Summary
Метод, представленные здесь описывается анализ следовать активации RhoA конкретных ВВП / GTP Факторы биржи (GEFs) в культуре клеток путем использования мутантов RhoA стоимость гибридного белка, который имеет высокое сродство к активированный GEFs. GEFs осаждаются из клеточных лизатов, обнаруженные западными блоттинга и количественно денситометрии.
Abstract
Белки семейства Rho малого GTPases являются центральными регуляторами цитоскелета, и контролировать большое количество разнообразных клеточных процессов, в том числе миграции клеток, экспрессия генов, прогрессию клеточного цикла и клеточной адгезии 1. Ро белки молекулярных переключателей, которые принимают активное участие в GTP-связанными и неактивны в ВВП связанном состоянии. Их активация опосредуется семьи Гуанин нуклеотидов бирже фактор (ГЭФ) белков. Ро-GEFs составляют большую семью, с перекрытием особенности 2. Несмотря на значительный прогресс был достигнут в выявлении GEFs активируются определенные сигналы, есть еще много вопросов, остающихся в отношении конкретных путей регулирования этих белков. Число Ро-GEFs превышает 70, и каждая клетка выражает более одного ГЭФ белка. Кроме того, многие из этих белков не только активировать Rho, но и других членов семьи, что способствует дальнейшему сложности регуляторных сетей. Важно отметить, что исследованиеКак GEFs регулируются требует метод следовать активного пула отдельных GEFs в клетках активируются различные стимулы. Здесь мы предлагаем шаг за шагом протокола метод, используемый для определения и количественной оценки имеющихся активных Rho конкретных GEFs с использованием анализа близости осадков. Этот тест был разработан несколько лет назад в лаборатории Burridge 3,4, и мы использовали его в почках трубчатых клеточных линиях 5,6,7. Анализ использует "нуклеотидных бесплатно" мутант RhoA, с высоким сродством к активной GEFs. Мутация (G17A) оказывает белок не в состоянии связать ВВП или ГТФ, и это состояние имитирует промежуточное состояние, связанное с ГЭФ. GST с тегами версии этого мутантного белка выражается и очищается от E. палочки, связанных с глутатион сефарозе бисером и использовали для осаждения активного GEFs из лизатов необработанных и стимулированных клеток. Как и большинство GEFs активируется через посттрансляционной модификации или освобождения от тормозных креплений, их активное состояниесохраняется в клеточных лизатов, и они могут быть обнаружены с помощью этого анализа 8. Захваченные белки могут быть проверены на наличие известных GEFs путем выявления специфических антител с использованием западных промокательной или проанализированы масс-спектрометрии для идентификации неизвестных GEFs активируются определенные стимулы.
Protocol
1. Трансформация E. палочка с pGEX-RhoA (G17A) Construct
- Подготовить LB-агар, растворяя 2,5 LB г и 1,5 г Агар в 100 мл дН 2 O. Автоклав и прохладный, по оценкам, 50-55 ° C, которые, как правило, когда колбы могут быть проведены комфортно.
- Подготовить ампициллина (Amp) акции путем растворения 50 мг / мл в дН 2 O. Шприц фильтр и заморозить неиспользованные порции. Добавить 100 мкл акции А (конечная концентрация 50 мкг / мл) в LB-агар с 1,1. Swirl смешать и вылить в 10 см бактериальные блюд (15-20 мл / блюдо). Позвольте ему укрепить (15-30 мин.) И хранения неиспользованных плит инвертируется при 4 ° С в течение 2-3 недель.
- Для преобразования Е. Coli, быстро таять аликвоту DH5α компетентных клеток в ледяной бане. Добавить 1 мкл pGEXRhoA (G17A) ДНК разводят до 25-50 нг / мкл. Флик трубки перемешать и инкубировать на льду в течение 30 минут. Тепловой удар при 42 ° С в течение 45 секунд и места назад на льду в течение 2 минут. Добавить 900-му; Л SOC среднего и расти в течение одного часа при температуре 37 ° C при встряхивании.
- Распространение 50-100 мкл трансформированных бактерий на LB-агар-Amp пластины с использованием изогнутого стерильной пипеткой Пастера. Инкубируйте планшет правой стороне в 37 ° C инкубаторе в течение 5 минут, затем перевернуть и растут быстро.
