Colocar Sondas Biológicas para Biossensores ópticos de sílica usando agentes de acoplamento de silano

Summary

Biossensores interface com ambientes complexos e biológicas e realizar a detecção de alvo, combinando sensores altamente sensíveis com sondas altamente específicos ligados ao sensor através de modificação da superfície. Aqui, nós demonstrar a funcionalização da superfície de sensores ópticos de sílica com biotina, utilizando agentes de acoplamento de silano para colmatar o sensor eo ambiente biológico.

Abstract

A fim de interface com ambientes biológicos, plataformas de biossensor, tais como o sistema BIAcore popular (com base na ressonância plasmon de superfície técnica (SPR)), fazer uso de técnicas de superfície várias alterações, que podem, por exemplo, evitar a contaminação da superfície, ajustar o hidrofobicidade / hidrofilicidade da superfície, se adaptar a uma variedade de ambientes eletrônicos, e mais frequentemente, induzir especificidade em direção a um alvo de interesse. ^1-5 Estas técnicas estender a funcionalidade de biossensores de outra forma altamente sensíveis para aplicações do mundo real em ambientes complexos, tais como sangue, urina, e análise de águas residuais. ^2,6-7 Enquanto plataformas biosensoriamento comerciais, tais como BIAcore, têm bem entendido, as técnicas padrão para a realização de modificações de superfície tais, estas técnicas não foram traduzidos em uma forma padronizada para outro rótulo plataformas livres biosensoriamento, como Whispering Gallery modo (WGM) ressonadores ópticos. ^8-9 < / P>

Ressonadores WGM ópticos representam uma tecnologia promissor para a realização de rótulo livre detecção de uma grande variedade de espécies de ultra-baixas concentrações ^6,10-12 A elevada sensibilidade destas plataformas é um resultado dos seus únicos óptica geométrica:. WGM óptico ressonadores confine circulante . luz em momentos específicos, as frequências de ressonância integrais ¹³ como as plataformas SPR, o campo óptico não está totalmente confinada ao dispositivo sensor, mas evanesces; este "cauda evanescente" pode então interagir com as espécies no ambiente circundante. Esta interacção faz com que o índice de refracção efectivo do campo óptico para alterar, resultando em um ligeiro, mas detectáveis, deslocar na frequência de ressonância do dispositivo. Como o campo óptico circula, pode interagir muitas vezes com o meio ambiente, resultando numa amplificação inerente do sinal, e sensibilidades muito elevados a pequenas alterações no ambiente. ^2,14-15

tenda "> Para realizar a detecção de alvo em ambientes complexos, estas plataformas devem ser emparelhado com uma sonda molecular (geralmente a metade de um par de ligação, por exemplo, anticorpos / antígenos) por meio de modificação da superfície. ² Embora ressonadores WGM ópticos podem ser fabricados em diversas geometrias de uma variedade de sistemas de materiais, a microesfera de sílica é o mais comum. Estas microesferas são geralmente fabricadas na extremidade de uma fibra óptica, o que proporciona uma "haste", através da qual as microesferas podem ser manipulados durante as experiências de funcionalização e de detecção. químicas superfície da sílica pode ser aplicado para anexar moléculas de sonda para as suas superfícies, no entanto, as técnicas tradicionais gerados para substratos planares muitas vezes não são adequados para estas estruturas tridimensionais, como quaisquer alterações na superfície das microesferas (contaminação, pó, defeitos de superfície, e revestimentos irregulares) pode ter graves consequências negativas sobre as suas capacidades de detecção. Aqui, nós demonstrar uma abordagem fácilpara a funcionalização da superfície de ressoadores de sílica de microsferas WGM ópticos usando agentes de acoplamento de silano para colmatar a superfície inorgânico e para o ambiente biológico, anexando biotina para a superfície de sílica. ^8,16 Embora usamos ressoadores de sílica WGM de microsferas como o sistema de sensor no presente relatório, os protocolos são geral e pode ser usado para funcionalizar a superfície de qualquer dispositivo de sílica com biotina.

