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Biology

液相亲和捕获试验用磁珠研究蛋白质相互作用:脊髓灰质炎病毒的Nanobody范例

doi: 10.3791/3937 Published: May 29, 2012

Summary

在这篇文章中,提出了一个简单,定量,液相亲和力捕获检测。这是一个可靠的技术基础上,一方面与亲和力之间的标记蛋白,对其他的第二个标记蛋白(如脊髓灰质炎病毒)之间的磁珠和标签蛋白(如纳米抗体)的相互作用。

Abstract

在这篇文章中,提出了一个简单,定量,液相亲和力捕获检测。提供一种蛋白质,可以用来标记和标记的另一种蛋白质,这种方法可以实现蛋白质相互作用的调查。它是基于一个钴磁珠标记蛋白的识别和标签蛋白和标记的第二个特定蛋白质之间的相互作用,另一方面手。首先,标记和标签的蛋白质混合,在室温下孵育。磁珠,识别标签,添加和标记蛋白结合部分分开绑定使用磁铁的分数。被捕获的标记蛋白量可确定以间接的方式,通过测量的标记蛋白的信号仍然在绑定分数。描述液相亲和力检测是非常有用的,当敏感蛋白的构象转化的屁股ayed。检测的发展和应用,证明认识到纳米抗体1的脊髓灰质炎病毒和脊髓灰质炎病毒之间的相互作用。由于脊髓灰质炎病毒是敏感的构象转化2时,附着在固体表面(未发表结果),ELISA法的使用是有限的,因此,应优先考虑液相系统。液相基于polioresearch 3,4经常使用的系统的一个例子是一个免疫试验5微蛋白。即使这个测试已经证明了它的适用性,它需要一个FC结构,这是在纳米抗体6,7缺席。然而,作为另一个机会,这些有趣的和稳定的单域抗体可以很容易地设计不同的标签。广泛使用(他)6标记显示为二价离子,如镍,钴,可以在轮到他们可以轻松地在磁珠表面的亲和力。因此,我们开发了这个简单的定量基于钴磁珠亲和捕获检测。脊髓灰质炎病毒35 S的标记,使入无人之境的互动与纳米抗体,并做出了定量的检测可行的。方法是易于执行,并可以以较低的成本,这是有效再生磁珠的可能性进一步支持建立。

Protocol

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图1描述的原则(A)和方法的概述(二)。

1。缓冲区的制备

  1. 准备结合/洗涤液溶解磷酸二氢钠(50毫米)和氯化钠于水(300毫米)和pH值调整到8.0。此外添加吐温20(终浓度为0.01%(M / V)),蛋氨酸(终浓度为2%(M / V))和白蛋白(终浓度为0.1%(M / V)),并调整到所需的体积。

2。磁珠的制备

按照说明书准备磁珠。简述如下:

  1. 重悬磁珠使用一个旋涡。
  2. 转移,对每个样品,10μL重悬磁珠成筒(40毫克/毫升)。
  3. 使用磁铁收集磁珠,直到上清液是明确的(+ / - 30秒),去除上清仔细。
  4. 洗磁珠两次:悬浮在150μL结合/洗涤液珠。磁珠迁移到使用磁铁,直到上清液是明确管的一侧,小心取出上清液。
  5. 用40μL结合/洗涤液,每个样品,悬浮珠(10毫克/毫升)。

3。亲和捕获法

注:为了测量(宇宙)的背景放射性(0%放射性),无放射性的病毒被添加到控制样品1。相反,相同体积的结合/洗涤液补充。

注:100%的放射性控制样品2除nanobody添加所有组件的定义。相反,相同体积的结合/洗涤液补充。

  1. 使2000年35 S的标记(β辐射)脊髓灰质炎病毒萨宾株类型1 9日至80μL结合/洗涤液稀释成96孔板CPM。
  2. 新增10Μ升井nanobody稀释。
  3. 混合使用振动筛约10秒。
  4. 允许的样品在室温下1小时孵化。
  5. 加入40μl和水洗悬浮磁珠孵育10分钟,在室温下不断晃动。
  6. 分开珠和使用磁铁的上清转移到管清除上清。

4。放射性测量

  1. 转移50μL上清步入一个计数瓶3.6。
  2. 加入3毫升闪烁液和混合。测量放射性β-闪烁计数器。

5。回收的珠子

  1. 在500 XG 2分钟或直到得到一个明确的上清收集管和离心机使用的磁珠。
  2. 除去上清,悬浮在6毫升0.5 M氢氧化钠珠。
  3. 转移到含多处悬挂E管和超声波水浴孵育5分钟。
  4. 使用磁铁收集磁珠,去除上清。
  5. 每个试管中加入1毫升2%SDS溶液和悬浮使用一个旋涡。在5分钟烧开。
  6. 收集珠子,去除上清。珠悬浮在1毫升0.2 M EDTA(pH值= 7)。
  7. 在5分钟的超声波浴孵育管一次,去除上清。
  8. 每管加入1毫升的水和悬浮的珠子。收集珠子,去除上清。重复此清洗步骤两次。
  9. 去除上清,1毫升10毫米CoCl 2溶液中悬浮的珠子。振动筛,放10分钟。
  10. 去除上清,用磁铁收集珠和悬浮在1毫升结合/洗涤缓冲。
  11. 去除上清,洗珠两次使用1毫升20%(V / V)乙醇
  12. 悬浮在其原体积20%(V / V)等珠hanol获得再生珠,在浓度为40毫克/毫升。