- Одной колонии будут выбраны из пластины для подготовки GST с метками белка (шаг 2.1). Для использования в будущем, упаковка и хранение плит инвертируется при 4 ° С в течение 3 недель. Кроме того, бактериальные акции могут быть готовы к более длительному хранению ростом отдельных колоний в 2 мл стерильного LB-Amp ночи при 37 ° C при встряхивании. Смешайте аликвоту стерильной 80% глицерина в соотношении 1:1 и заморозить при температуре -80 ° C.
2. Подготовка GST-RhoA (G17A) Бисер
- Подготовить LB, добавив 25 г LB до 1 л дН 2 0 и автоклавирования. Когда остынет, добавить 50 мкл Amp со склада до 50 мл LB (50 мкг / мл конечной концентрации). Инокулировать с хорошо изолированными коллегпоказать только трансформированных бактерий и расти в течение ночи при 37 ° С при перемешивании. Когда на полную плотность (OD 600> 1.0) разбавляют 450 мл LB-Amp и расти в течение еще 30 минут при температуре 37 ° C.
- Подготовьте 100 мМ маточного раствора изопропилового BD-thiogalactopyranoside (IPTG) путем растворения 0,238 г в 10 мл дН 2 O. Хранить в аликвоты при -20 ° C. Вызвать бактерии производить белок Rho путем добавления 500 мкл 100 мМ ИПТГ до 500 мл культуры (до конечной концентрации 100 мкМ). Уменьшить температуру до 22-24 ° С и расти в течение ~ 16 часов час.
- Спиновая культуры на 3600 г в течение 10 минут при 4 ° C. При необходимости, 500 мл культуры могут быть разделены на 50 мл пробирки для центрифугирования. Замораживание гранул (ы), по крайней мере 1 час (а лучше на ночь) при температуре -80 ° C.
- Подготовить 200 мл лизис буфера, содержащего 20 мМ HEPES (0,95 г) / рН 7,5, 150 мМ NaCl (1,75 г), 5 мМ MgCl 2 (0,203 г), 1% TX-100 (2 мл). Подготовить растворы 1М DTT (1,542 г в 10 мл дН 2 O) И 100 мм PMSF (0,174 г/10 мл этанола). Для подготовки + лизис буфера, дополнение 10 мл 1 мМ DTT (10 мкл акций) и 1 мМ PMSF (100 мкл акций) и один полный мини ингибитор протеазы таблетки.
- Работа на лед, добавляют 10 мл лизирующего буфера + для пеллет из шага 2.3. Ресуспендируйте тщательно, осторожно встряхивая и пипетки. Избегать образования пены. Разрушать ультразвуком на льду в течение 1 минуты при установке 4 с 50% импульсов. Вращайте ультразвуком лизата на 15000-20000 г в течение 15 минут при температуре 4 ° С, и удалить уточнил разрушать ультразвуком (супернатант) в стерильных ограничен 15 мл трубку.
- Подготовка сефарозы глутатион, мягко смешивание оригинальных пробирку, содержащую 75% суспензии и мкл передачи 335 в 15 мл трубку. Используйте широкий диаметр кончика пипетки бисера. Добавьте 10 мл холодного PBS, и спина 500 г в течение 5 минут при 4 ° C. Удалить супернатант, добавить 1 мл лизис буфера + в бисер и крутиться, как и для предыдущей стирки. Удалите супернатант и добавить + лизис буфера, чтобы 50% раствора.
- Добавить 250 мкл equilibrated шарик суспензии супернатант из шага 2.5. Поворот на 4 ° C в течение 45 минут.
- Подготовить 500 мл HBS, содержащем 20 мМ HEPES (2,38 г) / рН 7,5, 150 мМ NaCl (4,38 г) в дН 2 O. Подготовить растворы 1М MgCl 2 (0,952 г в 10 мл дН 2 O) и 1М DTT (1,542 г в 10 мл дН 2 O). Для подготовки HBS +, дополнение 100 мл непосредственно перед употреблением в 5 мМ MgCl 2 (50 мкл со склада) и 1 мМ DTT (100 мкл со склада).
