Summary
En este artículo se describe el procedimiento para la síntesis de una enzima modificada hidrófobamente membrana Nafion inmovilización y cómo inmovilizar las proteínas y / o enzimas dentro de la membrana y probar su actividad específica.
Abstract
Durante la última década, ha habido una gran cantidad de solicitud de enzimas inmovilizadas y estabilizado incluyendo biocatálisis, biosensores, y las células de biocombustible. 1-3 En aplicaciones más bioelectrochemical, enzimas u orgánulos se inmovilizan sobre una superficie del electrodo con el uso de algún tipo de polímero de matriz. Este andamio polímero debe mantener las enzimas estable y permitir la difusión superficial de las moléculas y los iones en y fuera de la matriz. La mayoría de los polímeros utilizados para este tipo de inmovilización se basan en poliaminas o polialcoholes - polímeros que imitan el entorno natural de las enzimas que se encapsulan y estabilizar la enzima a través de hidrógeno o un enlace iónico. Otro método para estabilizar las enzimas implica el uso de micelas, que contienen regiones hidrofóbicas que pueden encapsular y estabilizar las enzimas 4,5. En particular, el grupo Minteer ha desarrollado un polímero basado en micelar Nafion comercialmente disponible. 6,7 Nafionen sí es un polímero micelar que permite la difusión del canal con ayuda de protones y otros cationes pequeños, pero las micelas y los canales son extremadamente pequeñas y el polímero es muy ácida debido a las cadenas laterales de ácido sulfónico, que es desfavorable para la inmovilización de enzimas. Sin embargo, cuando Nafion se mezcla con un exceso de sales de amonio hidrófobos alquilo tales como bromuro de tetrabutilamonio (BTBA), los cationes de amonio cuaternario reemplazar los protones y se convierten en los contra-iones de los grupos sulfonato en las cadenas laterales del polímero (Figura 1). Esto se traduce en mayores micelas y canales dentro del polímero que permiten la difusión de sustratos grandes e iones que son necesarios para la función enzimática, tales como nicotinamida adenina dinucleótido (NAD). Esta modificación Nafion polímero se ha utilizado para inmovilizar muchos tipos diferentes de enzimas, así como las mitocondrias para su uso en biosensores y células de combustible biológico. 8-12 Este artículo describe un nuevo procedimiento para la fabricación de este micrófonoEllar enzima polímero inmovilización membrana que puede estabilizar las enzimas. La síntesis de la membrana de inmovilización de enzimas micelar, el procedimiento para inmovilizar enzimas dentro de la membrana, y los ensayos para estudiar la actividad enzimática específica de la enzima inmovilizada se detallan a continuación.
Protocol
1. Modificación de Nafion con sales de amonio cuaternario
- Agitar una botella de suspensión Nafion 5% w / v vigorosamente durante aprox. 30 segundos para asegurar que Nafion está suspendida de manera uniforme en la solución.
- Pipetear a cabo 2 ml de la Nafion ahora re-suspendido en un vial de vidrio (volumen vial podría contener de 2,5 ml a 10 ml).
- Medir un exceso molar de 3 veces (en relación con los grupos ácidos sulfónicos en el polímero Nafion) de la sal de amonio bromuro de alquilo (masas apropiadas se muestran en la Tabla 1) y añadir esta al vial que contiene el 2 ml de Nafion.
- Vórtice del vial a 1500 rpm durante 10-15 minutos.
- Vierta la solución viscosa en una bandeja de plástico un peso que mide aprox. 3 x 3 cm, y utilizar una pipeta para transferir cualquier solución residual del vial a la bandeja de pesaje.
