Lav Molekylær Vægt Protein berigelse mesoporøse silica Tynde Film til biomarkør Discovery

Summary

Vi udviklet en teknik baseret på mesoporøse silica tynd film til selektiv genvinding af proteiner med lav molekylvægt og peptider fra humant serum. De fysisk-kemiske egenskaber af vores mesoporøse chips blev fintunet til at yde omfattende kontrol i peptid berigelse og dermed profilere serum proteom til diagnostiske formål.

Abstract

Identifikationen af cirkulerende biomarkører rummer et stort potentiale for ikke invasive metoder i tidlig diagnose og prognose, samt til overvågning af terapeutiske effektivitet. ^1-3 Den cirkulerende lavmolekylært proteomanalyse (LMWP) består af små proteiner kaste fra væv og celler eller peptidfragmenter afledt fra proteolytisk nedbrydning af større proteiner, er blevet associeret med patologiske tilstand hos patienter og sandsynligvis afspejler tilstanden af sygdommen. ^4,5 Trods disse potentielle kliniske anvendelser anvendelse af massespektrometri (MS) profilere LMWP fra biologiske væsker har vist sig at være meget vanskelig på grund af den store dynamikområde af protein-og peptid-koncentrationer i serum. ⁶ uden prøve forbehandling nogle af de mere stærkt rigelige proteiner tilsløre påvisning af lav tæthed arter i serum / plasma. Aktuelle proteom-baserede tilgange, såsom to-dimensionelle polyacrylamid gel-electrophoresis (2D-PAGE) og shotgun proteomics metoder er arbejdskrævende, lav kapacitet og tilbyde begrænsede egnethed til kliniske anvendelser. ^7-9 er derfor en mere effektiv strategi for at isolere LMWP fra blod og lad high throughput screening af kliniske prøver .

Her præsenterer vi en hurtig, effektiv og pålidelig multi-fraktionering system baseret på mesoporøse silica chips til specifikt at målrette og berige LMWP. ^10,11 mesoporøse silica (MPS) tynde film med afstemmelige egenskaber på nanoskala, blev fremstillet ved hjælp af triblokcopolymeren skabelonen vej . Brug af forskellige polymer skabeloner og polymerkoncentrationer i forløberen løsningen, blev forskellige porestørrelsesfordelinger, pore strukturer, tilslutningsmuligheder og overfladeegenskaber bestemmes og anvendes til selektiv udvinding af lave masse proteiner. Den selektive parsing af de berigede peptider i forskellige underklasser efter deres fysisk-kemiske egenskaber vil daHance effektiviteten af ​​inddrivelsen og påvisning af lav hyppighed arter. I kombination med massespektrometri og statistisk analyse påviste vi, at korrelationen mellem Nanophase karakteristika mesoporøse silica tynde film og specificitet og effektivitet med lav masse proteomanalyse høst. Resultaterne præsenteres heri afslører potentiale nanoteknologi-baserede teknologi til at give et godt alternativ til traditionelle metoder til LMWP høst fra komplekse biologiske væsker. På grund af evnen til at indstille de materialeegenskaber, mulighed for billig produktion, enkelhed og hurtighed for prøvetagning, og de stærkt reducerede prøve krav til analysen vil denne roman nanoteknologi væsentligt påvirke området proteom biomarkør forskning og kliniske proteomisk vurdering.