- Вращайте бусы из шагом 2,7 при 500 г в течение 5 минут при 4 ° C. Удалите супернатант и мыть бисером 2x 10 мл + буфера для лизиса, и 2 раза по 10 мл HBS +. После последней промывки, чтобы 50% суспензии ресуспендированием бусины в HBS + дополнена BD BaculoGold ингибитор протеазы (20 мкл 50x BD BaculoGold / мл).
- Развести 10 мкл окончательной подготовки бусин с 2 Laemmli образец буфера, содержащего β-меркаптоэтанола. Сделать бычьего сывороточного альбумина (БСА) стандартов. Используйте 2 мг / мл акций (0,02 г BSA в 10 мл дН 2 O). Смешать 10 мкл акции с 10 мкл Laemmli (20 мкг финал), 5 мкл акции с 5 мкл дН 2 O и 10 мкл Laemmli (10 мкг окончательный) и 2,5 мкл акции с 7,5 мкл дН 2 O и 10 мкл Laemmli (5 мкг финал). Варить все образцы (5 мин). Вращайте шарик образца и запуска супернатант стандартов BSA и маркеры молекулярного веса на 10% SDS-полиакриламидном геле.
- Подготовка Comassie синевы (0,1 г в 10 мл уксусной кислоты, 40 мл метанола и 50 мл дН 2 O) и решение destain (500 мл дН 2 O, 400 мл метанола и 100 мл уксусной кислоты). Хранить при комнатной температуре. Пятно гель в течение 20-30 минут, удалить краситель (она может быть использована несколько раз) и промыть destain решение в два раза. Продолжайте destain с нежным встряхиванием в течение нескольких часов, пока полосы отчетливо видны.
- Оценка концентрации GST-RhoA (G17A) в сочетании с валиками BSA стандарты в качестве эталона (рис. 2). Aliquoт равном объеме из бисера, содержащей ~ 10-15 мкг белка в 1,5 мл микро пробирки. Магазин бусин на 4 ° C использовать в течение дня. Замораживание при -80 ° C в HBS + / глицерина в соотношении 3:1 к использованию в течение нескольких дней.
3. ГЭФ Pulldown Анализ нуклеотидных с без RhoA (G17A) Бисер
- Рост клеток в 10 см блюда слияния. Сыворотка лишить по крайней мере, 3 часа и лечения по мере необходимости.
- Подготовить лизис буфера +, как в шаге 2.4. Подготовить достаточное лизис буфера на 700 мкл / блюдо плюс дополнительные суммы, чтобы обеспечить пипетки ошибок. Добавить ингибиторы протеазы непосредственно перед употреблением.
- Работа на лед, снимите питательной среде из блюд и промыть ледяной HBS. Удалите все HBS и добавляют 700 мкл буфера для лизиса + к каждому блюду. Swirl пластины, чтобы охватить все районы, очистить и собрать лизатов на пронумерованные пробирки на 1,5 мл. Вращаются со скоростью 15000 г в течение 1 мин при 4 ° C. Супернатант будет использоваться для анализа.
- Если ваш мобильный номер эквивалентно во всехпосуда проходит проверку, вы можете пропустить делать белок анализа, и переходите к шагу 3.5. В противном случае измерения концентрации белка каждого супернатанта использования Bio-Rad быстрый анализ белков и уравнять супернатант для объема и концентрации. Количество общего белка зависит от типа клеток использовали (как правило, 1-1,5 мг белка на LLC-PK1 клеток).
- Удалить 30 мкл каждого супернатанта и смешать с 30 мкл 2x снижения Laemmli образец буфера, кипятят и отложите на шаг 3.7. Добавить оставшиеся супернатанты на аликвоты GST-RhoA (G17A) бусы из шагом 2.12. Поворот на 45 минут при 4 ° C.
- Спиновая четки на 6800 г в течение 10 секунд при температуре 4 ° C. Удалите супернатант и промыть 3 раза с бисером лизис буфера, вращается так же, как между стирок. Полное удаление последней промывки с использованием 1 мл шприц оснащен 30-игла G и добавить 20 мкл 2x снижения Laemmli образец буфера. Кипятить 5 мин. Спиновая в гранулах бисером и либо запустить сразу супернатант (предпочтительно) или сохранить егоТ-80 ° C для последующего анализа.