- Permitir los disolventes que se evapore de la barca pesan, dejando un color amarillo / marrón, película transparente en la parte inferior de la bandeja de pesaje (FiFigura 2). La tasa de evaporación del disolvente debe ser tal que se necesita más de 6 horas durante todo el disolvente se evapore. Si el solvente se evapora demasiado rápido, un material blanco, crujiente formará en lugar de una película transparente que indica que la estructura micelar del polímero ha sido destruido, y debe volver a iniciar el procedimiento. Si la evaporación del disolvente es demasiado lento, un deshumidificador puede ser necesario, debido a la evaporación demasiado lenta por lo general conduce a un gel pegajoso, de color naranja y debe volver a iniciar el procedimiento. Los rangos típicos de temperatura para la evaporación del disolvente son 20 a 37 ° C. Las condiciones reales para el secado son una función de la humedad relativa y temperatura de la habitación, pero es importante que el secado es lento para mantener la estructura micelar, pero no demasiado lento para permitir la formación de gel.
- Llenar el bote con un peso 18M Ωcm agua desionizada (10-20 ml de agua), tapar y dejar en remojo durante 12-24 horas para eliminar el exceso de sales de bromuro de alquil amonio y HBr.
- Permitir la bandeja de pesaje para sentarse cubierto hasta que el polímero está completamente seco En este punto, el polímero debe ser una película de plástico transparente y quebradizo algo. De nuevo, si el aire es muy húmedo, un deshumidificador puede ser necesario para completar la evaporación de una manera oportuna.
- Usando una espátula, retire con cuidado la película seca de la bandeja de pesaje y la transfiere en un frasco de vidrio limpio.
- Añadir 2 ml de etanol y 3 perlas de mezcla de cerámica, y vórtice durante 4 horas o hasta que la película de polímero está completamente re-suspendido.
2. La inmovilización de las enzimas en TBAB-Modified Nafion de Ensayos de actividad
- Para una enzima seca, pésese 1-10 mg de la enzima en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, y se añade 1 ml de 100 mM de tampón fosfato de pH 7 para crear un 1-10 mg / ml de solución enzimática. For una enzima que está en solución, utilizar un ácido bicinconínico (BCA) ensayo 13 para determinar la cantidad de proteína, y añadir una cantidad apropiada de tampón fosfato 100 mM a reducir la concentración de proteína a 1-10 mg / ml. Ml 1-10 mg / normalmente corresponde a 1-50 nanomoles por ml.
- Para 120 l de la de 1 mg / ml de solución enzimática, añadir 60 l de la solución Nafion alquilo amonio-modificado, y vórtice durante 10 segundos. (Esta mezcla puede ser ampliado para un gran número de repeticiones. Mantener la relación de solución de enzima a polímero a 2:1.)
- Pipeta 60 l de la solución de enzima / polímero en la parte inferior de 3 separados 1 cm 2 cubetas, y dejar secar durante la noche.
3. Ensayo de la enzima inmovilizada deshidrogenasa NAD-dependiente
- Para la cubeta, añadir 1,3 ml de 50 mM de pirofosfato de sodio (pH 8,8), 1,5 ml de 15 mM de NAD (recién preparada) y 0,1 ml de agua.
- Coloque la cubeta en un espectrofotómetro UV / Vis (Evolut ThermoScientific es decir,iones de Bio 260 y Thermo Spectronic Genesys 20) establece en una longitud de onda de 340 nm.
- Poner a cero el espectrómetro y, a continuación, añadir 0,1 ml de etanol. Mezcle los reactivos pipeteando suavemente la solución arriba y hacia abajo 5 veces. Para un blanco, utilizar 0,1 ml de agua adicional en lugar de la 0,1 ml de etanol.
- Anotar la absorbancia a 340 nm a 5 minutos después de que los reactivos se añadieron a la cubeta y 20 minutos después. Trazar los dos puntos de datos para conseguir una pendiente que puede ser utilizado para los cálculos de actividad.
4. Ensayo de inmovilizados PQQ-deshidrogenasas dependientes
- Para la cubeta, añadir 1,5 ml de fosfato sódico (pH 7,3) y 200 l de 600 uM PMS.
- Colocar la cubeta en un espectrofotómetro UV / Vis establece en una longitud de onda de 600 nm y luego ajustar el cero del espectrómetro.