Protocol

1. Chip Fabrication

1. Skabe belægningsopløsningen til chippen ved at starte med den hydrolyserede silikat forstadieopløsning. Bland 14 ml tetraethylorthosilicat (TEOS) med 17 ml ethanol, 6,5 ml deioniseret vand og 0,5 ml 6M HCl under kraftig omrøring (1200 omdrejninger i minuttet) ved anvendelse af en omrørt varmeplade. Opvarme denne opløsning ved 80 ° C i 2 timer, idet omrøring konstant.
2. Fremstille polymeropløsninger ved tilsætning af den ønskede tri-blok coploymer (Pluronic F127, L121 og P123) til 10 ml ethanol ved stuetemperatur under kraftig omrøring. Færdiggøre blandingen ved tilsætning af 7,5 ml af silikatopløsningen (fra trin 1.1) i tri-blok-copolymer-opløsningen efterfulgt af 2 timers kraftig omrøring ved stuetemperatur. Dette repræsenterer den endelige coating-opløsning.
3. Anvendes 1 ml coating-opløsning på en 4 tommer siliciumskive ved spin-coating med en hastighed på 1500 rpm i 20 sekunder. Derefter opvarmes ved 80 ° C i 12 timer.
4. Opvarme film for at fjerne organisk surfactant ved at hæve temperaturen 1 ° C per minut til 425 ° C, og derefter bages i 5 timer.
5. Forbehandle mesoporøse silica (MPS) chip overfladen med oxygen plasmaforaskning (Plasma Asher - marts Plasma System). (O ₂ Flowhastighed: 80 SCCM, effekt: 300 W, tid: 10 minutter).
6. Valgfri overflade kemisk modifikation: silanate chips i 3% organosilan i en methanol: DI vand (19:01) opløsning i 72 timer ved stuetemperatur i en _N2 handskekasse. Skylles sekventielt med methanol og Dl-vand. Hærde chips ved 110 ° C i 15 minutter i en blæser-drevne ovn.

2. Prøven Forbehandling

1. Tilsættes TFA og ACN hver serumprøve, således at de endelige koncentrationer er 0,01% TFA og 5% ACN. Vortex for at blande.
2. Ryste disse prøver på et bord vortex-ryster ved stuetemperatur i 30 minutter.

3. Serum Fraktionering

1. Forbag ​​chips natten over i en ovn ved 160 ° C. Alternativt, Store chips i en ekssikkator indtil den er klar til at bruge til at forhindre hydrering af overfladen ved omgivende vand i luften.
2. Komprimeret luft til at støve eventuelle partikler, der kan være på overfladen af ​​chippen.
3. Skåret præfabrikerede, købt CultureWell kamre dækglas omfatter det ønskede antal brønde. Clean dækglas med 100% ethanol og derefter plads på MPS chip overfladen. Tryk dækglas ned med pincet for at sikre en fuldstændig tætning med chip.
4. Pipetten 10 pi serumprøve i hver 3 mm brønd. Inkuber i 30 minutter i et fugtigt kammer ved stuetemperatur.
5. Afpipetteres op serum fra brønde og kassér. Pipetten 10 uL af deioniseret vand til hver brønd for at bortvaske større proteiner. Gentages 4 gange.
6. Pipetter 5 uL elueringsbuffer (0,1% TFA + 50% ACN) til hver prøvebrønd. Pipettere op og ned 30 gange, mens bevægelse af pipettespidsen rundt i brønden for at blande elueringspufferen. (Kun anvendelse elueringspuffer til 1-2 prøver ad gangen for at forhindre elueringsbufferat fordampe så hurtigt).
7. Efter blanding, pipetteres al elueringsbuffer og anbringes i et mikrocentrifugerør, indtil klar til at udføre MALDI-TOF-analyse.
8. For at efterligne kompleksiteten i en biologisk prøve, og at evaluere berigelse effekt i høst lavmolekylære arter med vores on-chip fraktionering system, vi udvalgt og samlet en standard blanding af proteiner og peptider tælle 20-seks forskellige arter med en bred række molekylvægte (900 til 66 500 Da) og proteasehæmmere (4,0-10,2) og koncentrationer (0,5-8 pmol / pl) (se protein listen i tabel 1).

4. MALDI-TOF analyse af peptider

1. Spot 0,5 ul prøve at MALDI måltavle og lad det tørre.
2. Plet 0,5 uL matrix (α-cyano-4-hydroxykanelsyre (CHCA), 5 g / L) eller mættet opløsning af trans-3 ,5-dimethoxy-4-hydroxykanelsyre (SA) i 50% acetonitril indeholdende 0,1% TFA og gør det muligt at co-krystallisation. </ Li>
3. Spot 0,5 ul kalibreringsopløsning hver kalibrering stedet og lad det tørre.
4. Indsætte målplade i MALDI-TOF massespektrometer. Maskinen skal indstilles til positiv reflektor tilstand med en laser intensitet af 4200 og 3000 skud pr prøve. Den valgte masseinterval være 800-5000 Da med et mål masse på 2000 Da.
5. Udfør samme MALDI-TOF analyse i linear mode, men ændre masseinterval til 900 til 10.000 Da eller 3000 til 70.000 Da og et mål masse på 5000 Da.