Protocol

1. Fundo

A biotina é ligada à superfície destes dispositivos por meio de um processo simples de três passos (Figura 1). Primeiro, nós limpar a superfície e preenchê-lo com grupos hidroxilo, expondo os dispositivos para o plasma de oxigénio ou de solução piranha. Em segundo lugar, usar deposição de vapor para prender o agente de acoplamento de silano terminada com uma amina primária para os grupos hidroxilo através de hidrólise e reacção de condensação. Em terceiro lugar, damos biotina para a superfície através de N-hidroxissuccinimida (NHS) Química éster. Nós dirigimos o leitor interessado em nosso trabalho anterior para obter mais informações sobre o desenvolvimento dessas técnicas, bem como uma explicação de nossa motivação para a escolha destas técnicas ^8.

O sucesso destas reacções pode ser avaliada através de microscopia óptica e de fluorescência após a adição da amina primária, assim como após a adição da biotina. Enquanto m ópticaicroscopy pode ser usado para determinar se os protocolos de funcionalização da superfície resultou em danos para a superfície de microesferas, ou mesmo a contaminação, a microscopia de fluorescência é utilizado para verificar a qualidade e uniformidade da cobertura da superfície da molécula de biotina, bem como a capacidade da biotina no a superfície a ligar com (strept) avidina. Para avaliar a cobertura de aminas na superfície, utilizou-se o isotiocianato de fluoresceína (FITC) corante fluorescente, que reage com aminas primárias para formar estável, a ligação covalente de tioureia para a microesfera. Texas Red corante fluorescente que tem sido conjugado com avidina é usado para identificar os grupos de biotina na superfície através da interacção biotina-avidina. Em ambos os casos, foram escolhidos corantes que podem interagir (quer através de interacções receptor-ligando ou ligação covalente) com os grupos funcionais sobre a superfície.

Aqui, o agente de acoplamento de silano, que tem três grupos de saída e um grupo funcional, fornece a aposta pontetre a superfície inorgânica e orgânica molécula de sonda. A funcionalidade amina primária reage quantitativamente com ésteres de NHS para formar ligações amida estáveis. Neste caso, usamos uma molécula sonda de biotina, cuja cadeia lateral valérico foi modificado com um grupo éster NHS. Realisticamente, qualquer molécula de sonda para o qual um grupo éster NHS pode ser adicionado à superfície utilizando os protocolos que se seguem. Além disso, esses protocolos são em geral, e pode ser usado para funcionalizar qualquer superfície dispositivo de sílica com biotina.

O desafio primária com esses protocolos não é na verdade na química si, mas sim no tratamento da sílica microesferas. Por favor note que, ao longo dos protocolos, as microesferas devem ser manuseados por grapsing suas hastes levemente com uma pinça de ponta aguçada. Isto mantém as pinças bem longe da microesferas si, e permite o transporte fácil entre os passos. Muitos passos do protocolo abaixo são projetados especificamente para abordar este fatoou.

2. Fabricação de microesferas

1. Construir o invólucro de armazenamento para as microesferas.
   1. Usando um estilete, corte um pedaço de espessura em ¼ de papelão em um 1 x 1 no quadrado; esta fita numa lâmina de vidro de tamanho normal, e anexar a 1 na seção de fita adesiva, com suas extremidades reunidos para formar um rolo , para o papelão.
   2. Isto cria uma plataforma sobre a qual a microsfera pode ser elevada e isolado a partir do ambiente circundante, e evita danos à sua superfície.
2. Utilizando uma tesoura, cortar uma secção de 3 polegadas de fibra óptica a partir de um carretel de fibra óptica.
3. Usando um n-Nik fibra-stripper, tira o revestimento protector polimérico a partir dos últimos 0,5 cm de distância da extremidade da peça cortada de fibra, deixando apenas o núcleo de sílica. Limpar a superfície de qualquer polímero restante com uma Kimwipe humedecido com metanol por suavemente limpando a fibra com o Kimwipe.
4. Usando uma simples fibra cutelo, corte a extremidade descascada tão them apenas cerca de 1 milímetro de fibra despojado permanece na extremidade da fibra.
5. Coloque a extremidade descarnada da fibra óptica no caminho de um laser de CO _2, tendo o cuidado de alinhar verticalmente a fibra tal que a sua extremidade descarnada está voltada para baixo.
6. Ligue o laser de CO _2, e dirigi-lo para a superfície da extremidade descarnada da fibra óptica. O laser vai derreter a extremidade descascada da fibra em uma esfera com cerca de 3,5% de poder em 2 segundos.
7. Com uma pinça, cuidadosamente agarrar da haste (a porção não-descascada da fibra óptica) da microesfera. Fixe a haste com o rolo de fita na caixa de microesferas. A lâmina de vidro pode ser em si armazenado numa placa de Petri. Isto permite a armazenagem segura da microesfera.