6。结果解读

  1. 控制样品1,在没有放射性病毒,将用于为背景的放射性和纠正设置0%的辐射值。控制样品,其中不包含的nanobody和地方,因此所有放射性病毒仍然存在,在上清设置为100%的辐射值。
  2. 放射性上清液中的比例(%)是衡量一个整体降水量(= 100 - %)放射性病毒由nanobody的。

7。代表结果

代表亲和捕获检测的结果显示在图2,图3和4。图2所示的PVSS38C,脊髓灰质炎nanobody的具体亲和力。亲和力PVSS38C测试三个不同的抗原poliovirus:母语抗原(N抗原),加热抗原(H抗原)和14S亚基。的N-抗原是完整的病毒是有传染性的。当病毒被加热(56℃20分钟),或附着在固体表面(未发表结果),衣壳变化的构象,造成损失的病毒RNA(部分)和衣壳蛋白VP4,空衣壳的形成,则称为H抗原。 14S亚基组装中间体。这些抗原被确认由不同的抗体免疫后10集,并具备因此,不同表位抗原位点。在上清液中发现的放射性物质的百分比数字表示作为浓度nanobody功能。由此可以看出,在样本含有放射性14S亚基上清放射性与该nanobody PVSS38C浓度的增加而降低。这可以被翻译为脊髓灰质炎病毒的14S亚基CON量增加连接到nanobody PVSS38C和间接的磁珠。可以捕捉滴度(= nanobody必要浓度捕捉放射性病毒的50%)为0.099 nm的图形计算。没有PVSS38C为N-抗原和脊髓灰质炎病毒的H抗原形式的亲和力观察。从这些数据中,它被解释,PVSS38C完全是存在的14S亚基和两个脊髓灰质炎病毒抗原形式与抗原相互作用。

为了证明上清液的放射性损失只是由于具体实现其抗原nanobody亲和力,同样的检测与NB1,对硫化sulfataricus转录调控lrpB产生称为nanobody的,没有互动任何脊髓灰质炎病毒抗原。这个实验的结果如图3所示。所有放射性病毒仍然有没有反应,显示上清NB1对三种脊髓灰质炎病毒抗原形式。

共八次在不同天为一个给定的nanobody(即PVSP29F)的重复实验,并通过不同的人进行了测试结果的重复性。 如图4所示的结果。上清液中的放射性百分比平均值计算每个nanobody浓度,并在其标准差的信件表示。

图1。
图1。原则(一)概述和方法(二)检测 。答:他的标签,明确承认将能够互动与钴磁珠,将沉淀的放射性标记的病毒有一定的脊髓灰质炎病毒抗原的纳米抗体。 B.他的标记的纳米抗体被添加到放射性标记的脊髓灰质炎病毒和培养。钴磁珠添加和绑定/绑定抗原进行磁选。上清液的放射性测量和抗原捕获量可得。

图2
图2。不同的脊髓灰质炎病毒抗原磁珠亲和捕获由nanobody PVSS38C。上清液中发现的放射性物质的百分比表示作为浓度PVSS38C功能。为14S浓度响应关系可以发现,14S目前与抗原完全PVSS38C互动。没有显着的交互作用的N-,也可以检测到的H-抗原,虽然在很高的浓度可以忽略不计的非特异性捕捉注意到。

图3
图3。不同的脊髓灰质炎病毒抗原的亲和力磁珠捕获nanobody NB1 图2中的放射性的损失,因此只是由于具体实现其抗原nanobody亲和力。

图4。
图4。重复性检测 。代表平均值的百分比在上清放射性作为浓度nanobody功能。实验在不同的日子,不同的人重复八次。竖线表示标准偏差。

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Discussion

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在协议的相互作用抗原与nanobody的放射性被定义为放射性病毒上清损失。因此沉淀放射性(= 100 - %)金额(绑定向磁珠)可以以间接的方式,由上清(%)放射性估计。另一方面,它也有可能在500 mM咪唑洗脱从磁珠免疫复合物的直接的方式来测量放射性沉淀的抗原结合部分。它以前被证明是有放射性物质的总量和上清和沉淀分数发现放射性的总和之间的完美匹配。因此,它是可以接受的和节省时间的测量上清液的放射性。从磁珠免疫复合物洗脱的方法来描述泰思等。,201111。

