Enzim immobilizasyonu ve stabilizasyonu için hidrofobik Tuz-modifiye Nafion
Summary
Bu makale, hidrofobik olarak modifiye edilmiş Nafion enzim immobilizasyon membranı ve nasıl membran içindeki protein ve / veya enzim hareketsiz ve spesifik aktivite için test etmek için sentez prosedürü tarif edecektir.
Abstract
Son on yılda, biyokataliz, biyosensörler ve biyo yakıt pilleri de dahil olmak üzere tutuklanmış ve stabilize enzimleri için uygulama bir zenginlik olmuştur. En bioelectrochemical uygulamalarda 1-3, enzim veya organel bir çeşit kullanımı ile bir elektrot yüzeyine immobilize edilir polimer. Bu polimer iskele enzimler stabil tutmak ve matriks dışında molekül ve iyonları basit difüzyon için izin vermelidir. Immobilizasyon bu tür polimerler için kullanılan en poliaminler ya polialkollerdir dayanmaktadır – bunlar, hidrojen veya iyonik bağ yoluyla enzim saklanması ve stabilize bu enzimin doğal ortamda taklit eden polimerler. Enzimlerin stabilitesi için başka bir yöntem enzimler saklanması ve stabilize hidrofobik bölgeler içermesi miseller, kullanımını içerir. Özellikle 4,5, Minteer grubu, piyasada bulunan Nafion dayanan bir micellar polimer geliştirmiştir. 6,7 Nafionkendisi proton ve diğer küçük katyonlar arasında kanalı-assisted difüzyonu için izin veren bir micellar polimer, fakat miselleri ve kanallar son derece küçük olduğu ve polimer enzim harekersizliği için elverişsiz olduğu sülfonik asit yan zincirleri, nedeniyle çok asittir. Bununla birlikte, bu tür Nafion tetrabutilamonyum bromür (TBAB) gibi hidrofobik alkil amonyum tuzları bir fazlası ile karıştırıldığı zaman, kuaterner amonyum katyonları ve proton yerine polimer yan zincirleri (Şekil 1) üzerine sülfonat gruplarına karşı iyonların hale gelir. Böyle nikotinamid adenin dinükleotid (NAD) gibi enzimatik işlevi için gerekli olan geniş bir substrat ve iyon difüzyonu için izin vermek polimer içindeki büyük miselleri ve kanalları ile sonuçlanır. Bu modifiye Nafion polimer biyosensör ve biyo hücreleri kullanılmak üzere pek çok değişik enzim türleri gibi mitokondri immobilize etmek için kullanılmaktadır. 8-12 Bu kağıt Bu mikrofon yapmak için yeni bir yöntem açıklanmaktadırenzimler stabilize ellar polimer enzim immobilizasyon membran. Misel enzim immobilizasyon membran, membran içindeki enzimler immobilizing için prosedür ve immobilize enzimin enzim spesifik aktivitesi eğitimi için tahlillerin sentezi aşağıda ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
Protocol
Discussion
Açıklanan prosedür içinde, tetra-alkil amonyum tuzları enzimler hareketsiz ve stabilize etmek için kullanılabilir micellar polimerler oluşturmak için ticari Nafion değiştirmek için kullanılır. Testler polimer aktivitesi yüksek bir tutma ile enzimler çeşitli immobilize etmek için kullanılan bir prosedürü göstermektedir tarif. Söz konusu enzimi çok düşük bir aktiviteye sahiptir veya saf olmayan ise, daha yüksek bir konsantrasyonu gerekli olabilir ve 10 mg / ml 'den daha büyük konsantrasyo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Donanma Araştırma, Birleşik Soya Kurulu ve finansmanı için Ulusal Bilim Vakfı Office kabul ederler.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number |
| Nafion | Sigma-Aldrich | 70160 |
| Tetra alkylammonium bromide salts | Sigma-Aldrich | n/a |
| Alcohol dehydrogenase | Sigma-Aldrich | A3263 |
| Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) | Simga-Aldrich | N7004 |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich | P8010 |
| Phenazine methosulfate (PMS) | Sigma-Aldrich | P9625 |
| 2,6-Dichloroindophenol (DCIP) | Sigma-Aldrich | D1878 |
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G7141 |
| 4-Hydroxybenzoic acid | Sigma-Aldrich | 240141 |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 |
| Peroxidase | Sigma-Aldrich | P8375 |
| 4-aminoantipyrine | Sigma-Aldrich | 06800 |
| UV/Vis Spectrophotometer | Thermo | Evolution 260 Bio or Spectronic Genesys 20 |
| Vortex Genie | ||
| Analytical balance |
References
- Calabrese-Barton, S., Gallaway, J., Atanassov, P. Enzymatic biofuel cells for implantable and microscale devices Chem. Rev. 104, 4867-4886 (2004).
- Cracknell, J. A., Vincent, K. A., Armstrong, F. A. Enzymes as Working or Inspirational Electrocatalysts for Fuel Cells and Electrolysis. Chem. Rev. 108, 2439-2461 (2008).
- Minteer, S. D., Liaw, B. Y., Cooney, M. J. Enzyme-Based Biofuel Cells. Curr. Opin. Biotechnol. 18, 228-234 (2007).
- Callahan, J. W., Kosicki, G. W. The Effect of Lipid Micelles on Mitochondrial Malate Dehydrogenase. Canadian Journal of Biochemistry. 45, 839-851 (1967).
- Martinek, K. Modeling of the Membrane Environment of Enzymes: Superactivity of Laccase Entrapped into Surfactant Reversed Micelles in Organic Solvents. Biokhimiya. 53, 1013-1016 (1988).
- Moore, C. M., Akers, N. L., Hill, A. D., Johnson, Z. C., Minteer, S. D. Improving the Environment for Immobilized Dehydrogenase Enzymes by Modifying Nafion with Tetraalkylammonium Bromides. Biomacromolecules. 5, 1241-1247 (2004).
- Schrenk, M. J., Villigram, R. E., Torrence, N. J., Brancato, S. J., Minteer, S. D. Effects of Mixture Casting Nafion with Quaternary Ammonium Bromide Salts on the Ion-Exchange Capacity and Mass Transport in the Membranes. J. Membr. Sci. 205, 3-10 (2002).
- Akers, N. L., Moore, C. M., Minteer, S. D. Development of Alcohol/O2 Biofuel Cells Using Salt-Extracted Tetrabutylammonium Bromide/Nafion Membranes to Immobilize Dehydrogenase Enzymes. Electrochim. Acta. 50, 2521-2525 (2005).
- Sokic-Lazic, D., Minteer, S. D. Citric Acid Cycle Biomimic on a Carbon Electrode. Biosens. Bioelectron. 24, 939-944 (2008).
- Arechederra, R. L., Minteer, S. D. Complete Oxidation of Glycerol in an Enzymatic Biofuel Cell. Fuel Cells. 9, 63-69 (2009).
- Germain, M., Arechederra, R. L., Minteer, S. D. Nitroaromatic Actuation of Mitochondrial Bioelectrocatalysis for Self-Powered Explosive Sensors. J. Am. Chem. Soc. 130, 15272-15273 (2008).
- Addo, P. K., Arechederra, R. L., Minteer, S. D. Evaluating Enzyme Cascades for Methanol/Air Biofuel Cells Based On NAD+-Dependent Enzymes. Electroanalysis. 22, 807-812 (2010).
- Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, M. D., Fujimoto, E. K., Goeke, N. M., Olson, B. J., Klenk, D. C. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150, 76-85 (1985).