3. Preenchendo a superfície com grupos hidroxila

1. Usando solução piranha:
   1. Em um frasco de polipropileno de 60 ml com uma tampa articulada, preparar uma solução piranha (70:30 em volume fumegante H 4: H2O ₂ (30% em peso)) pela adição de 5 ml de peróxido de hidrogénio para o frasco, seguido por 11,6 mL de ácido sulfúrico fumante. CUIDADO: usar ácido-resistentes luvas.
   2. Transferir a lâmina de vidro, que possuem pelo menos uma microesfera, ao frasco. A microesfera deve estar em contacto com o líquido, mas o líquido não deve tocar o papelão. Ajustar o volume da solução, se necessário.
   3. Remova cuidadosamente a lâmina de vidro do frasco, e inseri-lo em outro frasco plástico contendo DDI H ₂ O. Deixe as amostras sentar-se na solução durante 5 minutos.
   4. Remover suavemente a lâmina de vidro a partir do frasco, e colocá-lo num forno a 80 ° C durante 10 minutos para secar a superfície.
2. Usando o tratamento de plasma de oxigênio:
   1. Transferir a lâmina de vidro contendo pelo menos uma microesfera para a câmara de plasma de oxigénio.
   2. Ajustar a pressão de oxigénio para 200 mTorr, eo poder de 120 W. Expor a amostra para o plasma de oxigénio durante 2 minutos.
   3. Remover a lâmina de vidro a partir da câmara de plasma.

4. Colocar agentes de acoplamento de silano à superfície

1. Coloque a lâmina de vidro, contendo pelo menos uma microesfera, em um exsicador de vácuo numa hotte.
2. Também no exaustor, abrir a garrafa agente silano de engate (neste caso, aminopropiltrimetoxisilano (APTMS) foi utilizado), e colocar a garrafa aberta no exsicador.
3. Colocar a tampa sobre o exsicador de vácuo, e anexar a porta de saída para um aspirador ou uma linha de vácuo casa.
4. Ligue o vácuo casa ou a linha de água, e evacuar o exsicador de vácuo. Uma vez que um selo de vácuo é formado entre a tampa ea base, começar a cronometragem a reacção. Isto irá depositar o agente de acoplamento de silano sobre a superfície como uma película fina.
5. Após 15 minutos, desligar a vácuo, e, lentamente, abrir a porta para permitir que o ar no exsicador. Para este agente de acoplamento, a 15 minutos é suficiente para formar um unifomonocamada rm sobre a superfície. Para outros agentes de acoplamento, o tempo pode necessitar de ser ajustada.