- Выполните 20 мкл общего лизатов клеток и все осажденные образцы белка на соответствующий процент SDS-полиакриламидном геле для размера ГЭФ, которую вы изучаете. Определить свое ГЭФ выбор западных промокательной помощью специфических антител.
4. Представитель Результаты
Часть 1 и 2 протокола описывает подготовку GST-RhoA (G17A) в сочетании с ГШ-сефарозе бисера и его тестирования SDS-PAGE (см. наброски протокол о рис. 1). Типичный окрашенных Кумасси геля показано на рисунке 2. Образца с элюированных белок должен содержать одну полосу примерно 50 кДа (рис. 2, переулок, 6). Концентрация белка можно оценить, используя образцы BSA ссылки. В примере на рис 2, концентрация RhoA (G17A) оценивается в 15 μg/10 мкл. Таким образом, аликвоты 10 мкл / трубы были подготовлены. Типичный выход В наших руках есть 15-20 мкг белка от 10 мл бактериального лизиса. Часть 3 описывает протокол анализа близости осадков (см. обзор на рис 1). Успешный анализ ГЭФ обнаружения активации фактора обмен ГЭФ-H1 показано на рисунке 3. RhoA (G17A) белка захватили некоторые ГЭФ-H1 с контролем (без лечения) клеточных лизатов, предполагая, что ГЭФ-H1 имеет базальную активность. Однако количество осаждения увеличивается в клетках, обработанных воспалительных цитокинов некроза опухоли α-фактора (TNF-α), что согласуется с идеей, что TNF-α активирует ГЭФ-H1 5,7. Важно отметить, что общая лизатов клетки показывают одинаковое количество ГЭФ-H1 в контроле и рассматривать пример, предполагая, что лечение не изменяет ГЭФ-H1 уровней и вход, используемый в тесте равны.
Рисунок 1. Обзор протокола.
Рисунок 2. Представителю результате бусинка протокол подготовки. Гель окрашивали Кумасси успешной GST-RhoA (G17A) подготовка шарик показано на рисунке. Бисер образцов и стандартов BSA белки были разделены SDS-PAGE с использованием 10% акриламида гель. Чтобы проверить, бисером, 10 мкл окончательного шарик суспензии, содержащей GST-RhoA (G17A) разводят в соотношении 1:1 снижения Laemmli буфера образца и кипятят в течение 5 минут. Шарики были выделены кратко и супернатант загружены на геле. Следующие примеры были загружены: Участок 1: маркер молекулярного веса (MW) (FroggaBio BLUeye prestained белка лестницы); дорожки 2-4: 5, 10 и 20 мкг бычьего сывороточного альбумина (БСА), переулок 5 пустым; переулок, 6: 10 мкл свежеприготовленного RhoA (G17A) бусы. После отделения завершен, гель окрашивали Кумасси синий, а затем обесцвечивают выявить белки. Молекулярный вес GST-RhoA (G17A) белков примерно 50 кДа и работает около уровня 48 кДа маркер. Концентрация GST-Rho белка в данном образце, по оценкам, около 15 μg/10 мкл суспензии.
Рисунок 3. Представитель ГЭФ активации анализ показывает TNF-α-индуцированной активации ГЭФ-H1. Сливной LLC-PK1 клетки обрабатывали 10 нг / мл TNF-α в течение 5 минут. После обработки клетки лизировали и активного GEFs были получены с помощью GST-RhoA (G17A) связаны бисера. Наличие ГЭФ-H1 в осажденный белков (верхняя пятно) и общего клеточного лизата образцов (нижняя пятно) был обнаружен методом Вестерн-блоттинга с анти-ГЭФ-H1 антитела (Cell Signaling). Обратите внимание на увеличение количества осажденного ГЭФ-H1 на ФНО-α обращении по сравнению с необработанными клетками по сравнению с эквивалентным входами, что указывает на успешный результат.
