En væskefase affinitetsindfangning under anvendelse af magnetiske perler til at studere protein-protein interaktion: poliovirus-Nanobody Eksempel
Summary
I denne artikel, er en simpel, kvantitativ, flydende fase affinitetsindfangning analysen præsenteret. Det er en pålidelig teknik baseret på interaktionen mellem magnetiske perler og mærkede proteiner (f.eks nanobodies) på den ene side og affiniteten mellem den mærkede protein og et andet, mærket protein (f.eks poliovirus) på den anden.
Abstract
I denne artikel, er en simpel, kvantitativ, flydende fase affinitetsindfangning analysen præsenteret. Forudsat at et protein kan mærkes og et andet protein mærket, kan denne fremgangsmåde anvendes til undersøgelse af protein-protein interaktioner. Den er baseret på den ene side om anerkendelse af det mærkede protein ved kobolt coatede magnetiske perler, og på den anden side på samspillet mellem den taggede protein og et andet specifikt protein, der er mærket. Først er de mærkede og mærkede proteiner blandet og inkuberet ved stuetemperatur. De magnetiske perler, der genkender mærket, tilsættes, og den bundne fraktion af mærket protein separeres fra den ubundne fraktion ved hjælp af magneter. Mængden af mærket protein, som er fanget kan bestemmes på en indirekte måde ved at måle signalet af det mærkede protein forbliver i den ubundne fraktion. Den beskrevne flydende fase affinitetsassay er ekstremt nyttigt, når de konforme konvertering følsomme proteiner er røvayed. Udviklingen og anvendelsen af analysen er vist for samspillet mellem poliovirus og poliovirus anerkende nanobodies 1. Idet poliovirus er følsom over for konformationelle konvertering 2, når fæstnet til en fast overflade (ikke offentliggjorte resultater), er anvendelsen af ELISA begrænset, og en flydende fase system bør derfor foretrækkes. Et eksempel på en flydende fase system anvendes ofte i polioresearch 3,4 er den mikro-protein A-immunfældning test 5. Selvom denne test har bevist sin anvendelighed, kræver det en Fc-struktur, som er fraværende i de nanobodies 6,7. Men, som en anden mulighed, kan disse interessante og stabile enkelt-domæne antistoffer 8 let manipuleret med forskellige mærker. Den udbredte (His) 6-tag viser affinitet for divalente ioner, såsom nikkel eller cobalt, som kan på deres side kan let belægges på magnetiske perler. Vi har derfor udviklet denne simple kvantitativeaffinitetsindfangning assay baseret på cobalt belagte magnetiske perler. Poliovirus blev mærket med 35S at muliggøre uhindret interaktion med nanobodies og at foretage en kvantitativ påvisning mulig. Fremgangsmåden er let at udføre og kan etableres med en lav pris, hvilket er yderligere understøttet af muligheden for effektiv regenerering de magnetiske perler.
Protocol
Discussion
I protokollen, der er radioaktiviteten af antigenet interagere med nanobody defineret som tabet af radiomærket virus fra supernatanten. Er mængden af udfældet radioaktivitet (= 100 – a%) (bundet til de magnetiske perler) kan vurderes på en indirekte måde ved radioaktiviteten i supernatanten (= en%). På den anden side er det også muligt at måle radioaktiviteten af det udfældede bundne fraktion af antigen i en direkte måde ved eluering af immunkomplekser fra de magnetiske perler med 500 mM imid…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker personalet i afdelingen for Pharmaceutical Biotechnology and Molecular Biology og især Monique De Pelsmacker for udarbejdelsen af radioaktivt mærkede virus. Vi er taknemmelige for Ellen Merckx og Hadewych Halewyck for deres interessante bemærkninger og diskussioner og Gerrit De Bleeser for hans hjælp i laboratoriet. Dette arbejde blev støttet af en OZR tilskud på Vrije Universiteit Brussel (OZR1807), Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (G.0168.10N) og World Health Organization (TSA 200.410.791). Lise Schotte er en predoctoral Fellow af Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Dynabeads His-Tag Isolation and Pulldown | Invitrogen | 101.03D | Magnetic beads |
| Optiphase ‘HiSafe’ 2 | Perkin Elmer | 1200 – 436 | Scintillation fluid |
References
- Thys, B., Schotte, L., Muyldermans, S., Wernery, U., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. In vitro antiviral activity of single domain antibody fragments against poliovirus. Antiviral Res. 87, 257-264 (2010).
- Meloen, R. H., Briaire, J. A study of the cross-reacting antigens on the intact foot-and-mouth disease virus and its 12S subunits with antisera against the structural proteins. J. Gen. Virol. 51, 107-116 (1980).
- Vrijsen, R., Rombaut, B., Boeye, A. A simple quantitative protein A micro-immunoprecipitation method: assay of antibodies to the N and H antigens of poliovirus. J. Immunol. Methods. 59, 217-220 (1983).
- Rombaut, B., Jore, J., Boeye, A. A competition immunoprecipitation assay of unlabeled poliovirus antigens. J. Virol. Methods. 48, 73-80 (1994).
- Kessler, S. W. Rapid isolation of antigens from cells with a staphylococcal protein A-antibody adsorbent: parameters of the interaction of antibody-antigen complexes with protein A. J. Immunol. 115, 1617-1624 (1975).
- Hamers-Casterman, C., Atarhouch, T., Muyldermans, S., Robinson, G., Hamers, C., Songa, B. a. j. y. a. n. a., Bendahman, E., N, ., Hamers, R. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
- Arbabi Ghahroudi, M., Desmyter, A., Wyns, L., Hamers, R., Muyldermans, S. Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies. FEBS Lett. 414, 521-526 (1997).
- Muyldermans, S. Single domain camel antibodies: current status. Rev. Mol. Biotechnol. 74, 277-302 (2001).
- Rombaut, B., Vrijsen, R., Boeye, A. Epitope evolution in poliovirus maturation. Arch. Virol. 76, 289-298 (1983).
- Brioen, P., Sijens, R. J., Vrijsen, R., Rombaut, B., Thomas, A. A., Jackers, A., Boeye, A. Hybridoma antibodies to poliovirus N and H antigen. Arch. Virol. 74, 325-330 (1982).
- Thys, B., Saerens, D., Schotte, L., De Bleeser, G., Muyldermans, S., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. A simple quantitative affinity capturing assay of poliovirus antigens and subviral particles by single-domain antibodies using magnetic beads. J. Virol. Methods. 173, 300-305 (2011).
- Wild, D. . The Immunoassay Handbook. , (2005).
- Kremser, L., Konecsni, T., Blaas, D., Kenndler, E. Fluorescence labeling of human rhinovirus capsid and analysis by capillary electrophoresis. Anal. Chem. 76, 4175-4181 (2004).
- Pelkmans, L., Kartenbeck, J., Helenius, A. Caveolar endocytosis of simian virus 40 reveals a new two-step vesicular-transport pathway to the ER. Nat. Cell Biol. 3, 473-483 (2001).