5. Colocar Biotina à superfície

1. Aproximadamente uma hora antes de prender a biotina, preparar uma solução 10 mM de N-hydroxylsuccinimide biotina (NHS-biotina) em dimetilsulfóxido anidro (DMSO) num frasco de polipropileno de 60 ml com uma tampa articulada.
   1. Se o NHS-biotina foi armazenado frio, deixe-o atingir a temperatura ambiente antes juntando-lo.
   2. Sonicar a solução durante 1 hora para dissolver completamente o pó NHS-biotina no solvente.
2. Transferir a lâmina de vidro contendo a microesfera em outro frasco de plástico, com as microesferas no fundo, e as hastes na parte superior do frasco.
3. De transferência, usando uma pipeta de plástico, um volume apropriado da solução NHS-biotina para o lado do frasco, por trás da lâmina de vidro (para que a solução não toca a microesfera como está sendo adicionada ao frasco). Add solução suficiente para cobrir a superfície de microesferas.
4. Colocar os tubos que contêm agora as microesferas e NHS-biotina em solução de DMSO numa incubadora de balanço (bandeja de inclinação) durante 30 minutos à temperatura ambiente, com a velocidade e ângulo de inclinação a 5 rpm e 5 graus, respectivamente.
5. Remova cuidadosamente a lâmina de vidro do frasco, e deslize-o em outro frasco cheio de DDI H ₂ O. Colocar o frasco sobre a bandeja de inclinação por mais 10 minutos à mesma velocidade e ângulo de inclinação, como antes. Repetir este passo duas vezes com água fresca de cada vez. Isto ajuda a remover o excesso de DMSO a partir da superfície, e remove qualquer biotina fisicamente adsorvido que não chegou a enxerto à superfície.
6. Remover a lâmina de vidro a partir do frasco, e colocá-lo num forno a 80 ° C durante 10 minutos, ou até que todas as gotas de água são removidos da superfície.

6. Marcação fluorescente de amina terminada sílica

1. Para identificar os grupos amina presentes após tratament com APTMS, preparar a solução de FITC num quarto escurecido por dissolução de 1 mg em 1 mL de FITC DMSO anidro.
2. Dilui-se a solução em 6,1 pela adição de 50 uL da solução de FITC a 1 mL de 0,1 M tampão de bicarbonato de sódio.
3. Coloque a solução num frasco de polipropileno de 60 ml com uma tampa articulada e deslize suavemente a microesferas de amina terminada, alojados novamente sobre a lâmina de vidro, para dentro do frasco.
4. Colocar o frasco num banho de gelo, e deixar a amostra reagir com a solução de FITC durante um mínimo de 4 horas no escuro.
5. Remover o excesso fluoróforo através de duas lavagens, 10 minutos de microsferas em tampão de carbonato de sódio. Como antes, encher um frasco de polipropileno de 60 ml com uma tampa articulada com o tampão, e deslize suavemente a lâmina de vidro para dentro da solução, tendo o cuidado de que a solução apenas cobre a microesfera, e não o invólucro de cartão. Cobrir o frasco com folha de alumínio, e colocar o frasco sobre uma bandeja de inclinação fixada em 5 graus e 5 rpm, como anteriormente.
6. Remova cuidadosamente a lâmina de vidro do frasco, e deslize-o em outro frasco cheio de DDI H ₂ O e coberto com papel alumínio. Colocar o frasco sobre a bandeja de inclinação por mais 10 minutos à mesma velocidade e ângulo de inclinação, como antes. Repetir este passo duas vezes com água fresca de cada vez. Isto ajuda a remover o excesso de corante da superfície.
7. Remover suavemente a lâmina de vidro a partir do frasco, e seco num forno regulado a 80 ° C durante 10 minutos antes de imagem.

7. Marcação fluorescente da biotina terminada sílica

1. Preparar uma solução de 10 ug / mL de Texas Red-avidina em tampão fosfato salino.
2. Adicionar a solução para um frasco de polipropileno de 60 ml com uma tampa articulada e deslize suavemente a lâmina de vidro contendo uma microesfera biotina terminada dentro da solução, de modo que a microesfera está coberto pela solução.
3. Reagir durante 30 minutos à temperatura ambiente no escuro.
4. Remover fluoróforo excesso através de dois, 10 minutos enxaguars de microsferas em tampão PBS.
   1. Como antes, encher um frasco de polipropileno de 60 ml com uma tampa articulada com o tampão, e deslize suavemente a lâmina de vidro para dentro da solução, tendo o cuidado de que a solução apenas cobre a microesfera, e não o invólucro de cartão.
   2. Cobrir o frasco com folha de alumínio, e colocar o frasco sobre uma bandeja de inclinação fixada em 5 graus e 5 rpm, como anteriormente.
5. Remova cuidadosamente a lâmina de vidro do frasco, e deslize-o em outro frasco cheio de DDI H ₂ O e coberto com papel alumínio. Colocar o frasco sobre a bandeja de inclinação por mais 10 minutos à mesma velocidade e ângulo de inclinação, como antes. Repetir este passo duas vezes com água fresca de cada vez. Isto ajuda a remover o excesso de corante da superfície.
6. Remover suavemente a lâmina de vidro a partir do frasco, e seco num forno regulado a 80 ° C durante 10 minutos antes de imagem.

