Summary
I denne artikkelen, er en enkel, kvantitativ, væskefase affinitet fangst analysen presentert. Det er en pålitelig teknikk basert på samspillet mellom magnetiske kuler og merkede proteiner (f.eks nanobodies) på den ene siden og affinitet mellom tagget protein og en andre, merket protein (f.eks poliovirus) på den andre.
Abstract
I denne artikkelen, er en enkel, kvantitativ, væskefase affinitet fangst analysen presentert. Forutsatt at ett protein kan merkes og annet protein merket, kan denne metoden skal gjennomføres for undersøkelse av protein-protein interaksjoner. Den er basert på en hånd på anerkjennelse av den tagget protein ved kobolt belagt magnetiske perler og på den andre hånden på samspillet mellom tagget protein og en andre bestemt protein som er merket. Først blir merket og kodet proteiner blandet og inkubert ved romtemperatur. De magnetiske perler, som gjenkjenner koden, er lagt til og det bundne fraksjonen av merket protein er atskilt fra den ubundne fraksjonen bruke magneter. Mengden av merket protein som fanges kan bestemmes på en indirekte måte ved å måle signalet til merket protein forble i den ubundne fraksjonen. Den beskrives væskefase affinitet analysen er svært nyttig når konformasjonsforandringer konvertering sensitive proteiner er assayed. Utvikling og anvendelse av analysen er vist for samspillet mellom poliovirus og poliovirus gjenkjenne nanobodies 1. Siden poliovirus er følsom for konformasjonsforandringer konvertering 2 når festet til en fast overflate (upubliserte resultater), er bruken av ELISA begrenset og en flytende fase system bør derfor foretrekkes. Et eksempel på en flytende fase system ofte brukt i polioresearch 3,4 er mikro protein A-immunoprecipitation test 5. Selv om denne testen har vist sin anvendbarhet, krever det en Fc-struktur, som er fraværende i de nanobodies 6,7. Men som en annen mulighet, kan disse interessante og stabil single-domene antistoffer 8 enkelt konstruert med ulike koder. Den brukte (Hans) 6-tag viser affinitet for Bivalente ioner som nikkel eller kobolt, som kan på sin side lett belegg på magnetiske kuler. Vi har derfor utviklet denne enkle kvantitativeaffinitet fangst analysen basert på kobolt belagt magnetiske kuler. Poliovirus var merket med 35 S for å aktivere uhindret samspill med nanobodies og gjøre en kvantitativ deteksjon mulig. Metoden er enkel å utføre og kan etableres med en lav kostnad, som er videre støttet av muligheten til å effektivt gjenoppfriske de magnetiske perler.
Protocol
Prinsippet (A) og en oversikt over metoden (B) er avbildet i Figur 1.
1. Klargjøring av buffer
- Forbered Binding / vaskebuffer ved oppløsning av natrium dihydrogen fosfat (50 mm) og natriumklorid (300 mm) i vann og justere pH til 8,0. I tillegg legger Tween 20 (0,01% (m / v) endelig konsentrasjon), metionin (2% (m / v) endelig konsentrasjon) og albumin (0,1% (m / v) endelig konsentrasjon) og juster til ønsket volum.
2. Utarbeidelse av magnetiske kuler
Forbered de magnetiske perler i henhold til bruksanvisningen. Kort:
- Resuspender de magnetiske kuler ved hjelp av en virvel.
- Transfer, for hver prøve, 10 mL av resuspendert magnetiske kuler (40 mg / ml) i en tube.
- Samle de magnetiske kuler ved hjelp av en magnet, før supernatanten er klar (+ / - 30 sek) og fjern supernatanten forsiktig.
- Vaskmagnetiske kuler to ganger: Resuspender perlene i 150 mL av Binding / vaskebuffer. Migrer de magnetiske perler til den ene siden av røret ved hjelp av en magnet inntil supernatanten er klar, og fjern forsiktig supernatanten.
- Bruk 40 mL av Binding / vaskebuffer, for hver prøve, for å resuspendere perlene (10 mg / ml).
3. Affinity Capture Assay
Merk: For å måle (kosmiske) bakgrunn radioaktivitet (0% radioaktivitet), er ikke radiomerket virus lagt til en kontroll prøve en. I stedet er det samme volum Binding / vaskebuffer lagt.
Merk: 100% radioaktivitet er definert ved en kontroll prøve 2 som alle komponentene er lagt unntatt nanobody. I stedet er det samme volum Binding / vaskebuffer lagt.
