Summary
В этой статье, простой, количественный, жидкая фаза близости захвата анализа представлены. Это надежный метод, основанный на взаимодействии магнитных шариков и меченных белков (например, нанотел), с одной стороны, и близость между помеченные белка, а второй, обозначенный белка (например, вирус полиомиелита), с другой.
Abstract
В этой статье, простой, количественный, жидкая фаза близости захвата анализа представлены. При условии, что один белок может быть помечен и другой белок надписью, этот метод может быть реализован для изучения белок-белковых взаимодействий. Она основана, с одной стороны на признание меченых белков кобальта покрытием магнитных шариков, а с другой стороны по взаимодействию помеченные белка, а второй специфического белка, который маркирован. Во-первых, маркировку и меченных белков перемешивают и выдерживают при комнатной температуре. Магнитные шарики, которые признают тегов, добавляются и связанной фракции меченых белков отделяют от несвязанного фракция с помощью магнитов. Количество меченых белков, которые захватили можно определить косвенным образом путем измерения сигналов меченых белков остается в несвязанной фракции. Описанные жидкой фазы близости анализ чрезвычайно полезен, когда конформационные преобразования чувствительные белки задницуАйед. Разработки и применения анализа показано, для взаимодействия между полиовируса и полиовируса признании нанотел 1. С полиовируса чувствительны к конформационным конвертации 2 при подключении к твердой поверхности (неопубликованные результаты), использование ИФА ограничены и жидкой фазы на основе системы должно быть предпочтительным. Например жидкой фазы система часто используется в polioresearch 3,4 является микро белка-иммунопреципитации тест 5. Хотя этот тест доказал свою применимость, он требует Fc-структура, которая отсутствует в нанотел 6,7. Однако, как еще одна возможность, это интересные и стабильные однодоменных антител 8 может быть легко разработаны с различными тегами. Широко используется (Его) 6-тег показывает сродство к двухвалентных ионов, таких как никель или кобальт, который может на свою очередь, легко нанесенные на магнитные шарики. Поэтому мы разработали этот простой количественныйАнализ близость захвата на основе кобальта покрытием магнитных шариков. Полиовирус был помечен 35 S чтобы беспрепятственного взаимодействия с нанотел и сделать количественное определение возможно. Метод прост в исполнении и могут быть установлены с низкой стоимостью, которая также поддерживается возможность эффективно регенерации магнитных шариков.
Protocol
Принцип (А) и обзор метода (б) изображены на рисунке 1.
1. Подготовка буфера
- Подготовить Связывание / Wash буфера путем растворения натрия дигидрофосфат (50 мм) и хлорид натрия (300 ммоль) в воде и доведения рН до 8,0. Кроме того, добавляют твин-20 (0.01% (т / х) конечная концентрация), метионин (2% (т / х) конечная концентрация) и альбумин (0,1% (м / о) конечная концентрация) и приспособиться к необходимого объема.
2. Подготовка магнитных шариков
Подготовка магнитных шариков в соответствии с инструкцией по эксплуатации. Кратко:
- Ресуспендируют магнитных шариков помощью вихря.
- Передача, для каждого образца, 10 мкл ресуспендированного магнитных шариков (40 мг / мл) в трубе.
- Сбор магнитных шариков с помощью магнита, пока не ясно супернатант (+ / - 30 сек) и удалите супернатант тщательно.
- Вымойтемагнитных шариков в два раза: ресуспендирования бусины в 150 мкл связывания / Wash буфера. Миграция магнитные шарики с одной стороны трубки с помощью магнита, пока супернатанте ясно и осторожно удалите супернатант.
- Используйте 40 мкл связывания / Wash буфера для каждого образца, для ресуспендирования бисером (10 мг / мл).
3. Affinity Capture Пробирной
Примечание: Для измерения (космические) фон радиоактивности (0% радиоактивности), не меченые вируса добавляется в контрольном образце 1. Вместо этого, тот же объем связывания / Wash буфер добавляется.
Примечание: 100% радиоактивности определяется 2 контрольных образца, к которому все компоненты добавляются только нанотела. Вместо этого, тот же объем связывания / Wash буфер добавляется.
- Принесите 2000 копий в минуту 35 S помечены (β-излучения) полиовируса Сэбина штамм типа 1, 9, разбавляют связывания / Wash буфера 80 мкл в 96-луночных планшет.