8. Os resultados representativos

Microesfera corretamente funcionalizados podem ser identificados através de microscopia óptica e de fluorescência. Se a funcionalização da superfície é feito correctamente, deve resultar em uma cobertura uniforme densa de moléculas de biotina na superfície, ea superfície deve permanecer defeito e contaminante-livre após a funcionalização, a fim de manter as suas sensibilidades elevadas durante as experiências de detecção. A microscopia óptica pode ser usado para sondar a esta última, enquanto fluorescente microscopia pode sondar a qualidade e uniformidade da cobertura da superfície. Na Figura 2, que mostram exemplos de microesferas correctamente funcionalizado. Estas imagens mostram que não há danos na superfície ou contaminação devida a funcionalização (Fig. 2a), e que as microesferas mostram uma cobertura uniforme e consistente de grupos tanto de amina (Fig. 2b) ou grupos de biotina (Fig. 2c) sobre a superfície .

Se as microesferas não foram funcionalizados correctamente, a microsferas óptico de imagens will exibem a contaminação da superfície, a cobertura de aglutinação ou não-uniforme, e defeitos óbvias na superfície, como fissuras de superfície (Figura 3). Aqui, vemos um exemplo comum de contaminação da superfície, resultante da aglomeração dos reagentes na superfície.

Figura 1. 3-passo esquema de reacção para a fixação de moléculas de sonda para a superfície de sílica microesferas. para ver figura maior .

Figura 2. Sílica microesferas. uma micrografia) óptico de microesfera de sílica preenchida com grupos hidroxilo através da exposição ao plasma de oxigénio; b) micrografia fluorescente de microesfera de sílica preenchida com aminas primárias e marcadas com FITC corante; c) micrografia fluorescente de sílica microsphere preenchida com biotina e rotuladas com Texas Red-avidina conjugada. Reproduzido com permissão da Soteropulos, CE, Hunt, HK & Armani, AM Determinação da cinética de ligação usando microcavidades modo sussurrando galeria. Appl. Phys. Lett. 99, 103.703-103.703 (2011). Copyright 2011, a American Institute of Physics ^17.

Figura 3. Micrografia óptica de esfera impropriamente funcionalizado. Aqui, pode ver pó sobre a superfície superior direito, bem como a contaminação se estende para fora da superfície. Além disso, o lado direito da microesfera óptico mostra um torrão pequeno sobre a superfície.

Discussion

Tal como descrito nos protocolos, foi criada uma plataforma de habitação, através da qual a transportar o microesferas de sílica por suas hastes durante todo o processo de funcionalização. Esta plataforma habitação foi criado como uma solução para a contaminação da superfície e danos que resultou da microesfera que entram em contacto com as paredes dos recipientes diferentes usados ​​em todo o processo de funcionalização. Percebemos que a principal dificuldade surgiu constantemente anexação e desanexação microesferas individualmente para recipientes diferentes durante o processo de funcionalização. Era difícil evitar escovar o micro contra um objeto quando se deslocam cada um individualmente, com uma pinça, segurando para as hastes. Ao estabilizar a posição de cada microesfera sobre a lâmina de vidro, fomos capazes de mover simplesmente um número de microesferas dentro e para fora dos recipientes diferentes, por manipulação da lâmina de vidro, e não a haste da microesfera. Desta forma, fomos capazes de funcionalizar muitos destes devices, ao mesmo tempo, e nós eliminada a contaminação e danos na superfície causada por manipulação imprópria, resultando numa taxa de sucesso ~ 90% de criar não danificado, microesferas funcionalizado.

