS-PAGE ve jel Coomassie-boyama tarafından değerlendirilecek,>% 90 saf gibi görünen bir protein üretir.
Bu makale, kistik fibroz araştırma kolaylaştırmalıdır maya hücreleri murin CFTR proteini ifade etmek için bir yöntem sağlar. Amaç Kistik Fibrozis Vakfı (aracılığıyla sunulacaktır murin CFTR DNA yapı, serbest bırakılması ile bu kağıt bağlamak için http://www.cff.org/research/CFFT/ ). Diğer orthologs sonra kullanılabilir hale gelmelidir. CFTR içeren vektör ile maya hücrelerinin dönüşümü basit, ancak CFTR yüksek seviyelerde ifade koloniler için ekranda için önemlidir. Değişken ifade seviyeleri çeşitli faktörler ortaya çıkabilir, ancak plazmid başına hücre kopya sayısını muhtemelen varyasyonun önemli bir derecesine oluşturuyor. Burada anlatılan Kritik adımları CFTR eksprese maya hücreleri ve mikrozomal membran CFTR içeren üretim izin vermelidir. Bir kez değişim, büyüme, hasat ve maya hücrelerinin parçalanması purif, hakim olmuşturProteinin ication mümkün olmalıdır, ve Şekil 3'te çok faydalı bir referans olarak, bu durumda olmak üzere açıkça saflıkta bir örnek verdi. Bu proteinin saflaştırılması için detaylı metodoloji sağlamak için bu yazının bizim niyeti yoktur. Ancak, bu tür hücre parçalama ve mikrozom arınma gibi S.cerevisae ifade sistemine özgü bazı kritik aşağı arıtma adımlar vardır ve bunlar bu yazının ayrıntılı olarak dahil edilmiştir. Bu, belirtilmelidir ki, bu dışında kullanılacak olan iki yöntem ile, alternatif bir mantar hücre parçalama yöntemler böyle bir Fransız basınç hücrenin kullanımını olarak, kullanılan edilebilir. Rekombinant proteinin proteine (Şekil 4) indüksiyonundan sonra izlenebilir olanak sağlayan bir TEV-yarılabilir C-terminal GFP alanı vardır. Maya aynı koşullar 11, ve bu altında fluoresces yararlı bir arası sağlayabilir bir içsel 70kDa proteini (muhtemelen dehidrogenaz 12 süksinat) sahiptam hücre ekstreleri ya mikrozomlan CFTR bağıl ifade seviyelerinin için nal kalibrasyon standart (Şekil 3). Bu, galaktoz ile indüksiyonundan sonra hücre hasat zamanlama önemli olduğunu Şekil 4'te gösterilen veriler açıkça bellidir. CFTR damla verim precipitously indüksiyon yaklaşık 16 saat sonra, maya hücrelerinin herhangi bir tespit edilebilir CFTR indüksiyon 24 saat sonra çok az olacak şekilde.
Saflaştırılmış proteini verim 15 litre başına 1 fermentör kültürü-2 mg CFTR proteini ile ilgilidir. Kurtarma mikrozom aşamasına toplam CFTR-GFP protein kadar yaklaşık% 70 olarak tahmin edilmekte ve saflaştırılmış protein yaklaşık% 25 oranında iyileşme olabilir. S. Karakterizasyonu cerevisiae-ifade CFTR devam etmektedir. Şekil görülmektedir. 4, hücre proteinin yerini floresan mikroskobu ile izlenebilir. Floresans çok beklenen 10 gibi hücre çevresi etrafına bulunmasına rağmen, protein bazı, bir noktalı Lokalizasyon görüntüler, ya, ya daSadece geç bir Golgi / endosome yolu 14 veya belki de ER 4 ulaşım vezikül tomurcuklanan bir bölmesi aşağı aracılığıyla geri dönüşüm CFTR bağlı olabilir plazma zarı içinde. PNGaseF, proteinler deglycosylates bir enzim tedavisi bu unglycosylated olduğunu ima, SDS-PAGE üzerindeki CFTR proteini grubun göç minimal değişiklik gösterdi, ya da çok az glikozilasyon 15 vardır. Protein fosforilasyon durumu üzerinde deneyler devam etmektedir. Şimdiye kadar test deterjanların bazı olarak, daha önceden saflaştırılmış protein 2,15 yayınlanan benzemektedir oranlarda (bir CFTR spesifik inhibitör 16 ile engellenir) ATPaz aktivite gösterir. CFTR kanalı aktivitesinin belirlenmesi nispeten yüksek bir kritik misel konsantrasyonu (CMC) 17 olan bir deterjan nihai bir saflaştırma adım anlamına gelir saflaştırılmış protein, rekonstitüsyon gerektirecektir. Maya containin mikrozomlarıg CFTR gibi, genellikle "yumuşak" olarak kabul edilir dodesil maltoside 2 gibi deterjanlar dahil olmak üzere çeşitli yaygın olarak kullanılan deterjan 18 ile solublised edilebilir. Ancak en yüksek cmc deterjanları Bu deterjanların içine döviz herhangi bir arıtma düzeni geç bir aşamada düşünülmelidir düşündüren, şimdiye kadar, solubilsation için verimsiz olduğu kanıtlanmıştır.