- Añadir 100 l de 700 l DCIP y 200 l de sustrato de interés (etanol, acetaldehído, glicerol, glucosa, o gliceraldehído), y mezclar los reactivos pipeteando suavemente la solutión arriba y hacia abajo 5 veces. Para un blanco, utilice 200 l de agua en lugar del substrato de interés.
- Anotar la absorbancia a 600 nm a 5 minutos después de que los reactivos se añadieron a la cubeta y 20 minutos después.
5. Ensayo de glucosa oxidasa inmovilizada
- Para la cubeta, añadir 2,0 ml de una solución que contiene 0,2 M ácido p-hidroxibenzoico, 0,02% (w / v) de azida de sodio, 128 U de peroxidasa, 0,3 mM de 4-aminoantipirina, 1 M de fosfato de potasio, y 50 mM de glucosa. Mezclar la solución con la pipeta hacia arriba y abajo 5 veces.
- Colocar la cubeta en un conjunto espectrofotómetro UV / Vis a una longitud de onda de 510 nm.
- Leer la absorbancia a 510 nm a 5 minutos después de que los reactivos se añadieron a la cubeta y de nuevo a 20 minutos después.
6. Los resultados representativos
La estructura micelar del polímero Nafion modificado puede ser interrumpido por el secado de la sal original / polímero fundido co-película también fast. La figura 2 muestra una mezcla de sal / polímero que se ha secado correctamente resultante en una película transparente, de color marrón claro. Una película que se seca demasiado rápido puede resultar en escamas blancas opacas, de polímero debido al hecho de que el proceso de secado puede destruir la estructura micelar.
Una vez que la modificación Nafion polímero y la enzima se han mezclado y co-vierte sobre el fondo de una cubeta, los ensayos de actividad enzimática se puede utilizar para evaluar la estabilidad de la enzima dentro de la película de polímero. Tablas 2-4 muestran los resultados del ensayo de dos enzimas deshidrogenasa y glucosa oxidasa inmovilizada en varias películas Nafion modificados, respectivamente. Nótese la mayor actividad de las enzimas que están inmovilizadas vs las enzimas en solución tampón, que muestra que los polímeros modificados Nafion puede realmente aumentar la actividad de ciertas enzimas (llamado superactivity). Otras enzimas tienen limitaciones de transporte que disminuyen su actividad específica, cuando inmovilizarlos en el polímero (es decir, celulasas y amilasas, cuyos sustratos son macromoléculas bastante grande).
| Sal de amonio cuaternario usado | 3 veces el exceso |
| T3A (bromuro de tetrapropilamonio) | 32,37 mg / ml |
| TBAB (bromuro de tetrabutilamonio) | 39,19 mg / ml |
| TPAB (bromuro de tetrapentilamonio) | 46,01 mg / ml |
| TEHA (bromuro de triethylhexylammonium) | 32,37 mg / ml |
| TMHA (bromuro de trimethylhexylammonium) | 27,25 mg / ml |
| TMOA (bromuro de trimethyloctylammonium) | 30,66 mg / ml |
| TMDA (bromuro de trimethyldecylammonium) | 34,07 mg / ml |
| TMDDA (bromuro de trimethyldodecylammonium) | 37,48 mg / ml |
| TMTDA (bromuro de trimethyltetradecylammonium) | |
| TMHDA (bromuro de trimethylhexadecylammonium) | 44,31 mg / ml |
| TMODA (bromuro de trimethyloctadecylammonium) | 47,71 mg / ml |
Tabla 1. Las cantidades de sales de amonio tetra-alquil utilizar para Nafion modificación de polímeros.
