En vätskefas affinitetsinfångning Analys med användning av magnetiska pärlor för att studera protein-proteininteraktion: polioviruset-Nanobody Exempel
Summary
I denna artikel är en enkel, kvantitativ, vätskefas affinitetsinfångning analys presenteras. Det är en tillförlitlig teknik baserad på interaktionen mellan magnetiska pärlor och märkta proteiner (t.ex. nanobodies) å ena sidan och affiniteten mellan den märkta proteinet och en andra, märkt protein (t. ex poliovirus) på den andra.
Abstract
I denna artikel är en enkel, kvantitativ, vätskefas affinitetsinfångning analys presenteras. Förutsatt att ett protein kan märkas och ett annat protein märkt, kan denna metod implementeras för undersökning av protein-proteininteraktioner. Det är baserat på ena sidan om ett erkännande av det märkta proteinet genom kobolt-belagda magnetiska pärlor och å andra sidan på interaktionen mellan det märkta proteinet och en andra specifikt protein som är märkt. Första, de märkta och märkta proteiner blandades och inkuberades vid rumstemperatur. De magnetiska pärlor, som känner igen den tagg, tillsätts och den bundna fraktionen av märkt protein separeras från den obundna fraktionen med användning av magneter. Mängden av märkt protein som är fångade kan bestämmas på ett indirekt sätt genom att mäta signalen från det märkta proteinet förblev i den obundna fraktionen. Den beskrivna vätskefas affinitet analys är mycket användbart när strukturella omvandling känsliga proteiner assayed. Utvecklingen och tillämpningen av analysen visas för interaktionen mellan poliovirus och poliovirus erkänna nanobodies 1. Eftersom poliovirus är känslig för konformationsförändring omvandlingen 2 när den är bunden till en fast yta (opublicerade resultat), är användning av ELISA begränsad och en flytande fas system bör därför vara att föredra. Ett exempel på en flytande fas system används ofta i polioresearch 3,4 är den mikro protein A-immunoutfällning testet 5. Även om detta test har visat dess tillämpbarhet, kräver det en Fc-struktur, vilket är frånvarande i de nanobodies 6,7. Men som en annan möjlighet, kan dessa intressanta och stabil gemensam-domän-antikroppar 8 enkelt konstruerad med olika taggar. Den allmänt använda (His) 6-taggen visar affinitet för tvåvärda joner, såsom nickel eller kobolt, som kan på sin tur lätt beläggs på magnetiska pärlor. Vi utvecklade därför denna enkla kvantitativaaffinitetsinfångning analys baserad på kobolt-belagda magnetiska pärlor. Poliovirus märktes med 35 S för att obehindrat samverkan med nanobodies och göra en kvantitativ detektering möjligt. Metoden är enkel att utföra och kan fastställas med en låg kostnad, som stöds ytterligare av det möjligt att effektivt regenerera de magnetiska pärlorna.
Protocol
Discussion
I protokollet, är radioaktiviteten av antigenet interagera med nanobody definieras som förlust av radiomärkt virus från supernatanten. Därför mängden utfälld radioaktivitet (= 100 – en%) (bundet till de magnetiska pärlorna) kan beräknas på ett indirekt sätt av radioaktiviteten i supernatanten (= en%). Å andra sidan är det också möjligt att mäta radioaktiviteten av den utfällda bundna fraktionen av antigen i ett direkt sätt genom eluering av immunkomplexen från de magnetiska pärlorna med 500 mM imida…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar personalen för avdelningen för farmaceutisk bioteknik och molekylärbiologi och speciellt Monique De Pelsmacker för beredning av den märkta radioaktiva viruset. Vi är tacksamma för Ellen Merckx och Hadewych Halewyck för deras intressanta kommentarer och diskussioner och Gerrit De Bleeser för hans hjälp i labbet. Detta arbete stöds ekonomiskt av en OZR beviljandet av Vrije Universiteit Brussel (OZR1807), Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (G.0168.10N) och Världshälsoorganisationen (TSA 200.410.791). Lise Schotte är en predoctoral Fellow vid Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Dynabeads His-Tag Isolation and Pulldown | Invitrogen | 101.03D | Magnetic beads |
| Optiphase ‘HiSafe’ 2 | Perkin Elmer | 1200 – 436 | Scintillation fluid |
References
- Thys, B., Schotte, L., Muyldermans, S., Wernery, U., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. In vitro antiviral activity of single domain antibody fragments against poliovirus. Antiviral Res. 87, 257-264 (2010).
- Meloen, R. H., Briaire, J. A study of the cross-reacting antigens on the intact foot-and-mouth disease virus and its 12S subunits with antisera against the structural proteins. J. Gen. Virol. 51, 107-116 (1980).
- Vrijsen, R., Rombaut, B., Boeye, A. A simple quantitative protein A micro-immunoprecipitation method: assay of antibodies to the N and H antigens of poliovirus. J. Immunol. Methods. 59, 217-220 (1983).
- Rombaut, B., Jore, J., Boeye, A. A competition immunoprecipitation assay of unlabeled poliovirus antigens. J. Virol. Methods. 48, 73-80 (1994).
- Kessler, S. W. Rapid isolation of antigens from cells with a staphylococcal protein A-antibody adsorbent: parameters of the interaction of antibody-antigen complexes with protein A. J. Immunol. 115, 1617-1624 (1975).
- Hamers-Casterman, C., Atarhouch, T., Muyldermans, S., Robinson, G., Hamers, C., Songa, B. a. j. y. a. n. a., Bendahman, E., N, ., Hamers, R. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
- Arbabi Ghahroudi, M., Desmyter, A., Wyns, L., Hamers, R., Muyldermans, S. Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies. FEBS Lett. 414, 521-526 (1997).
- Muyldermans, S. Single domain camel antibodies: current status. Rev. Mol. Biotechnol. 74, 277-302 (2001).
- Rombaut, B., Vrijsen, R., Boeye, A. Epitope evolution in poliovirus maturation. Arch. Virol. 76, 289-298 (1983).
- Brioen, P., Sijens, R. J., Vrijsen, R., Rombaut, B., Thomas, A. A., Jackers, A., Boeye, A. Hybridoma antibodies to poliovirus N and H antigen. Arch. Virol. 74, 325-330 (1982).
- Thys, B., Saerens, D., Schotte, L., De Bleeser, G., Muyldermans, S., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. A simple quantitative affinity capturing assay of poliovirus antigens and subviral particles by single-domain antibodies using magnetic beads. J. Virol. Methods. 173, 300-305 (2011).
- Wild, D. . The Immunoassay Handbook. , (2005).
- Kremser, L., Konecsni, T., Blaas, D., Kenndler, E. Fluorescence labeling of human rhinovirus capsid and analysis by capillary electrophoresis. Anal. Chem. 76, 4175-4181 (2004).
- Pelkmans, L., Kartenbeck, J., Helenius, A. Caveolar endocytosis of simian virus 40 reveals a new two-step vesicular-transport pathway to the ER. Nat. Cell Biol. 3, 473-483 (2001).