3932/3932fig4.jpg "/>
Рисунок 4. "Плохой результат". Хотя анализ ГЭФ выпадающего показано здесь в результате некоторых ГЭФ-H1 захвачен бусы, количество осаждается из управления и TNF-α-обработанных клеток одинаковы. Таким образом, TNF-α, ноу активатор ГЭФ-H1 в данном случае не вызывает активацию. В данном эксперименте последующего устранения неисправностей предположил, что TNF-α использовались не достаточно свежим и, возможно, деградируют.
Discussion
Метод, представленные здесь, только нерадиоактивных активации тест для GEFs, которые могут следовать активного пула GEFs в клетках. Анализ похож на осадки анализов для следующей активации малых ГТФаз а также GEFs против Rac и Cdc42. Эти тесты используются различные GST-меченных белков и имеют незначительные отличия от описанной здесь, однако основные шаги, то же самое. Таким образом, этот протокол можно легко адаптировать для других малых ГТФ и анализы ГЭФ активации.
Представленный анализ ГЭФ был недавно модифицирован для приложений для ядерной фракции 9,10. С последующими изменениями, тестирование ГЭФ активации в других субклеточных отделения также может быть возможным.
Мы используем представлен метод для изучения активации GEFs в эпителиальных клеточных линий 5,6,7. С некоторой оптимизации этого анализа должны быть достаточными для обнаружения GEFs любой клеточной линии. Когда adaptiнг к определенному типу клетки, найти оптимальное количество клеток, объем лизис буфера, а метод обнаружения для ГЭФ для тестирования (хороший антител для западных промокательной важно). Для первоначальной настройки анализа целесообразно использовать стимул, который, как известно, активировать ГЭФ интерес. При использовании неизвестные стимулы, всегда использовать положительный контроль чтобы убедиться, что тест работает. Этот анализ может быть использован для обнаружения активации известно GEFs западными блоттинга. Тем не менее, это также адекватный для выявления неизвестных GEFs. Для этого, захваченные GEFs от управления и стимулировать пробы должны быть проанализированы на Кумасси окрашенного геля. Группы, которые появляются только при вынужденном образцы могут содержать активированный GEFs и могут быть отправлены для идентификации масс-спектрометрии (например, 5).
Наконец, предупреждение. Анализ основан на предположении, что посттрансляционной модификации оказание GEFs активных сохраняются после лизиса клеток. В самом деле, это, несомненно, является приблизительносебе в течение нескольких GEFs, и с момента его учреждения, этого анализа были использованы различные группы для выявления активации различных GEFs, в том числе ГЭФ-H1, p115RhoGEF и XPLN (например, 5,11,12,13). Сохранение в активное состояние, однако, не может произойти в случае всех GEFs и, следовательно, можно предположить, что этот анализ не будет работать для всех GEFs. Следует также отметить, что многие GEFs оказывать активность по отношению к более чем одной маленькой GTPases. Таким образом, когда конкретные ГЭФ изучается, рекомендуется дополнить этот анализ с ГЭФ осадков анализов для других малых ГТФаз, а также функциональных исследований по изучению RhoA, Rac1 и Cdc42.
Критические шаги в протоколе:
Колонии бактерий превращаются должны быть получены из свежего, должным образом подготовленные пластины для обеспечения адекватной выбор усилителей, хороший результат и выход. Преобразование условий для компетентных клеток, полученных из других источников, могут различаться и должны быть проведены консультации. Все шаги протокола белкового препарата (с шагом 2.3) и анализа (с шагом 3.2) следует проводить при температуре 4 ° C с охлаждением решений и центрифуг.
Бактериальные лизис (шаг 2.5) должно быть тщательным и полным для получения однородной суспензии. Когда лизировать бактерии, вихревые и пипетировать лизат поочередно, сохраняя его на 4 ° C и обеспечивает ультразвука происходит на льду для предотвращения денатурации белка. Если вы используете другую модель sonicator, условия, возможно, должны быть скорректированы. Инкубация разрушать ультразвуком с бисером всегда должно быть сделано при 4 ° С на поворотное устройство, чтобы обеспечить достаточное обязательным, и следует проявлять осторожность, чтобы сохранить времени последовательно.