阿帕由脊髓灰质炎病毒RT,其他小RNA病毒被称为是敏感的固体表面,诱导构象转化,如经济重要的口蹄疫病毒(FMDV)2。修改后绑定到塑料的形状和一般蛋白质的亲和力减少在文学12。因此,该法可以用于调查的构象变化是敏感的其他蛋白质之间的相互作用,表位作图,确定正确折叠的蛋白质的量,在生产过程中相关杂质的结构屏幕批次的快速筛选,在生产,可以认为是密切相关的蛋白质和许多其他应用的混合物样品的净化。具有亲和力的不同磁珠的不同标签的可用性,支持这些可能性。虽然在这些实验中使用放射性标签,其他信号实施检测和量化的相互作用,像13,14荧光染料。许多样本可以在一项实验中分析和自动化的方法,它是可能的。在本实验中使用的磁珠可以很容易地被重新使用只是一个沸腾,剥离和再生的一步,使得这是一个廉价的方法。到今天为止,五珠这些再生循环没有影响重复性的结果(数据未显示)。

此外,它可以被视为一种具体的方法,由于特定的纳米抗体,只承认其抗原,因为他们能够与脊髓灰质炎病毒的N-和H抗原和14S亚基不同的互动。

由此可以得出结论,使用磁珠亲和捕获检测是一种检测与可靠,操作简单,定量的,具体的,节省时间和价格低廉的可能的应用范围广泛。

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Disclosures

我们什么都没有透露。

Acknowledgments

作者感谢医药生物技术和分子生物学的部门和工作人员,特别是莫妮克德Pelsmacker编制放射性标记的病毒。我们感谢埃伦MERCKX和Hadewych Halewyck有趣的发言和讨论,并以他在实验室的帮助下格里特德Bleeser。这项工作是由布鲁塞尔自由大学(OZR1807)的全宗,voor Wetenschappelijk Onderzoe​​k Vlaanderen(G.0168.10N)和世界卫生组织(TSA的200410791)OZR批财政支持。莉莎好德是博士前的全宗,voor Wetenschappelijk Onderzoe​​k Vlaanderen(FWO)研究员。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dynabeads His-Tag Isolation and Pulldown Invitrogen 101.03D Magnetic beads
Optiphase ’HiSafe’ 2 PerkinElmer, Inc. 1200 - 436 Scintillation fluid

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References

  1. Thys, B., Schotte, L., Muyldermans, S., Wernery, U., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. In vitro antiviral activity of single domain antibody fragments against poliovirus. Antiviral Res. 87, 257-264 (2010).
  2. Meloen, R. H., Briaire, J. A study of the cross-reacting antigens on the intact foot-and-mouth disease virus and its 12S subunits with antisera against the structural proteins. J. Gen. Virol. 51, 107-116 (1980).
  3. Vrijsen, R., Rombaut, B., Boeye, A. A simple quantitative protein A micro-immunoprecipitation method: assay of antibodies to the N and H antigens of poliovirus. J. Immunol. Methods. 59, 217-220 (1983).
  4. Rombaut, B., Jore, J., Boeye, A. A competition immunoprecipitation assay of unlabeled poliovirus antigens. J. Virol. Methods. 48, 73-80 (1994).
  5. Kessler, S. W. Rapid isolation of antigens from cells with a staphylococcal protein A-antibody adsorbent: parameters of the interaction of antibody-antigen complexes with protein A. J. Immunol. 115, 1617-1624 (1975).
  6. Hamers-Casterman, C., Atarhouch, T., Muyldermans, S., Robinson, G., Hamers, C., Songa, B. ajyana, Bendahman, E., N,, Hamers, R. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
  7. Arbabi Ghahroudi, M., Desmyter, A., Wyns, L., Hamers, R., Muyldermans, S. Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies. FEBS Lett. 414, 521-526 (1997).
  8. Muyldermans, S. Single domain camel antibodies: current status. Rev. Mol. Biotechnol. 74, 277-302 (2001).
  9. Rombaut, B., Vrijsen, R., Boeye, A. Epitope evolution in poliovirus maturation. Arch. Virol. 76, 289-298 (1983).
  10. Brioen, P., Sijens, R. J., Vrijsen, R., Rombaut, B., Thomas, A. A., Jackers, A., Boeye, A. Hybridoma antibodies to poliovirus N and H antigen. Arch. Virol. 74, 325-330 (1982).
  11. Thys, B., Saerens, D., Schotte, L., De Bleeser, G., Muyldermans, S., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. A simple quantitative affinity capturing assay of poliovirus antigens and subviral particles by single-domain antibodies using magnetic beads. J. Virol. Methods. 173, 300-305 (2011).
  12. Wild, D. The Immunoassay Handbook. Third edition, Elsevier. (2005).
  13. Kremser, L., Konecsni, T., Blaas, D., Kenndler, E. Fluorescence labeling of human rhinovirus capsid and analysis by capillary electrophoresis. Anal. Chem. 76, 4175-4181 (2004).
  14. Pelkmans, L., Kartenbeck, J., Helenius, A. Caveolar endocytosis of simian virus 40 reveals a new two-step vesicular-transport pathway to the ER. Nat. Cell Biol. 3, 473-483 (2001).
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Schotte, L., Rombaut, B., Thys, B. A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example. J. Vis. Exp. (63), e3937, doi:10.3791/3937 (2012).More

Schotte, L., Rombaut, B., Thys, B. A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example. J. Vis. Exp. (63), e3937, doi:10.3791/3937 (2012).

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