- Добавить 10-мщ л нанотела разведения в лунках.
- Смешать в течение 10 секунд с помощью шейкера.
- Позвольте образцов для инкубации в течение 1 часа при комнатной температуре.
- Добавить 40 мкл промытый магнитном подвесе бисер и инкубировать 10 минут при комнатной температуре, при постоянно дрожать.
- Отделите бисером и супернатант с помощью магнита и передачи очищенного супернатант в трубку.
4. Измерение радиоактивности
- Трансфер 50 мкл надосадочной с шагом 3,6 в подсчете колбу.
- Добавьте 3 мл жидкости сцинтилляционных и перемешать. Измерение радиоактивности в β-сцинтилляционных счетчиков.
5. Утилизация бисера
- Соберите использовать магнитные шарики в трубу и центрифуги в 500 мкг в течение 2 минут или пока не ясно супернатант получается.
- Удалить супернатант и ресуспендируют бусы в 6 мл 0,5 М NaOH.
- Передача подвески multiplэлектронных ламп и инкубировать в ультразвуковой ванне в течение 5 минут.
- Использование магнитов для сбора магнитных шариков и удалите супернатант.
- Добавить 1 мл 2% SDS-решение в каждую пробирку и ресуспендируют помощью вихря. Кипятить в течение 5 минут.
- Собирайте шарики и удалите супернатант. Ресуспендируют бусины в 1 мл 0,2 М ЭДТА (рН = 7).
- Инкубировать пробирки в ультразвуковой ванне в течение 5 минут и еще раз, удалите супернатант.
- Добавить 1 мл воды на каждую трубу и ресуспендируют бисера. Собирайте шарики и удалите супернатант. Повторите этот шаг мыть два раза.
- Удалить супернатант и ресуспендируют бусины в 1 мл 10 мМ CoCl 2 решения. Положите на шейкере в течение 10 минут.
- Удаляют супернатант с помощью магнита, чтобы собрать шарики и ресуспендируют в 1 мл связывание / Wash буфера.
- Удалить супернатант и мыть бусин в два раза с использованием 1 мл 20% (объем / объем) этанол
- Ресуспендируют бусины в их первоначальном объеме 20% (объем / объем) и др.hanol для получения регенерированного бусины в концентрации 40 мг / мл.
6. Интерпретация результатов
- Контрольный образец 1, в котором не меченые вирус был добавлен, будет использоваться для коррекции фона радиоактивности и установить 0% радиоактивности значение. Контрольный образец 2, который не содержит нано и где, следовательно, все меченые вирус остается в супернатанте, устанавливается в качестве 100% радиоактивности значение.
- Процент радиоактивности в супернатант (=%) является мерой общей осадки (= 100 -%) из радиоактивно вируса нано.
7. Представитель Результаты
Представитель результаты этого анализа захвата близость показаны на рисунках 2, 3 и 4. На рисунке 2, близость PVSS38C, конкретные нанотела для полиовируса, показано. Близость PVSS38C был протестирован на трех различных антигенов poliovIrus: Native-антиген (N-антигена), Подогрев-антиген (Н-антиген) и 14S субъединиц. N-антигена целый вирус, который является заразным. Когда вирус нагревается (20 минут при 56 ° C) или присоединяется к твердой поверхности (неопубликованные результаты), конформации капсида изменения, в результате чего (частичной) потере вирусной РНК и белок капсида VP4 и пустой капсид формируется, которые тогда называли Н-антигены. 14S субъединицы сборки промежуточных продуктов. Эти антигены распознаются различные наборы антител после иммунизации 10 и имеют, соответственно, разные эпитопы и антигенные сайты. На рисунке процент радиоактивности обнаружено в надосадочной представлены в зависимости от концентрации нано. Видно, что радиоактивность в супернатанте образцов, содержащих меченые 14S субъединиц уменьшается с увеличением концентрации нано PVSS38C. Это можно перевести как увеличение количества полиовируса 14S субъединиц конподключенного к нанотела PVSS38C и косвенно магнитных шариков. Захват титр (= концентрация нанотела необходимо захватить 50% радиоактивно вирус) может быть рассчитана как графически 0,099 нм. Нет близости PVSS38C для N-антигенных и Н-антигенной форму полиовируса не наблюдается. Из этих данных интерпретируется что PVSS38C взаимодействует с эпитопом, что является исключительно присутствующих на 14S субъединицу, а не на две другие формы антигенного полиовируса.