5. Dataanalyse

1. Den rå spektre blev behandlet med ConvertPeakList software og data blev eksporteret til SpecAlign software til programmeringssproget. Alle spektre blev opstillet under anvendelse af PAFFT korrelationen fremgangsmåden og intensiteter blev normaliseret til totalt ionstrøm (TIC) i hver tilsvarende spektrum. Alle spektre blev glattet og de-noised med faktor 4 og 0,5 hhv. Toppe blev påvist med en baseline på 0,5, masse vindue 21 og højdeforholdet 1,5, var negative værdier fjernet før analyse.
2. Hierarkisk klyngedannelse blev udført under anvendelse Cluster 3,0 og visualiseret med MapleTree software. MALDI MS Data (m / z topintensiteter) var log-transformeret, normaliseret, og median centreret. Pearson korrelation blev anvendt til at beregne afstanden mellem prøverne, og fuldstændig binding klyngedannelse blev udført.
3. En uafhængig Student t-test blev anvendt til sammenligning mellem grupper (n = 2 grupper) for hver detekteret MS top før overvåget hierarkisk klynger analyse. En P-værdi på 0,02 eller derunder blev anset for signifikant at udvælge differentielt høstet peptider og proteiner blandt de forskellige mesoporøse proteom chips (store porer vs små porer).

6. Repræsentative resultater

Som vist i figur 1, i denne undersøgelse har vi fremstillet en serie af mesoporøse silica tynde film med en række nanotextures og omfattende udforskedeIR anvendelse i selektive indfangning og berige LMW peptider og proteiner fra humant serum. Figur 2a og b viser MS spektre af råt serumprøve for peptider i området fra 900 til 10.000 Da og proteiner i intervallet fra 3000 ~ 70 tusind Da henholdsvis . Disse spektre illustrerer signalet suppression i LMW region på grund af tilstedeværelsen af både ioniseret, meget rigeligt med høj molekylvægt (HMW) proteiner, såsom albumin. Figur 2c og d viser MS spektre af serumprøven efter fraktionering af MPS L121 (porestørrelse, 6 nm). De fleste af de store molekyler er blevet udtømt, hvilket resulterer i en betydelig berigelse af LMW komponenter. Som en kontrol blev den samme serumprøven påføres en porøs ren siliciumdioxid overflade bedømme specificiteten af ​​MPS tynde film til LMWP genvinding. Som det kan ses i figur 2E og f, der var ingen signifikant høst af peptidevand eller proteiner fra den ikke-porøse silica. Det kan således konkluderes, at det var det mesoporøse arkitektur og ikke silicaoverfladen affinitet, der udgør den fremherskende faktor ved berigelse af LMWP.