GST-Ро мутантов несколько неустойчивой, выраженных в бактерии, поэтому лучше пользоваться готовыми бисером сразу или в течение нескольких дней.
Осадков анализа (Часть 3) время и чувствительны к температуре,активное GEFs можно легко потерять из ячейки лизат, поэтому шаги должны быть выполнены как можно быстрее.
Следующий раздел содержит некоторые неисправностей советы.
Нет или очень низкое количество мутантных Rho белка в конечном шарик подготовки: Это может быть вызвано неэффективной индукции, недостаточно лизис бактерий, или потеря белка в процессе приготовления или хранения. Для устранения некоторых из этих возможностей, образцы бактерий могут быть проанализированы до и после индукции. Если есть плохой индукции белка повторить этот процесс с помощью колонию из свежих прожилками плита или повторно преобразованы компетентных клеток. Различные концентрации и индукции IPTG раз должны быть проверены. Если лизис недостаточно (например, белок остается в осадке, а супернатант) различные соли и моющих средств концентрация в буфере для лизиса может быть судим. Альтернативные раз ультразвука иНастройки должны быть рассмотрены и образцов до и после обработки ультразвуком можно проверить с помощью микроскопа, чтобы определить эффективность лизиса.
Не осаждали ГЭФ, хотя GST-белок присутствует в бисер: Это может быть связано с техническими вопросами при анализе осадков, или реальное отсутствие активации изучаемого ГЭФ помощью раздражитель. Всегда используйте известный стимул в качестве положительного контроля, чтобы убедиться, что тест работает. Используйте подготовленную бисер в течение нескольких дней. Если осадков анализ фиксирует обнаружить количество ГЭФ учился в любых условиях, убедитесь, что ГЭФ является настоящим и хорошо прощупывается в супернатант после центрифугирования, который будет использоваться для анализа (шаг 3.3). Убедитесь, что все буферы и ингибиторы протеазы являются новыми, а также осуществлять все шаги на льду как можно быстрее. Увеличение количества входных белка (например, с помощью лизатов от 2 пластины / образец). Если анализ показывает, осадков базальной скачкоtation вашего ГЭФ, но разница видна между контролем и стимулировать образцов (рис. 4), начните диагностику с проверки того, что применяемые стимулы работает с использованием других известных эффектов (например, обнаружение активации других сигнальных путей). Рассмотрим изменения условий лечения и / или концентрации. Положитесь на литературные данные отчетности, как ваш стимул активирует Rho или другой сигнализации, чтобы предсказать, как будет время и концентрации. При оптимизации времени обработки, используйте короткие и длинные периоды времени, как ГЭФ активации может быть лучше обнаружить на момент времени до и обнаружить активацию Rho. Наконец, тот же раздражитель может привести к различной степени активации в связи с изменением в ячейке реакции вызваны пассаж, сотовые слияния и т.д.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа финансируется Канадским институтом медицинских исследований (CIHR) (СС-97 774) и естественным наукам и инженерным исследованиям Совета Канады (NSERC, грант NR: 480619). KS является получателем премии KRESCENT Новый следователь (совместная награда Почечный Фонд Канады, Канадского общества нефрологии и Канадский институт исследований в области здравоохранения) и раннего премии исследователь из Онтарио Министерство исследований и инноваций. FW поддерживается Шинг стипендию Ли Ка.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pGEX-RhoA(G17A) | Addgene | Will be available soon | Generated in the lab of Dr. Keith Burridge (University of North Carolina) (ref 3) |
| DH5α | Invitrogen | 18258-012 | Store -80°C |
| SOC medium | BioShop Canada | SOC001.10 | |
| LB | BioShop Canada | LBL407.1 | Keep sterile |
| Glycerol | BioShop Canada | GLY002.1 | |
| Ampicillin | BioShop Canada | AMP201.25 | Store stock at -20°C |
