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Biology

एक तरल चरण आत्मीयता कब्जा चुंबकीय मोती का उपयोग करने के लिए प्रोटीन से प्रोटीन सहभागिता अध्ययन परख: उदाहरण पोलियो वायरस Nanobody

doi: 10.3791/3937 Published: May 29, 2012

Summary

इस अनुच्छेद में, एक सरल, मात्रात्मक, तरल चरण आत्मीयता कब्जा परख प्रस्तुत किया है. यह एक विश्वसनीय तकनीक चुंबकीय मोती और एक हाथ और टैग और अन्य पर एक दूसरे, लेबल प्रोटीन (जैसे पोलियो वायरस) प्रोटीन के बीच संबंध पर टैग प्रोटीन (nanobodies जैसे) के बीच बातचीत पर आधारित है.

Protocol

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(ए) सिद्धांत और पद्धति का एक सिंहावलोकन (बी) चित्र 1 में चित्रित कर रहे हैं.

1. बफर की तैयारी

  1. बाइंडिंग / धो बफर भंग सोडियम dihydrogen फॉस्फेट (50 मिमी) और पानी में सोडियम क्लोराइड (300 मिमी) द्वारा तैयार और 8.0 के पीएच समायोजित. इसके अतिरिक्त 20 के बीच (0.01% (एम / वी) अंतिम एकाग्रता), (2% (एम / वी) अंतिम एकाग्रता) methionine और albumin (0.1% (एम / वी) अंतिम एकाग्रता) जोड़ने और आवश्यक मात्रा को समायोजित.

2. चुंबकीय मोती की तैयारी

अनुदेश मैनुअल के अनुसार चुंबकीय मोतियों की तैयारी. संक्षेप में:

  1. चुंबकीय मोती Resuspend एक भंवर का उपयोग.
  2. स्थानांतरण, प्रत्येक नमूना के लिए, एक ट्यूब में resuspended चुंबकीय मोती (40 मिलीग्राम / एमएल) की 10 μl.
  3. चुंबकीय मोती एक चुंबक का उपयोग कर लीजिए, जब तक सतह पर तैरनेवाला स्पष्ट है (+ / - सेकंड 30) और सतह पर तैरनेवाला ध्यान हटाने के.
  4. धोनाचुंबकीय दो बार मोती: बाइंडिंग / धो बफर के 150 μl में मोती resuspend. एक चुंबक का उपयोग कर जब तक सतह पर तैरनेवाला स्पष्ट है ट्यूब के एक तरफ करने के लिए चुंबकीय मोती विस्थापित और ध्यान से सतह पर तैरनेवाला हटाने के.
  5. बंधन / धो बफर के 40 μl का प्रयोग करें, प्रत्येक नमूना के लिए, मोती (10 मिलीग्राम / एमएल) resuspend.

3. आत्मीयता कैद परख

नोट: (ब्रह्मांडीय) के पृष्ठभूमि रेडियोधर्मिता (0% रेडियोधर्मिता) को मापने के लिए, कोई radiolabeled वायरस एक नियंत्रण एक नमूना करने के लिए जोड़ा जाता है. इसके बजाय, एक ही मात्रा / बाइंडिंग धो बफर जोड़ा जाता है.

नोट: 100% रेडियोधर्मिता नियंत्रण नमूना 2 से Nanobody को छोड़कर सभी घटकों को जोड़ रहे हैं द्वारा परिभाषित किया गया है. इसके बजाय, एक ही मात्रा / बाइंडिंग धो बफर जोड़ा जाता है.

  1. 2000 35 (β-विकिरण) पोलियोवायरस साबिन तनाव प्रकार 1 9, microtiter 96 अच्छी तरह से थाली में बंधन धो / 80 μl के लिए बफर के साथ पतला लेबल एस सीपीएम लाओ.
  2. 10 जोड़ें मीटरयू, Nanobody कुओं के लिए कमजोर पड़ने के एल.
  3. मिश्रण एक प्रकार के बरतन का उपयोग कर के बारे में 10 सेकंड के लिए.
  4. नमूने कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेते हैं करने के लिए अनुमति देते हैं.
  5. धोया चुंबकीय मोती निलंबन के 40 μl जोड़ें और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए लगातार झटकों के तहत, सेते हैं.
  6. मोती और सतह पर तैरनेवाला एक चुंबक का उपयोग कर अलग करें और स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला एक ट्यूब में मंजूरी दे दी.