Præcist styrede variationer i porestørrelse kan opnås ved anvendelse af copolymerer med forskellige hydrofobe bloklængder. Ved hjælp af udformet proteiner og peptider blanding, blev virkningen af ​​porestørrelse på LMW peptidet og proteinet genvinding virkning undersøgt ved anvendelse af MPS tynde film fremstillet ud fra fire Pluronic overfladeaktive (F127, P123, L121 og L121 plus kvældningsmiddel) med forskellige volumenforhold de hydrofile og hydrofobe komponenter til dannelse porestørrelser på 3,7 nm, 5,2 nm, 7,4 nm, og 9,0 nm hhv. Dette område af porestørrelser førte til genvinding af en anden repertoire af peptider og proteiner fra den samme serumprøven via størrelsen og formen udelukkelse (figur 3). Proteinet spektre med høj molekylvægt demonstrate den molekylære afskæring af hver chip. Ud over den størrelse-afhængige nedbrydning af HMW-proteinerne, viser på chippen fraktionering af standarder opløsningen et differentielt og selektiv berigelse af LMW arter forbundet med porestørrelser. Tovejs hierarkisk klyngedannelse vist i figur 3b viser LMW standarder tilsætning mønster opnået med de forskellige MSC. Selv om alle peptiderne er under molekylær afskæring på spånerne, der er en positiv korrelation mellem porestørrelser og den molekylære vægt af den indesluttede arter. MSC med store porer, op til 9 nm, fortrinsvis høste større peptider, mens mindre peptider udvindes mere effektivt af chips med mindre porer. Den strukturelle omdannelse af det mesoporøse arrangementet blev udført ved at indstille koncentrationen af ​​skabelonen polymer. Forøgelse af koncentrationen af ​​skabelonen polymer resulterede i en reduceret grænsefladespændingen krumning mellem faserneaf vandet copolymeren, og silicatet, således at indlede indbyrdes progression fra en sfærisk til en cylindrisk struktur. Pluronic F127, med den høje molekylvægt, har denne høje grad af strukturel periodicitet. Ved at øge koncentrationen af ​​F127 i udgangsopløsningen, kan forskellige MPS tyndfilm periodiske nanostrukturer opnås fra 3D nanostruktur til 2D nanostruktur. 3D kubiske og honeycomb sekskantede nanostrukturer, der besidder mere ønskværdigt nanopore sammenkobling og mere tilgængelige nanopore morfologi udviser overlegen ydelse i selektivt berige LMV peptider end 2D sekskantede struktur, selv om de deler samme porestørrelsesfordelinger og den samme molekylære cut-off for serum fraktionering (figur 4). Vi har også strømlinet bøjningen af ​​organo-silan på MPS chips ved at indføre ilt plasmaforaskning at forbehandle chip overfladen. For at kvalitativt undersøge den elektrostatiske påvirkning af udvalgteive on-chip berigelse, vi bruger de proteiner og peptider blanding. MS-analyse af proteom standarder opløsningen fraktioneret på MPS chips fremstillet med L121 og konjugeret med de kemisk funktionelle grupper er præsenteret i figur 5. Den positivt ladede og negativt ladede peptider og LMW proteiner indfanget på anioniske og de kationiske chips hhv. Den kvantitative sammenligning af flere MPS chips i at inddrive de peptider med positiv netto ladning er vist i figur 5a. Chips med negativ ladning, og chips uden modifikation (med en mindre negativ ladning oprindeligt) udviser væsentligt højere berigelse for disse peptider end spåner modificeret med APTES _(-NH2). Omvendt, de positivt ladede MPS chips besidder enestående evne til at inddrive disse peptider med negativ nettoladning, som vist i figur 5b. Mens α-endorphin ikke udviser en signifikant ændring dUE til PI omkring 6.

Figur 1. Princip for MPS chips fraktionering og LMW berigelse. Efter prøven pletter på overfladen, er LMW-proteiner og peptider, fanget i de porer, mens de større arter forblev uden porer og fjernes under vasketrinene. De berigede fraktioner elueres derefter og analyseres ved MALDI.

Figur 2. Peptid berigelse ved hjælp af de mesoporøse silica tyndfilm chips. MALDI MS profiler i både den lave masseinterval (900 til 10 000 Da) og den høje masseinterval (3000 til 70 000 Da) før (a, b) og efter (c, d) serum behandlingen ved mesoporøse silica tynde film ( L121, 6 nm). Den molekylære opsving reduceres betydeligt ved brug af tomme uporøse silica overflader (e, f).

Figur 3. Molekylær cut-off og størrelse-afhængig berigelse af MPS chips. (A) forstørrelse af MALDI spektrene viser karakteristiske molekylær afskæring på hver MPS chips korrelerer til porestørrelse. (B) To-vejs hierarkisk klynger af peptid Mix er blandt de forskellige chips. Intensiteten af ​​den røde eller gul farve indikerer den relative peptidkoncentration. Større porer forbedret høstning af større peptider (3600-8500 Da), mens de små peptider (900 til 3500 Da) fortrinsvis er udvundet fra flisen med mindre porer.

Figur 4. Fysiske karakteristika af MPS tynde film og selektiv inddrivelse med forskellige nanostrukturer. XRD-mønstre (a, b, c), TEM (inset a, b, c), Pluronic F127 i forskellige koncentrationer i precursor-opløsning: 4,0 ×10 ^-3 M (a), 6,0 x 10 ^-3 M (b), og 8,0 x 10 ^-2 M (c). (D) Bar graf over intensiteten af ​​påvisning illustrerer den selektive peptider genvinding på 3D kubiske og 3D sekskantede F127 proteom chips (Cub og Hex, henholdsvis). De forskellige strukturelle ændringer, præsentere en selektiv berigelse.