| Tipo de Nafion | La actividad enzimática (U / g) |
| Tampón (sin polímero) | 16,63 ± 8,11 |
| Nafion (un-mod.) | 9,25 ± 2,21 |
| TMTDA | 3,23 ± 2,92 |
| TBAB | 3,93 ± 3,33 |
| TMDDA | 4,19 ± 1,04 |
| TMOA | 3,51 ± 1,11 |
| TMDA | 8,00 ± 4,53 |
| TMHA | 1,68 ± 1,39 |
| TMHDA | 4,83 ± 0,99 |
| TMODA | 10,45 ± 3,20 |
Tabla 2 NAD-dependiente de la actividad deshidrogenasa de glucosa inmovilizada en determinados polímeros modificados Nafion (nota: actividad inmovilizada es una función de la actividad inicial específica de la enzima)..
| Tipo de Nafion | La actividad enzimática (mU / g) |
| Tampón (sin polímero) | 7,18 ± 0,51 |
| Nafion (un-mod.) | 70,1 ± 0,5 |
| TMTDA | 133 ± 6 |
| TBAB | 244 ± 4 |
| TMDDA | 221 ± 6 |
| TMOA | 1,78 ± 0,63 |
| TMDA | 206 ±5 |
| TEHA | 40,1 ± 50,6 |
| TMHDA | 0 |
| TMODA | 1,45 ± 0,06 |
Tabla 3 PQQ-dependiente de la actividad deshidrogenasa de glucosa inmovilizada en determinados polímeros modificados Nafion (nota: actividad inmovilizada es una función de la actividad inicial específica de la enzima)..
| Tipo de Nafion | La actividad enzimática (U / g) | ||
| Tampón (sin polímero) | 103,61 ± 3,15 | ||
| Nafion (un-mod.) | 19,93 ± 10,10 | ||
| TMTDA | 247,25 ± 12,49 | ||
| TBAB | 152,27 ± 5,29 | ||
| TMDDA | 262,05 ± 6,26 | ||
| TMOA | 129,18 ± 2,31 | TMDA | 141,23 ± 1,97 |
| TMHA | 131,75 ± 2,89 | ||
| TMHDA | 132,50 ± 1,18 | ||
| TMODA | 136,50 ± 0,96 |
. Representante Tabla 4 glucosa oxidasa actividad específica inmovilizado en determinados polímeros modificados Nafion (nota: actividad inmovilizada es una función de la actividad inicial específica de la enzima).
Figura 1. Esquema de incorporación TBAB en Nafion polímero y su uso posterior en la inmovilización de enzimas.
Figura 2. Fotografía óptica de un primer reparto de co-películas de Nafion y TBAB. Reduzca la velocidad de secado se obtiene un film transparente, de color marrón claro que cubre el bottom de la bandeja de pesaje.
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Discussion
En el procedimiento descrito, tetra-alquil sales de amonio se utilizan para modificar Nafion comercial para crear polímeros micelares que se pueden utilizar para inmovilizar y estabilizar las enzimas. Los ensayos descritos en el procedimiento muestran que el polímero puede ser usado para inmovilizar una amplia variedad de enzimas con una alta retención de la actividad. Si la enzima de interés tiene una actividad muy baja o es impura, una mayor concentración puede ser necesario y no debe afectar el proceso de inmovilización, a menos que inmovilizar enzimas en concentraciones superiores a 10 mg / ml. La simplicidad del procedimiento se separa de otras técnicas de inmovilización de enzimas en que no hay etapas sintéticas (tales como polímeros de síntesis o reticulación-) se requieren. Además, estos pasos sintéticos con frecuencia desnaturalizar las proteínas o de reducir drásticamente su actividad. La concentración de proteína de 1mg/mL es meramente una concentración sugerido para la carga de enzima alta. Menores concentraciones de enzima siempre se puede emplear,pero se traducirá en una menor actividad catalítica volumétrico. En teoría, mayores concentraciones de la enzima puede utilizarse siempre y cuando la enzima se disuelve.