4. रेडियोधर्मिता का मापन

  1. गिनती कुप्पी में 3.6 कदम से सतह पर तैरनेवाला के 50 μl स्थानांतरण.
  2. जगमगाहट तरल पदार्थ और मिश्रण के 3 मिलीलीटर जोड़ें. एक काउंटर β-जगमगाहट में रेडियोधर्मिता को मापने के.

5. मोती पुनर्चक्रण

  1. 2 मिनट के लिए 500 XG पर या जब तक एक स्पष्ट सतह पर तैरनेवाला प्राप्त है एक ट्यूब और अपकेंद्रित्र में इस्तेमाल किया चुंबकीय मोती ले लीजिए.
  2. निकालें सतह पर तैरनेवाला और 6 मिलीग्राम 0.5 एम NaOH में मोती resuspend.
  3. Multipl के लिए निलंबन स्थानांतरणई ट्यूबों और 5 मिनट के लिए एक अल्ट्रासोनिक स्नान में सेते हैं.
  4. चुंबक का उपयोग चुंबकीय मोतियों को इकट्ठा करने और सतह पर तैरनेवाला को हटा दें.
  5. प्रत्येक ट्यूब के लिए 1 मिलीग्राम 2% एसडीएस समाधान जोड़ें और एक भंवर का उपयोग resuspend. 5 मिनट के दौरान उबाल लें.
  6. मोती लीजिए और सतह पर तैरनेवाला को हटा दें. 1 मिलीलीटर 0.2 M EDTA (= पीएच 7) में मोती Resuspend.
  7. 5 मिनट के लिए एक अल्ट्रासोनिक स्नान में ट्यूबों को सेते हैं और एक बार और अधिक सतह पर तैरनेवाला हटाने के.
  8. प्रत्येक ट्यूब में पानी के 1 मिलीलीटर जोड़ें और मोती resuspend. मोती लीजिए और सतह पर तैरनेवाला को हटा दें. इस धोने कदम दो बार दोहराएँ.
  9. निकालें सतह पर तैरनेवाला और 1 मिलीग्राम 10 मिमी CoCl 2 समाधान में मोती resuspend. 10 मिनट के लिए एक प्रकार के बरतन पर रखो.
  10. एक चुंबक का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला को मोती को इकट्ठा करने और बाइंडिंग / धो बफर के 1 मिलीग्राम में resuspend निकालें.
  11. निकालें सतह पर तैरनेवाला और मोती दो बार 20% की 1 मिलीलीटर का उपयोग (v / v) इथेनॉल धो
  12. 20% अपने मूल मात्रा (v / v) एट में मोती Resuspend40 मिलीग्राम / एमएल के एक एकाग्रता में पुनर्जीवित मोती प्राप्त hanol.

6. परिणामों की व्याख्या

  1. नियंत्रण एक नमूना है, जो में कोई radiolabeled वायरस जोड़ा गया पृष्ठभूमि रेडियोधर्मिता के लिए सही और 0% रेडियोधर्मिता मूल्य निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. नियंत्रण 2 नमूना है, जो Nanobody और फलस्वरूप जहां सभी radiolabeled वायरस के सतह पर तैरनेवाला में रहता है, शामिल नहीं करता है के के रेडियोधर्मिता 100% मूल्य के रूप में सेट कर दिया जाता है.
  2. Nanobody द्वारा radiolabeled वायरस की सतह पर तैरनेवाला में रेडियोधर्मिता का प्रतिशत (=%) समग्र वर्षण (एक% = 100) के एक उपाय है.

