Una afinidad líquido fase de captura de ensayo utilizando partículas magnéticas para estudiar la interacción proteína-proteína: el ejemplo de poliomyelits-Nanobodies
Summary
En este artículo, un simple, cuantitativo, la afinidad de la fase líquida ensayo de captura se presenta. Es una técnica fiable basado en la interacción entre partículas magnéticas y las proteínas marcadas (por ejemplo nanocuerpos) en una mano y la afinidad entre la proteína marcados y una segunda proteína, con la etiqueta (por ejemplo, virus de la polio) en el otro.
Abstract
En este artículo, un simple, cuantitativo, la afinidad de la fase líquida ensayo de captura se presenta. Siempre que una proteína puede ser marcados y etiquetados otra proteína, este método puede ser aplicado para la investigación de las interacciones proteína-proteína. Se basa en una mano en el reconocimiento de la proteína marcados por perlas magnéticas recubiertas de cobalto y en la otra mano en la interacción entre la proteína marcados y una segunda proteína específica que se etiqueta. En primer lugar, las proteínas marcadas y etiquetada se mezclan y se incuban a temperatura ambiente. Las perlas magnéticas, que reconocen la etiqueta, se añaden y la fracción unida de proteína marcada se separa de la fracción no unida mediante imanes. La cantidad de proteína marcada que es capturada se puede determinar de una manera indirecta mediante la medición de la señal de la proteína marcada se mantuvo en la fracción no unida. La fase líquida se describe ensayo de afinidad es muy útil cuando las proteínas conformacionales de conversión son sensibles culoAyed. El desarrollo y la aplicación del ensayo se demuestra por la interacción entre poliovirus y poliovirus reconociendo nanocuerpos 1. Dado que el poliovirus es sensible a la conversión conformacional 2 cuando está unido a una superficie sólida (resultados no publicados), el uso de ELISA es limitado y un sistema basado en fase líquida, por tanto, se prefiere. Un ejemplo de un sistema de fase líquida basada utiliza a menudo en polioresearch 3,4 es la proteína de micro-inmunoprecipitación Un ensayo 5. A pesar de que esta prueba ha demostrado su aplicabilidad, se requiere un Fc-estructura, que está ausente en los Nanobodies 6,7. Sin embargo, como otra oportunidad, estos interesantes y estable de un solo dominio anticuerpos 8 puede ser fácilmente diseñado con diferentes etiquetas. El ampliamente utilizado (Su) 6-etiqueta muestra afinidad por los iones bivalentes tales como níquel o cobalto, que puede a su vez, ser fácilmente recubierta por perlas magnéticas. Por lo tanto, desarrolló este cuantitativo simpleensayo de afinidad de captura sobre la base de cobalto perlas magnéticas recubiertas. Poliovirus se marcó con 35 S para permitir una interacción sin obstáculos con los Nanobodies y para hacer una detección cuantitativa factible. El método es fácil de realizar y puede establecerse con un bajo costo, que se ve apoyada por la posibilidad de regenerar eficazmente las perlas magnéticas.
Protocol
Discussion
En el protocolo, la radiactividad de la interacción con el antígeno nanocuerpos se define como la pérdida de virus radiomarcado a partir del sobrenadante. Por lo tanto la cantidad de radiactividad precipitada (= 100 – un%) (unido a las perlas magnéticas) se puede estimar en una forma indirecta por la radioactividad en el sobrenadante (= un%). Por otro lado, también es posible medir la radiactividad de la fracción precipitada la envolvente de antígeno en una forma particular a eluyendo los inmunocomplejos de las p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen al personal del departamento de Biotecnología Farmacéutica y Biología Molecular y sobre todo Pelsmacker Monique De la preparación del virus de la etiqueta radiactivo. Estamos muy agradecidos a Elena de Merckx y Hadewych Halewyck por sus interesantes comentarios y discusiones y Gerrit De Bleeser por su ayuda en el laboratorio. Este trabajo fue apoyado financieramente por un subsidio OZR de la Vrije Universiteit Brussel (OZR1807), el Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (G.0168.10N) y la Organización Mundial de la Salud (TSA 200 410 791). Lise Schotte es un becario predoctoral del Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Dynabeads His-Tag Isolation and Pulldown | Invitrogen | 101.03D | Magnetic beads |
| Optiphase ‘HiSafe’ 2 | Perkin Elmer | 1200 – 436 | Scintillation fluid |
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