Debido a que los polímeros son solubles en alcoholes alifáticos inferiores tales como metanol, etanol, propanol y, un alto porcentaje de alcohol debe estar presente cuando se mezcla la suspensión de polímero con una enzima. En muchos casos, esto no es un problema siempre y cuando el etanol se evaporó en una manera oportuna una vez que la película enzima encapsulada está echada. Sin embargo, una limitación de este inmovilización puede ocurrir si una enzima no es en absoluto el alcohol tolerante y desnaturaliza o precipitados en la adición de la suspensión Nafion modificado. En raras ocasiones, las enzimas se desnaturalizan precipitado o cuando se mezcla con la suspensión Nafion modificada, por lo general lo que indica que la enzima se ha convertido en desnaturalizado y no funcionará. Es posible disminuir el contenido de alcohol en la suspensión por resuspensión de los polímeros en mezclas de alcohol / agua, Pero alcoholes alifáticos inferiores son necesarios en concentraciones significativas (> 25%) en la solución de resuspensión, por lo que esta técnica de inmovilización no funciona para las enzimas y soluciones enzimáticas que no pueden tolerar estas concentraciones de alcohol.
Los ensayos enzimáticos para cada uno de los polímeros con cada una de las tres enzimas muestran que las tendencias de la actividad específica relativa en comparación con la enzima en solución es una función del sistema de enzima. Se espera que esto, ya que cada una de las enzimas tiene un tamaño diferente, pI diferente, pH óptimo diferente, así como el hecho de que PQQ dependiente de la glucosa deshidrogenasa es una proteína asociada a la membrana y por tanto necesita un microambiente químico muy diferente que las proteínas citosólicas. Por lo tanto, el Nafion hidrófobamente modificada micelar da una membrana más desea-ambiental para la estabilización de la sesión PQQ dependiente de glucosa deshidrogenasa de tampón y muestra superactivity, que es rara en enzimas inmovilizadas. Atro cuestión a considerar es que las membranas de polímero disminuir el transporte de moléculas de gran tamaño y aunque la glucosa (el sustrato para las tres pruebas se muestran aquí) es pequeña, la coenzima NAD necesita para difundir dentro y fuera de la membrana para dependientes de NAD deshidrogenasas y esto disminuye el observó la actividad enzimática. En general, es importante señalar que el polímero exacta necesaria para cada enzima tiene que ser optimizado, debido a las diferencias en tamaño, carga, pH óptimo, y el transporte de sustrato / cofactores para cada uno de los sistemas enzimáticos.
Aparte de los ensayos de enzimas inmovilizadas, la aplicación primaria que se ha explorado con este método de inmovilización de enzimas es la fabricación de biosensores enzimáticos y células de combustible biológico. Cuando los polímeros modificados que contienen Nafion encapsulados enzimas redox se proyectan sobre superficies de los electrodos, los procesos bioelectrocatalytic puede producirse en presencia de sustratos adecuados y cofactores, produciendo una corriente eléctrica respOnse. Bioanodes fabricados con Nafion modificada se han utilizado en las células que utilizan biocombustible etanol, metanol, piruvato y glicerol, como se describe en la introducción.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Los autores agradecen a la Oficina de Investigación Naval, Junta Unidas de soja, y la Fundación Nacional de Ciencias para la financiación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nafion | Sigma-Aldrich | 70160 | |
| Tetra alkylammonium bromide salts | Sigma-Aldrich | n/a | |
| Alcohol dehydrogenase | Sigma-Aldrich | A3263 | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) | Simga-Aldrich | N7004 | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich | P8010 | |
| Phenazine methosulfate (PMS) | Sigma-Aldrich | P9625 | |
| 2,6-Dichloroindophenol (DCIP) | Sigma-Aldrich | D1878 | |
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G7141 | |
| 4-Hydroxybenzoic acid | Sigma-Aldrich | 240141 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Peroxidase | Sigma-Aldrich | P8375 | |
| 4-aminoantipyrine | Sigma-Aldrich | 06800 | |
| UV/Vis Spectrophotometer | Thermo | Evolution 260 Bio or Spectronic Genesys 20 | |
| Vortex Genie | |||
| Analytical balance |
References
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