7. प्रतिनिधि परिणाम

इस संबंध कब्जा परख के लिए प्रतिनिधि परिणाम आंकड़े 2, 3 और 4 में दिखाया जाता है. चित्रा 2 में, PVSS38C, पोलियो वायरस के लिए एक विशिष्ट Nanobody के संबंध में दिखाया गया है. PVSS38C की आत्मीयता poliov के तीन अलग प्रतिजनों के लिए परीक्षण किया गया थाirus: मूल (एन प्रतिजन) प्रतिजन, गरम - प्रतिजन (एच प्रतिजन) और 14S सब यूनिटों. एन प्रतिजन बरकरार वायरस है कि संक्रामक है. जब वायरस (56 पर 20 मिनट ° सी) गरम किया जाता है या एक ठोस सतह (अप्रकाशित), capsid परिवर्तन की रचना, वायरल शाही सेना के एक (आंशिक) हानि और capsid VP4 प्रोटीन में जिसके परिणामस्वरूप से जुड़ी है, और खाली capsids का गठन कर रहे हैं जो फिर एच एंटीजन कहा जाता है. 14S सब यूनिटों विधानसभा मध्यवर्ती हैं. इन प्रतिजनों 10 प्रतिरक्षण के बाद एंटीबॉडी के विभिन्न सेट द्वारा मान्यता प्राप्त हैं और इसलिए अलग के epitopes और प्रतिजनी साइटों के पास है. आंकड़ा में रेडियोधर्मिता का प्रतिशत सतह पर तैरनेवाला में पाया Nanobody की एकाग्रता के एक समारोह के रूप में प्रतिनिधित्व किया है. यह देखा जा सकता है कि radiolabeled 14S सब यूनिटों वाले नमूने की सतह पर तैरनेवाला में रेडियोधर्मिता Nanobody PVSS38C की बढ़ती सांद्रता के साथ घट जाती है. इस 14S सब यूनिटों चोर पोलियो वायरस की राशि में वृद्धि के रूप में अनुवाद किया जा सकता हैसे Nanobody PVSS38C तक और परोक्ष रूप से चुंबकीय मोतियों nected. अनुमापांक (= Nanobody आवश्यक एकाग्रता radiolabeled वायरस के 50% पर कब्जा) पर कब्जा रेखांकन 0.099 एनएम के रूप में गणना की जा सकती है. एन प्रतिजनी और पोलियो वायरस के रूप एच प्रतिजनी लिए PVSS38C का कोई संबंध मनाया जाता है. यह इन आंकड़ों से व्याख्या की है है कि PVSS38C एक का मिलान कि 14S सबयूनिट पर विशेष रूप से मौजूद है और पोलियो वायरस की दो अन्य प्रतिजनी रूपों पर नहीं है के साथ बातचीत कर रहा है.

को दिखाना है कि सतह पर तैरनेवाला से रेडियोधर्मिता की हानि केवल अपने प्रतिजनों की ओर Nanobody की विशिष्ट संबंध के कारण, एक ही परख Nb1 साथ प्रदर्शन किया था, नहीं के साथ बातचीत के एक Sulfolobus sulfataricus lrpB transcriptional नियामक के खिलाफ उत्पन्न और जाना जाता है Nanobody किसी भी पोलियो वायरस प्रतिजन. इस परख का परिणाम चित्रा 3 में दिखाया जाता है. सभी radiolabeled वायरस हैं दिखा supernatants में रहता है कि वहाँ का कोई जेटNb1 पोलियो वायरस की तीन प्रतिजनी रूपों के खिलाफ.

परिणामों के reproducibility दिया Nanobody (यानी, PVSP29F) के लिए आठ बार के एक कुल के लिए अलग अलग दिनों पर प्रयोग दोहरा द्वारा और अलग व्यक्तियों द्वारा परीक्षण किया गया था. परिणाम 4 चित्र में दिखाया जाता है. सतह पर तैरनेवाला में प्रतिशत रेडियोधर्मिता का मतलब मान प्रत्येक Nanobody एकाग्रता के लिए गणना की थी और इसके मानक विचलन के साथ पत्राचार में प्रतिनिधित्व है.