Figur 5. Charge-specifik opsving for de chips med forskellige overflade funktioner. Søjlediagram af MS intensiteten af ​​påvisning af selektivt indfangede peptider på funktionaliserede chip. Overensstemmelse med deres isoelektriske punkt, er peptiderne positivt eller negativt ladet ved pH 7,0. (A) Positive peptider ((1) des-arg1-Bradykinin, (2) Bradykinin, (3) substans P-amid, (4) neurotensin, (5) ACTH (1-17), (6) ACTH (7 - 38)) er specifikt beriget på den negativt ladede suransigter. (B) Negative peptider ((7) Glu1-fibrinopeptid B, (8) α-endorphin, (9) ACTH (18-39), (10) insulin, (11) EGF (12) insulinlignende GFII) er specifikt beriget på positivt ladede overflader.

Figur 6. På chippen stabilisering af fraktioneret serum. (A) Repræsentative MALDI profiler LMW peptider og proteiner blev elueret umiddelbart efter serum fraktionering (øverst) eller efter 3 uger med on-chip opbevaring ved stuetemperatur (nederst). (B) fra top til bund: Lineær regressionsanalyse af den gennemsnitlige intensitet af detekterede MS toppe i hver gentagelse sammenlignet replikere 1 til frisk fraktioneret serum og fraktioneret serum efter 3wk MPS chips opbevaring ved stuetemperatur. Ligning, CV og determinationskoefficienten (R ²⁾ er angivet.

Discussion

Beviser er stigende, at lav molekylevægt region af kredsløbet proteom er en rig kilde af diagnostiske biomarkører til tidlig påvisning af sygdom. I denne teknologi præsenterede vi en serie af mesoporøse silica chips med forskellige porestørrelser, porestrukturer og modifikationer til selektivt beriger peptider og proteiner med lav molekylvægt. At evaluere proteinstabilitet blev MPS chips inkuberet med humant serum, tørret efter vask, og opbevaret i 3wk ved stuetemperatur. Protein / peptid opnåede mønstre var sammenlignelige med dem af frisk fraktioneret serum (fig. 6a), som bekræftet af resultaterne af den statistiske analyse viste i figur 6b. Variabiliteten af ​​de maksimale signaler målt ved den gennemsnitlige CV blev anslået til 12,7% for rå serum og 14,2% for de fraktionerede prøver. De marginale ændringer kunne skyldes den indre variabilitet af MALDI instrument og foreslog, at on-chip forbehandling og opbevaring ikke inducerer nogen signifikant ændring af MS proteinprofiler. Det samme eksperiment blev udført på ikke-porøse silicium. Den tørrede serum inddrives efter lagring på silicium overfladen var fraktioneret på MPS chips før MALDI analyse. Den stakkels MS profil opnået vist stabilisering fordel af mesoporøse overfladen. I analogi med tidligere postulerede mekanismer hypotese vi, at LMW art fanget inde i nanoporer blev bevaret fra nedbrydning ved størrelseseksklusion af proteaser eller ved sterisk inhibering af deres proteolytiske aktivitet i det lukkede rum for nanoporer. MPS chip baserede metode kunne være et magtfuldt værktøj i peptid og LMW protein profilering af komplekse biologiske væsker undersøgelse. MPS chips er billig at fremstille og tillader opskaleret produktion for at opnå den samtidige behandling af et stort antal prøver, der giver fordelagtige egenskaber for sonderende screening og biomarkør opdagelse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tetraethoxysilane	Sigma-Aldrich	131903	98%
Spin coater	Brewer Science, Inc.	Cee 200X
Plasma Asher	Nordson March	AP-600
Spectroscopic Ellipsometer	J. A. Woollam Co.	M-2000DI
MALDI-TOF	Applied Biosystems	Voyager-DE-STR
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid	Sigma-Aldrich	C8982	Matrix for MALDI-TOF
trans-3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid	Sigma-Aldrich	85429	Matrix for MALDI-TOF
Stir hot plate	Thermo Fisher Scientific, Inc.	11-475-30Q
CultureWell chambered coverglass	Sigma-Aldrich	GBL103350	3 mm diam. ×1 mm depth, 3-10 μL, sterile
Pluronic F 127	BASF		PEO106-PPO70-PEO106
Pluronic L121	BASF		PEO5-PPO70-PEO5
Pluronic P123	BASF		PEO20-PPO70-PEO20
Table 1. Physico-chemical properties and designed concentrations (Molecular weight and Iso-electric point) of the selected peptide and protein standards.