Чтобы продемонстрировать, что потеря радиоактивности супернатанта только благодаря специфическим сродством к нанотела его антигенов, тот же тест был выполнен с Nb1, нанотела порожденных против lrpB транскрипционный регулятор Sulfolobus sulfataricus и известно, что нет взаимодействия с любой антиген полиовируса. В результате этого анализа показано на рисунке 3. Все меченые вирус остается в супернатантах показывает, что нет реактивностьNb1 против трех антигенных формах полиомиелита.
Воспроизводимость результатов была проверена путем повторения эксперимента в общей сложности восемь раз для одного данного нанотела (т.е. PVSP29F) в разные дни и разные лица. Полученные результаты представлены на рисунке 4. Среднее значение процентных радиоактивности в супернатант рассчитывается для каждой концентрации нано и представлена в соответствии с ее стандартным отклонением.
Рисунок 1. Обзор принципу (А) и метода (б) анализа. А. Его с метками нанотел, специально признать определенные антигены полиовируса смогут взаимодействовать с кобальтом покрытием магнитных шариков и ускорить радиоактивно меченый вирус. B. Его с метками нанотел добавляются радиоактивно меченых полиовируса и инкубировать. Кобальт-покрытием магнитных шариковдобавлены и магнитной сепарации связанного / несвязанного антигена производится. Радиоактивности супернатанта измеряется и количество захваченных антиген может быть получен.
Рисунок 2. Магнитные близость бисером захвата различных антигенов полиовируса нанотела PVSS38C. Процент радиоактивности обнаружено в надосадочной представлена как функция концентрации PVSS38C. Для 14S концентрация-эффект может быть найден, показывает взаимодействие с PVSS38C эпитоп только присутствовать на 14S. Нет значимого взаимодействия с N-, ни Н-антиген может быть обнаружен, хотя и незначительный неспецифический захватив при очень высоких концентрациях заметил.
Рисунок 3. Магнитные близость бисером захвата различных антигенов полиовируса нанотела Nb1 рисунке 2, следовательно, только в связи с специфическим сродством к нанотела его антигенов.
Рисунок 4. Воспроизводимость анализа. Среднее значение процентных радиоактивности в надосадочной представлены в зависимости от концентрации нано. Эксперимент был повторен в восемь раз в разные дни и разные лица. Стандартное отклонение представляется как вертикальные полосы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В протоколе, радиоактивность антиген взаимодействует с нанотела определяется как потеря радиоактивно вируса супернатант. Таким образом, количество осажденного радиоактивности (= 100 -%) (привязанный к магнитные шарики) можно оценить косвенным образом на радиоактивность в супернатанте (=%). С другой стороны, это также можно измерить радиоактивность осажденного связанной фракции антигена в прямой путь элюированием иммунных комплексов из магнитных шариков с 500 мМ имидазола. Ранее было продемонстрировано 11, есть идеальный матч между общей суммой радиоактивности и суммой радиоактивности обнаружено в надосадочной жидкости и гранулы фракции. Поэтому приемлемым и экономия времени для измерения радиоактивности супернатанта. Метод вымывания иммунных комплексов из магнитных шариков описывается Тис и соавт., 2011 11.
АпаРТ от полиовируса, другие пикорнавирусов, как известно, чувствительны к твердой поверхности индуцированных конформационных преобразования, как экономически важных ноги и вирус ящура (ящура) 2. Изменение формы и уменьшение сродство белков в целом после связывания с пластики описаны в литературе 12. Анализ поэтому может быть использован для исследования взаимодействия между другими белками, которые чувствительны к конформационные изменения, для эпитоп отображения, чтобы определить количество правильно сложить белков, для выявления, относящиеся к структуре примесей в ходе производственных процессов, для быстрой проверки партий во время производства, для очистки образцов, которые являются смесями тесно связаны белки и многие другие приложения можно рассматривать. Наличие различных магнитных шариков со сродством к различным теги поддерживают эти возможности. Несмотря на то, радиоактивные метки, которые использовались в этих опытах, других сигналов можетбыть реализованы для выявления и количественной оценки взаимодействий, как и флуоресцентных красителей 13,14. Многие образцы могут быть проанализированы в ходе одного из экспериментов, и это можно автоматизировать этот метод. Магнитные шарики, используемые в этом исследовании может быть легко использованы повторно только при кипении, зачистки и восстановления шаг, который делает этот недорогой метод. На сегодняшний день пять таких циклов регенерации из бисера не влияет на воспроизводимость результатов (данные не представлены).