आकृति 1.
आकृति 1. सिद्धांत (ए) के एक सिंहावलोकन और विधि परख (बी). ए nanobodies है कि विशेष रूप से एक निश्चित पोलियो वायरस प्रतिजन पहचान कोबाल्ट लेपित चुंबकीय मोतियों के साथ बातचीत और radioactively लेबल वायरस वेग होगा सक्षम हो जाएगा उसका टैग. बी उनकी टैग nanobodies radioactively लेबल पोलियो वायरस के लिए जोड़ रहे हैं और incubated रहे. कोबाल्ट लेपित चुंबकीय मोतियों हैंजोड़ा और बाध्य / अपार प्रतिजन के चुंबकीय जुदाई किया जाता है. सतह पर तैरनेवाला के रेडियोधर्मिता मापा जाता है पर कब्जा कर लिया प्रतिजन की राशि प्राप्त किया जा सकता है.

चित्रा 2
चित्रा 2. चुंबकीय मोती अलग पोलियो वायरस प्रतिजनों के संबंध कब्जा Nanobody PVSS38C. सतह पर तैरनेवाला में पाया रेडियोधर्मिता का प्रतिशत PVSS38C की एकाग्रता के एक समारोह के रूप में प्रतिनिधित्व किया है. 14S के लिए एक एकाग्रता - प्रतिक्रिया संबंध पाया जा सकता है एक विशेष रूप से वर्तमान का मिलान 14S पर साथ PVSS38C की बातचीत दिखा. साथ कोई महत्वपूर्ण बातचीत एन, और न ही एच प्रतिजन, पता लगाया जा सकता है हालांकि एक गैर विशिष्ट पर कब्जा बहुत उच्च सांद्रता में नगण्य देखा है.

चित्रा 3
चित्रा 3. चुंबकीय मोती अलग पोलियो वायरस प्रतिजनों के संबंध कब्जा Nanobody Nb1 2 आंकड़े में रेडियोधर्मिता का नुकसान इसलिए केवल इसके प्रतिजनों की ओर Nanobody के विशिष्ट संबंध की वजह से है.

चित्रा 4.
चित्रा 4. परख के reproducibility. सतह पर तैरनेवाला में प्रतिशत रेडियोधर्मिता का मतलब मूल्य के में Nanobody की एकाग्रता के एक समारोह के रूप में प्रतिनिधित्व है. प्रयोग अलग अलग दिनों पर और अलग अलग व्यक्तियों द्वारा आठ बार दोहराया गया था. मानक विचलन ऊर्ध्वाधर सलाखों के रूप में प्रतिनिधित्व किया है.

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Discussion

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प्रोटोकॉल में, Nanobody के साथ बातचीत प्रतिजन की रेडियोधर्मिता radiolabeled वायरस की सतह पर तैरनेवाला से नुकसान के रूप में परिभाषित किया गया है. इसलिए उपजी रेडियोधर्मिता (= 100%) की राशि (चुंबकीय मोतियों के लिए बाध्य) सतह पर तैरनेवाला (=%) में रेडियोधर्मिता द्वारा एक अप्रत्यक्ष तरीके से अनुमान लगाया जा सकता है. दूसरी ओर, यह भी संभव है चुंबकीय मोतियों से 500 मिमी imidazole के साथ immunocomplexes eluting द्वारा एक सीधे रास्ते में प्रतिजन की उपजी बाध्य अंश की रेडियोधर्मिता उपाय. यह पहले 11 प्रदर्शन किया गया कि रेडियोधर्मिता की कुल राशि और रेडियोधर्मिता सतह पर तैरनेवाला और गोली भिन्न में पाया की राशि के बीच एक परिपूर्ण मैच है. इसलिए यह स्वीकार्य है और समय की बचत करने के लिए सतह पर तैरनेवाला के रेडियोधर्मिता उपाय है. चुंबकीय मोतियों से immunocomplexes की क्षालन के लिए विधि Thys एट अल द्वारा वर्णित है, 11 2011.

