단백질 - 단백질 상호 작용 연구를 자성 비즈를 사용하여 액상 동질 캡처 분석 : Poliovirus-Nanobody의 예
Summary
이 문서에서는 단순 양적, 액상 친화 캡쳐 분석이 제공됩니다. 그것은 한 손으로 그리고 다른 한편으로는 태그를 단백질과 두 번째 레이블이 붙은 단백질 (예 : poliovirus) 간의 친화력에 자석 구슬 및 태그 단백질 (예 : nanobodies) 사이의 상호 작용을 기반으로 안정적인 기술입니다.
Abstract
이 문서에서는 단순 양적, 액상 친화 캡쳐 분석이 제공됩니다. 한 단백질이 태그를 수 있도록 제공하여 다른 단백질이 라벨이 방법은 단백질 – 단백질 상호 작용 조사하기 위해 구현할 수 있습니다. 그것은 코발트 코팅 자성 구슬에 의해 태그가 단백질의 인식을하고 태그를 단백질과 레이블이 붙은 두 번째 특정 단백질 간의 상호 작용에있는 반면에 손을 대어를 기준으로합니다. 첫째, 라벨 및 태그 단백질을 섞어 실온에서 incubated됩니다. 태그를 인식 자석 구슬은, 추가하고 레이블이 단백질의 바운드 분율은 자석을 사용하여 언바운드 분획에서 분리됩니다. 캡처되는 분류 단백질의 양은 언바운드 분율에 남아 표시된 단백질의 신호를 측정하여 간접적 방법으로 결정될 수있다. conformational 변환 민감한 단백질 엉덩이가되었을 때 설명한 액체 위상 선호도 분석은 매우 유용합니다ayed. 분석의 개발 및 응용 프로그램은 poliovirus 및 nanobodies 1을 인식 poliovirus 간의 상호 작용에 대해 증명하고 있습니다. poliovirus는 단단한 표면 (미발표 결과)에 연결된 conformational 변환 2 ~ 민감한이므로 엘리사의 사용은 제한되며 액상 기반의 시스템은 따라서 선호한다. 자주 polioresearch 3,4에 사용되는 액상 기반 시스템의 예는 마이크로 단백질-immunoprecipitation 시험 5. 이 테스트는 적용을 입증하고있다하더라도, 그것은 6,7 nanobodies에 결석 FC-구조를 필요로합니다. 그러나 또 다른 기회로,이 흥미로운 안정 단일 도메인 항체 8은 쉽게 다른 태그로 조작 할 수 있습니다. 광범위하게 (그의) 6 태그와 같은 자신의 차례에 쉽게 자석 구슬에 코팅 수 니켈이나 코발트와 같은 이가 이온에 대한 친화력을 보여줍 사용됩니다. 따라서 우리는이 간단한 양적 개발친화 캡쳐 분석은 코발트 코팅 자석 구슬을 바탕으로. Poliovirus은 nanobodies과 unhindered 상호 작용을 가능하게하고 정량 검출이 가능하도록 35 S로 분류되었다. 방법은 수행이 용이하고 더 효과적으로 재생 자석 구슬의 가능성에 의해 지원되는 저렴한 비용으로 작성할 수도 있습니다.
Protocol
Discussion
프로토콜에서 nanobody 상호 작용 항원의 방사능이 뜨는에서 radiolabeled 바이러스의 손실로 정의됩니다. 따라서 시켰던 방사능 (= 100 – %)의 금액은 (자성 비즈에 바인딩) 뜨는 (= %)에서 방사능에 의해 간접적인 방법으로 추정됩니다. 한편 500 MM 이미다졸으로 자기 구슬에서 immunocomplexes를 eluting하여 직접적인 방법으로 항원의 시켰던 바운드 분수의 방사능을 측정하는 것도 가능합니다. 그것은 이전에 방…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자 방사성 레이블 바이러스의 준비를 위해 제약 생명 공학 및 분자 생물학의학과, 특히 모니크 드 Pelsmacker의 직원을 감사드립니다. 우리는 엘렌 Merckx하고 흥미로운 발언 및 토론을위한 Hadewych Halewyck과 실험실에서 그의 도움을 Gerrit 드 Bleeser에 감사를드립니다. 이 작품은 재정적 Vrije Universiteit Brussel (OZR1807), Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (G.0168.10N)와 세계 보건기구 (TSA 200,410,791)의 OZR의 교부금에 의해 지원되었다. 리자 Schotte는 Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO)의 predoctoral 동료입니다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Dynabeads His-Tag Isolation and Pulldown | Invitrogen | 101.03D | Magnetic beads |
| Optiphase ‘HiSafe’ 2 | Perkin Elmer | 1200 – 436 | Scintillation fluid |
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