- Bring 2000 cpm av 35 S merket (β-stråling) poliovirus Sabin stamme type 1 9, fortynnet med binding / vaskebuffer til 80 mL inn en 96-brønns microtiter plate.
- Legg 10 & mu, l nanobody fortynning til brønnene.
- Bland i ca 10 sekunder med en shaker.
- La prøvene å ruge i 1 time ved romtemperatur.
- Legg 40 mL av vasket magnetiske perler suspensjon og inkuberes i 10 minutter ved romtemperatur, under kontinuerlig risting.
- Skill perler og supernatanten ved hjelp av en magnet og overføre ryddet supernatanten til et rør.
4. Måling av radioaktivitet
- Overføring 50 mL av supernatanten fra trinn 3,6 til en telling kolbe.
- Legg 3 ml scintillation væske og bland. Mål radioaktivitet i en β-scintillation teller.
5. Resirkulering av perler
- Samle brukt magnetiske perler i et rør og sentrifuger ved 500 xg i 2 minutter eller til en klar supernatant oppnås.
- Fjern supernatanten og resuspender perlene i 6 ml 0,5 M NaOH.
- Overfør suspensjonen til multiple rør og inkuberes i et ultralydbad i 5 minutter.
- Bruk magneter til å samle de magnetiske perler og fjern supernatanten.
- Tilsett 1 ml 2% SDS-løsning til hvert rør og resuspender hjelp av en virvel. Kok i 5 minutter.
- Samle perler og fjern supernatanten. Resuspender perlene i 1 ml 0,2 M EDTA (pH = 7).
- Inkuber rørene i et ultralydbad i 5 minutter og igjen, fjern supernatanten.
- Tilsett 1 ml vann til hvert rør og resuspender perlene. Samle perler og fjern supernatanten. Gjenta dette vasketrinn to ganger.
- Fjern supernatanten og resuspender perlene i 1 ml 10 mM CoCl 2 løsning. Sett på en shaker i 10 minutter.
- Fjern supernatanten ved hjelp av en magnet for å samle perlene og resuspender i 1 ml Binding / vaskebuffer.
- Fjern supernatanten og vask perlene to ganger med 1 ml 20% (v / v) etanol
- Resuspender perlene i sin opprinnelige volum på 20% (v / v) ethanol å få regenerert perler i en konsentrasjon på 40 mg / ml.
6. Tolkning av resultatene
- Kontrollutvalget en, der ingen radiomerket viruset ble lagt til, vil bli brukt til å korrigere for bakgrunnen radioaktivitet og stille 0% radioaktivitet verdi. Kontrollutvalget 2, som ikke inneholder nanobody og hvor dermed alle radiomerket viruset forblir i supernatanten, angis som 100% radioaktivitet verdi.
- Andelen av radioaktivitet i supernatanten (= en%) er et mål på den totale nedbør (= 100 - en%) av radiomerket viruset ved nanobody.
7. Representative Resultater
Representative resultater for denne affinitet fangst analysen er vist i figur 2, 3 og 4. I figur 2 er affinitet PVSS38C, en nanobody spesifikk for poliovirus, vist. Affinitet PVSS38C ble testet for tre ulike antigener i poliovirus: Native-antigen (N-antigen), Oppvarmet-antigen (H-antigen) og 14S subenheter. N-antigen er intakt virus som er smittefarlig. Når viruset er oppvarmet (20 minutter ved 56 ° C) eller festet til en fast overflate (upubliserte resultater), conformation av kapsid endringene, noe som resulterer i en (delvis) tap av de virale RNA og kapsid protein VP4, og tom capsids er dannet som deretter kalles H-antigener. 14S subenheter er montering mellomprodukter. Disse antigenene er anerkjent av ulike sett av antistoffer etter immunisering 10 og har derfor ulike epitoper og antigene sites. I figuren andelen av radioaktivitet funnet i supernatanten er representert som en funksjon av konsentrasjonen av nanobody. Det kan sees at radioaktiviteten i supernatanten av prøvene inneholder radiomerket 14S subenheter avtar med økende konsentrasjoner av nanobody PVSS38C. Dette kan oversettes som en økning i mengden av poliovirus 14S subenheter conkoblet til nanobody PVSS38C og indirekte til magnetiske kuler. Den fange titer (= den konsentrasjonen av nanobody nødvendig å fange 50% av radiomerket virus) kan grafisk beregnes som 0,099 nM. Ingen affinitet PVSS38C for N-antigene og H-antigen form av poliovirus er observert. Fra disse dataene det tolkes som PVSS38C er i samspill med en epitop som utelukkende er til stede på 14S subenheten og ikke på de to andre antigene former for poliovirus.