आपापोलियो वायरस से आर टी, अन्य picornaviruses के ठोस गठनात्मक रूपांतरण प्रेरित आर्थिक रूप से महत्वपूर्ण पैर और मुंह रोग वायरस (FMDV) 2 की तरह, सतह के प्रति संवेदनशील माने जाते हैं. आकार में परिवर्तन और प्लास्टिक के लिए बाध्य करने के बाद सामान्य रूप में प्रोटीन के बंधन आत्मीयता में कमी 12 साहित्य में वर्णित है. परख इसलिए गठनात्मक परिवर्तन के प्रति संवेदनशील अन्य प्रोटीन के बीच बातचीत की जांच करने के लिए, का मिलान मानचित्रण के लिए, उत्पादन प्रक्रियाओं के दौरान संरचना संबंधी दोष के लिए स्क्रीन पर ठीक से मुड़ा हुआ प्रोटीन की राशि, को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, के दौरान बैच की तेजी से जांच के लिए उत्पादन, नमूने है कि निकट से संबंधित प्रोटीन और कई अन्य अनुप्रयोगों के मिश्रण की शुद्धि के लिए के बारे में सोचा जा सकता है. अलग टैग के लिए आत्मीयता के साथ विभिन्न चुंबकीय मोतियों की उपलब्धता इन संभावनाओं का समर्थन करता है. हालांकि रेडियोधर्मी लेबल इन प्रयोगों में इस्तेमाल किया गया, अन्य संकेतोंका पता लगाने और फ्लोरोसेंट 13,14 रंगों की तरह बातचीत, यों लागू. कई नमूने एक प्रयोग के दौरान विश्लेषण किया जा सकता है और यह विधि को स्वचालित करने के लिए संभव है. चुंबकीय मोती इस परख में इस्तेमाल आसानी से उबलते, विपठ्ठन और उत्थान कदम है, जो यह एक सस्ता तरीका प्रदान कर सकते हैं फिर से इस्तेमाल किया जा. ऊपर तिथि करने के लिए, पांच मोतियों की इन उत्थान चक्र के परिणाम (नहीं दिखाया डेटा) के reproducibility को प्रभावित नहीं किया.

इसके अलावा, यह एक विशिष्ट पद्धति के रूप में माना जा सकता है, के बाद से विशिष्ट nanobodies कि केवल उनके प्रतिजन पहचान, के रूप में वे पोलियो वायरस एन एच प्रतिजनों और 14S सबयूनिट के साथ अलग से बातचीत कर रहे थे करने के लिए उपयोग किया जाता है.

यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि इस संबंध कब्जा चुंबकीय मोतियों का उपयोग परख संभव अनुप्रयोगों है कि विश्वसनीय, सरल, मात्रात्मक, विशिष्ट, समय की बचत और कम खर्चीली है की एक व्यापक श्रेणी के साथ एक परख है.

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Disclosures

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखक रेडियोधर्मी लेबल वायरस की तैयारी के लिए औषधि जैव प्रौद्योगिकी और आण्विक जीवविज्ञान विभाग के कर्मचारियों और विशेष रूप से Monique डी Pelsmacker धन्यवाद. हम के एलेन MERCKX और उनके दिलचस्प टिप्पणी और विचार विमर्श के लिए Hadewych Halewyck और Gerrit डी Bleeser प्रयोगशाला में उसकी मदद के लिए आभारी हैं. यह काम आर्थिक रूप से Vrije Universiteit Brussel (OZR1807), Fonds वूर Wetenschappelijk Onderzoek से Vlaanderen (G.0168.10N) और विश्व स्वास्थ्य संगठन (200,410,791 टीएसए) का एक OZR अनुदान द्वारा समर्थित किया गया. Lise SCHOTTE Fonds वूर Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO) के predoctoral साथी है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dynabeads His-Tag Isolation and Pulldown Invitrogen 101.03D Magnetic beads
Optiphase ’HiSafe’ 2 PerkinElmer, Inc. 1200 - 436 Scintillation fluid

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References

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एक तरल चरण आत्मीयता कब्जा चुंबकीय मोती का उपयोग करने के लिए प्रोटीन से प्रोटीन सहभागिता अध्ययन परख: उदाहरण पोलियो वायरस Nanobody
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Schotte, L., Rombaut, B., Thys, B. A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example. J. Vis. Exp. (63), e3937, doi:10.3791/3937 (2012).More

Schotte, L., Rombaut, B., Thys, B. A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example. J. Vis. Exp. (63), e3937, doi:10.3791/3937 (2012).

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