Hydrofobe Salt gemodificeerde Nafion voor enzym immobilisatie en stabilisatie
Summary
Dit artikel beschrijft de procedure voor het synthetiseren een hydrofobisch gemodificeerd Nafion enzym immobilisatie membraan en hoe eiwitten en / of enzymen te immobiliseren in de membraan en testen hun specifieke activiteit.
Abstract
In de afgelopen tien jaar is er een schat aan aanvraag voor geïmmobiliseerde enzymen en gestabiliseerd inclusief biokatalyse, biosensoren, en biobrandstof cellen. 1-3 In de meeste bioelectrochemical toepassingen worden enzymen of organellen geïmmobiliseerd op een elektrode-oppervlak met het gebruik van een soort van polymeermatrix. Dit polymeer steiger te houden enzymen stabiel zijn voor de gemakkelijke diffusie van moleculen en ionen in en uit de matrix. De polymeren die voor dit type immobilisatie gebaseerd op polyaminen of polyalcoholen – polymeren die de natuurlijke omgeving van de enzymen die Zij bevatten en stabiliseren het enzym door waterstof of ionische bindingskracht nabootsen. Een andere methode voor het stabiliseren enzymen is het gebruik van micellen die hydrofobe gebieden die ingekapseld en stabiliseren enzymen bevatten. 4,5 name heeft de Minteer groep een micellaire polymeer gebaseerd op commercieel verkrijgbare Nafion. 6,7 Nafionzelf een micellaire polymeer waarmee het kanaal ondersteunde diffusie van protonen en andere kleine kationen, maar de micellen en kanalen zeer klein en het polymeer is erg zuur door sulfonzuur zijketens die ongunstig is voor enzyme immobilisatie. Wanneer echter Nafion wordt gemengd met een overmaat van het hydrofobe alkyl ammoniumzouten zoals tetrabutylammoniumbromide (TBAB), de quaternaire ammonium kationen vervangen protonen en wordt de tegenionen van de sulfonaatgroepen van het polymeer zijketens (figuur 1). Dit resulteert in grotere micellen en kanalen in het polymeer waarmee de verspreiding van grote substraten en ionen die nodig zijn voor enzymatische functie zoals nicotinamide adenine dinucleotide (NAD). Deze gewijzigde Nafion polymeer werd gebruikt om verschillende soorten enzymen en mitochondriën immobiliseren voor gebruik in biosensoren en biobrandstof cellen. 8-12 Dit document beschrijft een nieuwe procedure voor deze micellar polymeer enzym immobilisatie membraan dat kan stabiliseren enzymen. De synthese van de micellaire enzym immobilisatie membraan de procedure voor het immobiliseren enzymen in het membraan en de assays voor het bestuderen enzymatische specifieke activiteit van het geïmmobiliseerde enzym worden hieronder beschreven.
Protocol
Discussion
In de beschreven procedure worden tetra-alkyl ammoniumzouten gebruikt om commerciële Nafion wijzigen om micellaire polymeren die kunnen worden gebruikt immobiliseren en stabiliseren enzymen te maken. De assays beschreven in de procedure zien dat het polymeer kan worden gebruikt om een groot aantal enzymen te immobiliseren met een hoge retentie activiteit. Als het enzym van belang heeft een zeer lage activiteit of onzuiver is, kan een hogere concentratie nodig zijn en mag geen invloed hebben op de immobilisatie pr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen de Office of Naval Research, Verenigde Soja Board, en de National Science Foundation voor financiering.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number |
| Nafion | Sigma-Aldrich | 70160 |
| Tetra alkylammonium bromide salts | Sigma-Aldrich | n/a |
| Alcohol dehydrogenase | Sigma-Aldrich | A3263 |
| Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) | Simga-Aldrich | N7004 |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich | P8010 |
| Phenazine methosulfate (PMS) | Sigma-Aldrich | P9625 |
| 2,6-Dichloroindophenol (DCIP) | Sigma-Aldrich | D1878 |
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G7141 |
| 4-Hydroxybenzoic acid | Sigma-Aldrich | 240141 |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 |
| Peroxidase | Sigma-Aldrich | P8375 |
| 4-aminoantipyrine | Sigma-Aldrich | 06800 |
| UV/Vis Spectrophotometer | Thermo | Evolution 260 Bio or Spectronic Genesys 20 |
| Vortex Genie | ||
| Analytical balance |
References
- Calabrese-Barton, S., Gallaway, J., Atanassov, P. Enzymatic biofuel cells for implantable and microscale devices Chem. Rev. 104, 4867-4886 (2004).
- Cracknell, J. A., Vincent, K. A., Armstrong, F. A. Enzymes as Working or Inspirational Electrocatalysts for Fuel Cells and Electrolysis. Chem. Rev. 108, 2439-2461 (2008).
- Minteer, S. D., Liaw, B. Y., Cooney, M. J. Enzyme-Based Biofuel Cells. Curr. Opin. Biotechnol. 18, 228-234 (2007).
- Callahan, J. W., Kosicki, G. W. The Effect of Lipid Micelles on Mitochondrial Malate Dehydrogenase. Canadian Journal of Biochemistry. 45, 839-851 (1967).
- Martinek, K. Modeling of the Membrane Environment of Enzymes: Superactivity of Laccase Entrapped into Surfactant Reversed Micelles in Organic Solvents. Biokhimiya. 53, 1013-1016 (1988).
- Moore, C. M., Akers, N. L., Hill, A. D., Johnson, Z. C., Minteer, S. D. Improving the Environment for Immobilized Dehydrogenase Enzymes by Modifying Nafion with Tetraalkylammonium Bromides. Biomacromolecules. 5, 1241-1247 (2004).
- Schrenk, M. J., Villigram, R. E., Torrence, N. J., Brancato, S. J., Minteer, S. D. Effects of Mixture Casting Nafion with Quaternary Ammonium Bromide Salts on the Ion-Exchange Capacity and Mass Transport in the Membranes. J. Membr. Sci. 205, 3-10 (2002).
- Akers, N. L., Moore, C. M., Minteer, S. D. Development of Alcohol/O2 Biofuel Cells Using Salt-Extracted Tetrabutylammonium Bromide/Nafion Membranes to Immobilize Dehydrogenase Enzymes. Electrochim. Acta. 50, 2521-2525 (2005).
- Sokic-Lazic, D., Minteer, S. D. Citric Acid Cycle Biomimic on a Carbon Electrode. Biosens. Bioelectron. 24, 939-944 (2008).
- Arechederra, R. L., Minteer, S. D. Complete Oxidation of Glycerol in an Enzymatic Biofuel Cell. Fuel Cells. 9, 63-69 (2009).
- Germain, M., Arechederra, R. L., Minteer, S. D. Nitroaromatic Actuation of Mitochondrial Bioelectrocatalysis for Self-Powered Explosive Sensors. J. Am. Chem. Soc. 130, 15272-15273 (2008).
- Addo, P. K., Arechederra, R. L., Minteer, S. D. Evaluating Enzyme Cascades for Methanol/Air Biofuel Cells Based On NAD+-Dependent Enzymes. Electroanalysis. 22, 807-812 (2010).
- Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, M. D., Fujimoto, E. K., Goeke, N. M., Olson, B. J., Klenk, D. C. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150, 76-85 (1985).