For å demonstrere at tapet av radioaktivitet fra supernatanten er bare på grunn av den spesifikke affinitet til nanobody mot sine antigener, ble den samme analysen utført med Nb1, til en nanobody generert mot lrpB transcriptional regulator av Sulfolobus sulfataricus og kjent har ingen interaksjon med noen poliovirus antigen. Resultatet av denne analysen er vist i figur 3. All radiomerket virus forblir i supernatants viser at det ikke er reaktivitetenNb1 mot de tre antigene former for poliovirus.
Reproduserbarhet av resultatene ble testet ved å gjenta forsøket for totalt åtte ganger for en gitt nanobody (dvs. PVSP29F) på ulike dager og av forskjellige personer. Resultatene er vist i figur 4. Middelverdien av prosentandel radioaktivitet i supernatanten ble beregnet for hver nanobody konsentrasjon og er representert i korrespondanse med sin standardavvik.
Figur 1. En oversikt over prinsippet (A) og metoden (B) til analysen. A. Hans-merket nanobodies som spesifikt gjenkjenner en viss poliovirus antigen vil kunne samhandle med kobolt-belagte magnetiske kuler og vil fremskynde den radioaktivt merket viruset. B. Hans-merket nanobodies legges til radioaktivt merket poliovirus og inkubert. Kobolt-belagte magnetiske perler erlagt og magnetisk separasjon av bundne / ubundne antigen utføres. Radioaktiviteten av supernatanten måles og mengde fanges antigen kan utledes.
Figur 2. Magnetic perler affinitet fangst av ulike poliovirus antigener ved nanobody PVSS38C. Andelen av radioaktivitet funnet i supernatanten er representert som en funksjon av konsentrasjonen av PVSS38C. For 14S en konsentrasjon-respons-forholdet kan bli funnet, viser samspillet av PVSS38C med en epitop utelukkende til stede på 14S. Ingen signifikant interaksjon med N-eller H-antigen kan oppdages, selv om en ubetydelig ikke-spesifikk fange ved svært høye konsentrasjoner blir lagt merke til.
Figur 3. Magnetic perler affinitet fangst av ulike poliovirus antigener ved nanobody Nb1 figur 2 er derfor bare på grunn av spesielle affinitet til nanobody mot sine antigener.
Figur 4. Reproduserbarheten til analysen. Middelverdien av prosentandel radioaktivitet i supernatanten er representert som en funksjon av konsentrasjonen av nanobody. Forsøket ble gjentatt åtte ganger på ulike dager og av forskjellige personer. Standardavviket er representert som vertikale stolper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I protokollen er radioaktiviteten av antigen samhandle med nanobody definert som tap av radiomerket virus fra supernatanten. Derfor mengden av utfelt radioaktivitet (= 100 - en%) (bundet til de magnetiske kuler) kan estimeres på en indirekte måte ved radioaktivitet i supernatanten (= en%). På den annen side er det også mulig å måle radioaktivitet av utfelt bundet brøkdel av antigen på en direkte måte ved eluting de immunocomplexes fra magnetiske kuler med 500 mm imidazole. Det ble tidligere vist 11 at det er en perfekt match mellom den totale mengden av radioaktivitet og summen av radioaktivitet funnet i supernatanten og pellet fraksjoner. Det er derfor akseptabel og tidsbesparende å måle radioaktivitet i supernatanten. Metoden for eluering av immunocomplexes fra magnetiske kuler er beskrevet av Thys et al., 2011 11.
Apart fra poliovirus, blir andre picornaviruses kjent for å være følsomme for stødig underlag indusert konformasjonsforandringer konvertering, som økonomisk viktig munn-og klovsyke-virus (FMDV) 2. Den endring av form og reduksjon i bindingsaffinitet av proteiner generelt etter binding til plast er beskrevet i litteraturen 12. Den analysen kan derfor brukes til å undersøke samspillet mellom andre proteiner som er følsomme for konformasjonsforandringer endringer, for epitop kartlegging, for å definere mengden av brettet skikkelig proteiner, til skjermen for struktur relaterte urenheter under produksjonsprosesser, for rask screening av batcher under produksjon, kan for rensing av prøvene som er blandinger av nært beslektede proteiner og mange andre programmer bli tenkt på. Tilgjengeligheten av ulike magnetiske perler med affinitet for ulike koder støtter disse mulighetene. Selv om radioaktive merkelapper ble brukt i disse forsøkene, andre signaler kunneiverksettes for å oppdage og kvantifisere interaksjoner, som fluorescerende fargestoffer 13,14. Mange prøver kan analyseres i løpet av ett eksperiment, og det er mulig å automatisere metoden. De magnetiske kuler brukes i denne analysen kan enkelt gjenbrukes med bare en kokende, stripping og regenerasjon trinn, som gjør dette til en billig metode. Inntil dato, fikk fem av disse regenerering sykluser av perlene ikke påvirke reproduserbarhet av resultatene (data ikke vist).
