Idrofobo Salt-modificato Nafion per l'immobilizzazione degli enzimi e la stabilizzazione
Summary
Questo articolo descrive la procedura di sintesi di un enzima modificato in modo idrofobo membrana Nafion immobilizzazione e come immobilizzare proteine e / o enzimi all'interno della membrana e verificare la loro attività specifica.
Abstract
Negli ultimi dieci anni, c'è stata una ricchezza di domanda di enzimi immobilizzati e stabilizzati tra biocatalisi, biosensori, e le cellule di biocarburanti. 1-3 In maggior parte delle applicazioni bioelectrochemical, enzimi o organuli sono immobilizzati su una superficie dell'elettrodo con l'utilizzo di un certo tipo di matrice polimerica. Questa impalcatura polimero dovrebbe tenere gli enzimi stabile e consentire la facile diffusione delle molecole e ioni in e fuori dalla matrice. La maggior parte dei polimeri utilizzati per questo tipo di immobilizzazione sono basati su poliammine o polialcoli – polimeri che imitano l'ambiente naturale degli enzimi che incapsulano e stabilizzare l'enzima mediante idrogeno o legame ionico. Un altro metodo per stabilizzare gli enzimi comporta l'uso di micelle, che contengono regioni idrofobiche che può incapsulare e stabilizzare gli enzimi. 4,5 In particolare, il gruppo Minteer ha sviluppato un polimero basato su micellare Nafion commercialmente disponibili. 6,7 Nafionsi è un polimero che permette micellare del canale assistita diffusione di protoni e altri cationi piccoli, ma le micelle e canali sono estremamente piccoli e il polimero è molto acido solfonico dovuto catene laterali acide, il che è sfavorevole per l'immobilizzazione degli enzimi. Tuttavia, quando Nafion viene miscelato con un eccesso di idrofobi sali di alchilammonio quali tetrabutilammonio bromuro (TBAB), i cationi di ammonio quaternario sostituire i protoni e gli ioni diventano contatore ai gruppi solfonato sulle catene laterali polimeriche (Figura 1). Questo crea delle micelle e canali all'interno del polimero che consentono la diffusione di grandi substrati e ioni che sono necessari per la funzione enzimatica come nicotinammide adenin dinucleotide (NAD). Questo polimero Nafion modificato è stato usato per immobilizzare vari tipi di enzimi e mitocondri per l'uso in biosensori e cellule biocarburanti. 8-12 Questo documento descrive una nuova procedura per effettuare questo microfonoellar membrana polimerica immobilizzazione degli enzimi in grado di stabilizzare gli enzimi. La sintesi della membrana micellare immobilizzazione dell'enzima, la procedura per immobilizzare gli enzimi all'interno della membrana, e saggi per studiare le attività enzimatica specifica dell'enzima immobilizzato sono riportate di seguito.
Protocol
Discussion
Nel procedimento descritto, tetra-alchil ammonio vengono utilizzati per modificare Nafion commerciale per creare micellari polimeri che possono essere utilizzati per immobilizzare e stabilizzare gli enzimi. I saggi descritti nella procedura mostrano che il polimero può essere utilizzato per immobilizzare un'ampia varietà di enzimi con un'elevata ritenzione di attività. Se l'enzima di interesse ha una attività molto bassa o è impuro, una più alta concentrazione può essere richiesta e non devono inficia…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono l'Office of Naval Research, consiglio di soia Uniti, e la National Science Foundation per il finanziamento.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number |
| Nafion | Sigma-Aldrich | 70160 |
| Tetra alkylammonium bromide salts | Sigma-Aldrich | n/a |
| Alcohol dehydrogenase | Sigma-Aldrich | A3263 |
| Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) | Simga-Aldrich | N7004 |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich | P8010 |
| Phenazine methosulfate (PMS) | Sigma-Aldrich | P9625 |
| 2,6-Dichloroindophenol (DCIP) | Sigma-Aldrich | D1878 |
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G7141 |
| 4-Hydroxybenzoic acid | Sigma-Aldrich | 240141 |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 |
| Peroxidase | Sigma-Aldrich | P8375 |
| 4-aminoantipyrine | Sigma-Aldrich | 06800 |
| UV/Vis Spectrophotometer | Thermo | Evolution 260 Bio or Spectronic Genesys 20 |
| Vortex Genie | ||
| Analytical balance |
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