| Agar | BioShop Canada | AGR001.500 | |
| IPTG ( Isopropyl B-D-thiogalacto-pyranoside) | Calbiochem | 420322 | Store stock solution at -20°C |
| Glutathione Sepharose beads | GE Healthcare | 17-0756-01 | |
| PBS 10x | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| NaCl | BioShop Canada | SOD001.10 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M-9272 | Add just before use |
| TX-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| DTT | OmniPur, EMD Millipore | 3860 | Add just before use |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P-7626 | Add just before use |
| Protease Inhibitor 50x | BD Biosciences | 51-21426Z | Add just before use |
| Complete Mini, EDTA-free 10x | Roche Group | 11 836 170 001 | Add just before use |
| Laemmli Sample Buffer 2x | Bio-Rad | 161-0737 | |
| β-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7154 | Add just before use |
| Coomassie Brilliant Blue | Bio-Rad | R-250 | |
| Acetic Acid | CALEDON | 1000-1 | |
| Methanol | CALEDON | 6701-7 | |
| Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0114 | |
| BLUeye ladder | FroggaBio | PM008-0500 | |
| Table 1. Reagents used | |||
| RC-5B centrifuge | Sorvall, Thermo Scientific | SS-34 Rotor | Use at 4°C |
| Centrifuge | Sorvall, Thermo Scientific | ST-16R | Use at 4°C |
| Micro centrifuge | Eppendorf | 5417R | Use at 4°C |
| Bacterial shaker | INFORS HT Ecotron | AG CH-1403 Bottmingen | Use at 37°C or at 22°C |
| Sonicator | Branson | Sonifier-450 | Use at RT |
| Rotator | Glas-Col | 099A CR4012 | Use at 4°C |
| Table 2. Specific equipments used | |||
References
- Jaffe, A. B., Hall, A. R. ho GTPases: biochemistry and biology. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 247-269 (2005).
- Rossman, K. L., Der, C. J., Sondek, J. GEF means go: turning on RHO GTPases with guanine nucleotide-exchange factors. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 167-180 (2005).
- Arthur, W. T., Ellerbroek, S. M., Der, C. J., Burridge, K., Wennerberg, K. XPLN, a guanine nucleotide exchange factor for RhoA and RhoB, but not RhoC. J. Biol. Chem. 277, 42964-42972 (2002).
- Garcia-Mata, R. Analysis of activated GAPs and GEFs in cell lysates. Methods Enzymol. 406, 425-437 (2006).
- Kakiashvili, E. GEF-H1 Mediates Tumor Necrosis Factor-{alpha}-induced Rho Activation and Myosin Phosphorylation: role in the regulation of tubular paracellular permeability. J. Biol. Chem. 284, 11454-11466 (2009).
- Waheed, F. Extracellular signal regulated kinase and GEF-H1 mediate depolarization-induced Rho activation and paracellular permeability increase. Am. J. Physiol. Cell Physiol. , (2010).
- Kakiashvili, E. The epidermal growth factor receptor mediates tumor necrosis factor-alpha-induced activation of the ERK/GEF-H1/RhoA pathway in tubular epithelium. J. Biol. Chem. 286, 9268-9279 (2011).
- Garcia-Mata, R., Burridge, K. Catching a GEF by its tail. Trends Cell Biol. 17, 36-43 (2007).
- Dubash, A. D. The small GTPase RhoA localizes to the nucleus and is activated by Net1 and DNA damage signals. PLoS One. 6, e17380-e17380 (2011).
- Guilluy, G., Dubash, A. D., García-Mata, R. Analysis of RhoA and Rho GEF activity in whole cells and the cell nucleus. Nature Protocols. , (2011).
- Guilluy, C., Swaminathan, V., Garcia-Mata, R., O'Brien, E. T., Superfine, R., Burridge, K. The Rho GEFs LARG and GEF-H1 regulate the mechanical response to force on integrins. Nature Cell Biology. 13, 722-727 (2011).
- Dubash, A. D., Wennerberg, K., Garcia-Mata, R., Menold, M. M., Arthur, W. T., Burridge, K. A novel role for Lsc/p115 RhoGEF and LARG in regulating RhoA activity downstream of adhesion to fibronectin. J. Cell Sci. 120, 3989-3998 (2007).
- Arthur, W. T., Ellerbroek, S. M., Der, C. J., Burridge, K., Wennerberg, K. XPLN, a guanine nucleotide exchange factor for RhoA and RhoB, but not RhoC. J. Biol. Chem. 277, 42964-42972 (2002).