I tillegg kan det betraktes som en spesifikk metode, siden spesifikke nanobodies brukes som bare anerkjenne deres antigen, som de var i stand til å samhandle annerledes med poliovirus N-og H-antigener og 14S subenheten.
Det kan konkluderes med at dette affinitet fangst analysen ved hjelp av magnetiske kuler er en analyse med et bredt spekter av mulige bruksområder som er pålitelig, enkel, kvantitativ, spesifikk, tidsbesparende og billig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker de ansatte på avdeling for Pharmaceutical bioteknologi og molekylærbiologi og spesielt Monique De Pelsmacker for utarbeidelse av radioaktivt merket viruset. Vi er takknemlige til Ellen Merckx og Hadewych Halewyck for sine interessante bemerkninger og diskusjoner og til Gerrit De Bleeser for hans hjelp i laboratoriet. Dette arbeidet ble finansielt støttet av en OZR tilskudd av Vrije Universiteit Brussel (OZR1807), den Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (G.0168.10N) og Verdens helseorganisasjon (TSA 200 410 791). Lise Schotte er en predoctoral Fellow ved Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dynabeads His-Tag Isolation and Pulldown | Invitrogen | 101.03D | Magnetic beads |
| Optiphase ’HiSafe’ 2 | PerkinElmer, Inc. | 1200 - 436 | Scintillation fluid |
References
- Thys, B., Schotte, L., Muyldermans, S., Wernery, U., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. In vitro antiviral activity of single domain antibody fragments against poliovirus. Antiviral Res. 87, 257-264 (2010).
- Meloen, R. H., Briaire, J. A study of the cross-reacting antigens on the intact foot-and-mouth disease virus and its 12S subunits with antisera against the structural proteins. J. Gen. Virol. 51, 107-116 (1980).
- Vrijsen, R., Rombaut, B., Boeye, A. A simple quantitative protein A micro-immunoprecipitation method: assay of antibodies to the N and H antigens of poliovirus. J. Immunol. Methods. 59, 217-220 (1983).
- Rombaut, B., Jore, J., Boeye, A. A competition immunoprecipitation assay of unlabeled poliovirus antigens. J. Virol. Methods. 48, 73-80 (1994).
- Kessler, S. W. Rapid isolation of antigens from cells with a staphylococcal protein A-antibody adsorbent: parameters of the interaction of antibody-antigen complexes with protein A. J. Immunol. 115, 1617-1624 (1975).
- Hamers-Casterman, C., Atarhouch, T., Muyldermans, S., Robinson, G., Hamers, C., Songa, B. ajyana, Bendahman, E., N,, Hamers, R. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
- Arbabi Ghahroudi, M., Desmyter, A., Wyns, L., Hamers, R., Muyldermans, S. Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies. FEBS Lett. 414, 521-526 (1997).
- Muyldermans, S. Single domain camel antibodies: current status. Rev. Mol. Biotechnol. 74, 277-302 (2001).
- Rombaut, B., Vrijsen, R., Boeye, A.
- Brioen, P., Sijens, R. J., Vrijsen, R., Rombaut, B., Thomas, A. A., Jackers, A., Boeye, A. Hybridoma antibodies to poliovirus N and H antigen. Arch. Virol. 74, 325-330 (1982).
- Thys, B., Saerens, D., Schotte, L., De Bleeser, G., Muyldermans, S., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. A simple quantitative affinity capturing assay of poliovirus antigens and subviral particles by single-domain antibodies using magnetic beads. J. Virol. Methods. 173, 300-305 (2011).
- Wild, D. The Immunoassay Handbook. , Third edition, Elsevier. (2005).
- Kremser, L., Konecsni, T., Blaas, D., Kenndler, E. Fluorescence labeling of human rhinovirus capsid and analysis by capillary electrophoresis. Anal. Chem. 76, 4175-4181 (2004).
- Pelkmans, L., Kartenbeck, J., Helenius, A. Caveolar endocytosis of simian virus 40 reveals a new two-step vesicular-transport pathway to the ER. Nat. Cell Biol. 3, 473-483 (2001).