Кроме того, его можно рассматривать как специфический метод, так как конкретные нанотел используются только признать их антигенов, поскольку они были в состоянии по-разному взаимодействуют с полиовируса N-и Н-антигенов и 14S субъединиц.
Можно сделать вывод, что этот анализ близости захвата с использованием магнитных шариков теста с широким спектром возможных применений, которая является надежной, простой, количественный, конкретные, экономия времени и недорог.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы выражают благодарность сотрудникам отдела фармацевтической биотехнологии и молекулярной биологии и, особенно, Моник де Pelsmacker для подготовки радиоактивных меченых вирусов. Мы благодарны Эллен Меркс и Hadewych Halewyck за интересные замечания и обсуждения и Геррит де Bleeser за помощь в лабораторных условиях. Эта работа выполнена при финансовой поддержке гранта OZR из Vrije Universiteit Brussel (OZR1807), Fonds воор Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (G.0168.10N) и Всемирная организация здравоохранения (TSA 200 410 791). Лиза Schotte является predoctoral сотрудник Fonds воор Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dynabeads His-Tag Isolation and Pulldown | Invitrogen | 101.03D | Magnetic beads |
| Optiphase ’HiSafe’ 2 | PerkinElmer, Inc. | 1200 - 436 | Scintillation fluid |
References
- Thys, B., Schotte, L., Muyldermans, S., Wernery, U., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. In vitro antiviral activity of single domain antibody fragments against poliovirus. Antiviral Res. 87, 257-264 (2010).
- Meloen, R. H., Briaire, J. A study of the cross-reacting antigens on the intact foot-and-mouth disease virus and its 12S subunits with antisera against the structural proteins. J. Gen. Virol. 51, 107-116 (1980).
- Vrijsen, R., Rombaut, B., Boeye, A. A simple quantitative protein A micro-immunoprecipitation method: assay of antibodies to the N and H antigens of poliovirus. J. Immunol. Methods. 59, 217-220 (1983).
- Rombaut, B., Jore, J., Boeye, A. A competition immunoprecipitation assay of unlabeled poliovirus antigens. J. Virol. Methods. 48, 73-80 (1994).
- Kessler, S. W. Rapid isolation of antigens from cells with a staphylococcal protein A-antibody adsorbent: parameters of the interaction of antibody-antigen complexes with protein A. J. Immunol. 115, 1617-1624 (1975).
- Hamers-Casterman, C., Atarhouch, T., Muyldermans, S., Robinson, G., Hamers, C., Songa, B. ajyana, Bendahman, E., N,, Hamers, R. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
- Arbabi Ghahroudi, M., Desmyter, A., Wyns, L., Hamers, R., Muyldermans, S. Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies. FEBS Lett. 414, 521-526 (1997).
- Muyldermans, S. Single domain camel antibodies: current status. Rev. Mol. Biotechnol. 74, 277-302 (2001).
- Rombaut, B., Vrijsen, R., Boeye, A. Epitope evolution in poliovirus maturation. Arch. Virol. 76, 289-298 (1983).
- Brioen, P., Sijens, R. J., Vrijsen, R., Rombaut, B., Thomas, A. A., Jackers, A., Boeye, A. Hybridoma antibodies to poliovirus N and H antigen. Arch. Virol. 74, 325-330 (1982).
- Thys, B., Saerens, D., Schotte, L., De Bleeser, G., Muyldermans, S., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. A simple quantitative affinity capturing assay of poliovirus antigens and subviral particles by single-domain antibodies using magnetic beads. J. Virol. Methods. 173, 300-305 (2011).
- Wild, D. The Immunoassay Handbook. , Third edition, Elsevier. (2005).
- Kremser, L., Konecsni, T., Blaas, D., Kenndler, E. Fluorescence labeling of human rhinovirus capsid and analysis by capillary electrophoresis. Anal. Chem. 76, 4175-4181 (2004).
- Pelkmans, L., Kartenbeck, J., Helenius, A. Caveolar endocytosis of simian virus 40 reveals a new two-step vesicular-transport pathway to the ER. Nat. Cell Biol. 3, 473-483 (2001).