The authors have nothing to disclose.
Biz, CFTR 3D-Yapı Konsorsiyumu (hibe sayısı FORD08XX0) aracılığıyla bu iş için fon Kistik Fibrozis Vakfı (CFF) teşekkür ederim. Biz CFTR gen tasarım, özellikle bu iş için Konsorsiyum içinde tüm meslektaşlarımızın büyük katkılarından dolayı teşekkür. Ayrıca Drs çok değerli katkılarından dolayı. James Birtley (NCSR Demokritos, Yunanistan), Mark Genç (Cardiff Üniversitesi, Birleşik Krallık) ve David Drew (Imperial College, Londra, Birleşik Krallık) çalışmalarının ilk aşamalarında. Özellikle yazının eleştirel okuma Dr Ina Urbatsch (Texas Tech. Üniversitesi, Lubbock) teşekkür ederim.
Name of reagent/equipment | Company | Catalogue No |
FGY217 S.cerevisiae strain, with pep4 deletion 10 | ||
Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0410 |
Complete supplement mixture without uracil | Formedium | DCS0169 |
Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306 |
D-galactose | Fisher | BP656-500 |
D-glucose | Fisher | D16-500 |
Pepstatin A | Sigma-Aldrich | P4265 |
Leupeptin | Merck | 108975 |
Chymostatin | Sigma-Aldrich | C7268 |
Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 |
Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64) | Sigma-Aldrich | E3132 |
Aminoethylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF) | Sigma-Aldrich | A8456 |
Benzamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 434760 |
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 |
dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 |
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher | BP120500 |
Tris-base | Formedium | TRIS01 |
Tris-HCl | Fisher | P631 |
D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 |
Glycerol | Fisher | 065017 |
NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 |
n-dodecyl-β-D-maltopyranoside | Affymetrix | D310S |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 |
PageRuler Plus prestained protein standards | Fermentas | SM1811 |
NuSep tris-gly 4-20% gradient gels | NuSep | NB10-420 |
Instant Blue Coomassie Stain | Novexin | ISB1L |
Glass beads, acid washed | Sigma | G8772 |
50ml Sterile Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.254 |
2ml Sterile screw-top vials | Sarstedt | 72.694.005 |
250ml Sterile Erlenmeyer baffled flasks | BD Biosciences | 355119 |
2l Sterile Erlenmeyer baffled flasks | BD Biosciences | 355131 |
2ml microfuge tubes | Sarstedt | 72.695 |
0.2μM syringe filter | Sartorius | FC121 |
ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355618 |
centrifuge tubes | Beckman Coulter | 357000 |
1l centrifuge pots | Beckman Coulter | 969329 |
Orbital shaking incubator with temperature control | New Brunswick Scientific | |
Deltavision RT restoration microscope | Applied Vision | |
Benchtop centrifuge | HERMLE | Z300 |
Benchtop microfuge | Fisher | 13-100-511 |
Vortex mixer | Star Labs | |
Typhoon Trio Scanner | GE Healthcare | 63-0055-87 |
LAS3000 imaging system | Fuji | |
20l fermenter vessel and control unit | Applikon | |
Constant systems cell disrupter | Constant systems | |
Beadbeater cell disrupter | BioSpec | 1107900 |
Mini-beadbeater-16 | BioSpec | 607 |
JA-17 rotor | Beckman Coulter | 369691 |
Optima L-100 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392050 |
50.2Ti rotor | Beckman Coulter | 337901 |