Tal como indicado nos protocolos, explorámos dois métodos pelos quais a hidroxilar a sílica microesferas. Enquanto solução piranha é comumente usado para isso, pode ser demorado, e exige química úmida. Ao trabalhar com microesferas, observamos a superioridade da hidroxilação através de tratamento com plasma de oxigênio. Tratamento com plasma de oxigénio não requer o contacto com soluções líquidas, sem secagem, e nenhum tratamento da sílica microesferas. Além disso, é um processo muito mais rápido para preencher a superfície com grupos hidroxilo. No entanto, reconhecemos que nem todos os grupos de pesquisa terão acesso a equipamentos de plasma de oxigênio e, portanto, pode precisar de usar a solução piranha para formar a funcionalidade necessária hidroxila. A utilização de qualquer um deles vai resultar na formação de grupos hidroxilo ema superfície.

A prevenção da contaminação durante a funcionalização de superfície é um grande problema, mas pode ser minimizada por aderência cuidado para os protocolos. As causas mais prováveis ​​de contaminação são manipulação pobre durante funcionalização, bem como a lavagem imprópria ou não-completa da superfície após cada um dos passos de reacção. Este é particularmente o caso durante o primeiro passo da reacção, onde a superfície é preenchida com grupos hidroxilo. Se a solução piranha é escolhido para este método, deve ser tomado cuidado para remover completamente qualquer ácido sulfúrico a partir da superfície, e para secar completamente a microesfera, como a superfície é agora muito hidrófilo, e água dos enxaguamentos se agarra à superfície. Se o ácido sulfúrico permanece na superfície, a microesfera torna-se "pegajosa" e pó a partir do ambiente de laboratório recolhe na superfície mais prontamente. Além disso, as gotículas de água na superfície fazer com que o agente de acoplamento de silano a reunir na área do watgotículas er, formando uma bola de sílica polimérica, que é visto como a aglutinação das micrografias fluorescentes. Se aglutinação superfície ocorre, que evita a microesfera de ser usado em experiências de detecção, por causa de uma grande queda na sensibilidade do dispositivo. Tipicamente, quando o tratamento de plasma de oxigénio é usado, aglutinação de superfície, bem como a contaminação, é minimizado. No entanto, nem todos os laboratórios tem acesso a este equipamento, portanto, usando a solução piranha pode ser uma necessidade.

Finalmente, descobrimos que era necessário para a solução sonicar NHS-biotina antes de usar para dissolver completamente o NHS-biotina em DMSO. Quando este passo foi ignorado, o NHS-biotina que depositar sobre a superfície em grandes aglomerações via adsorção física, em vez de ligação covalente à superfície. Estas grandes aglomerações são extremamente difíceis de remover durante os passos de lavagem, mas pode ser prevenida por dispersão adequada durante a dissolução inicial. Uma hora é normalmente suficiente para este fim;no entanto, se estes procedimentos são estendidos a moléculas de sonda outros modificados com grupos de éster de NHS, é recomendável avaliar a solução através de dispersão dinâmica de luz para assegurar a dissolução completa.

Os protocolos detalhados aqui representam um passo em frente na tradução de químicas de sílica planares de superfície para tridimensional dispositivos, onde a qualidade da cobertura da superfície e da superfície do dispositivo são igualmente importantes para a utilização final dos dispositivos. Quando estes protocolos são utilizados, as microesferas totalmente funcionalizado mostrou cobertura uniformemente densa da molécula de sonda, sem contaminação ou aglomeração sobre a superfície. Esta cobertura de superfície uniforme permite a manutenção de alta sensibilidade quando estes dispositivos são usados ​​em experiências de detecção. O uso de agentes de acoplamento de silano como uma ponte entre o substrato inorgânico e da molécula de sonda biológica é simples e directo, e pode ser utilizado, em particular com o bem-entendido (e muito cOMUM) NHS de éster química, para preencher ópticos superfícies biossensor com moléculas de sonda de vários tipos.