Hidrófobo sal modificada Nafion para inmovilización de enzimas y Estabilización
Summary
En este artículo se describe el procedimiento para la síntesis de una enzima modificada hidrófobamente membrana Nafion inmovilización y cómo inmovilizar las proteínas y / o enzimas dentro de la membrana y probar su actividad específica.
Abstract
Durante la última década, ha habido una gran cantidad de solicitud de enzimas inmovilizadas y estabilizado incluyendo biocatálisis, biosensores, y las células de biocombustible. 1-3 En aplicaciones más bioelectrochemical, enzimas u orgánulos se inmovilizan sobre una superficie del electrodo con el uso de algún tipo de polímero de matriz. Este andamio polímero debe mantener las enzimas estable y permitir la difusión superficial de las moléculas y los iones en y fuera de la matriz. La mayoría de los polímeros utilizados para este tipo de inmovilización se basan en poliaminas o polialcoholes – polímeros que imitan el entorno natural de las enzimas que se encapsulan y estabilizar la enzima a través de hidrógeno o un enlace iónico. Otro método para estabilizar las enzimas implica el uso de micelas, que contienen regiones hidrofóbicas que pueden encapsular y estabilizar las enzimas 4,5. En particular, el grupo Minteer ha desarrollado un polímero basado en micelar Nafion comercialmente disponible. 6,7 Nafionen sí es un polímero micelar que permite la difusión del canal con ayuda de protones y otros cationes pequeños, pero las micelas y los canales son extremadamente pequeñas y el polímero es muy ácida debido a las cadenas laterales de ácido sulfónico, que es desfavorable para la inmovilización de enzimas. Sin embargo, cuando Nafion se mezcla con un exceso de sales de amonio hidrófobos alquilo tales como bromuro de tetrabutilamonio (BTBA), los cationes de amonio cuaternario reemplazar los protones y se convierten en los contra-iones de los grupos sulfonato en las cadenas laterales del polímero (Figura 1). Esto se traduce en mayores micelas y canales dentro del polímero que permiten la difusión de sustratos grandes e iones que son necesarios para la función enzimática, tales como nicotinamida adenina dinucleótido (NAD). Esta modificación Nafion polímero se ha utilizado para inmovilizar muchos tipos diferentes de enzimas, así como las mitocondrias para su uso en biosensores y células de combustible biológico. 8-12 Este artículo describe un nuevo procedimiento para la fabricación de este micrófonoEllar enzima polímero inmovilización membrana que puede estabilizar las enzimas. La síntesis de la membrana de inmovilización de enzimas micelar, el procedimiento para inmovilizar enzimas dentro de la membrana, y los ensayos para estudiar la actividad enzimática específica de la enzima inmovilizada se detallan a continuación.
Protocol
Discussion
En el procedimiento descrito, tetra-alquil sales de amonio se utilizan para modificar Nafion comercial para crear polímeros micelares que se pueden utilizar para inmovilizar y estabilizar las enzimas. Los ensayos descritos en el procedimiento muestran que el polímero puede ser usado para inmovilizar una amplia variedad de enzimas con una alta retención de la actividad. Si la enzima de interés tiene una actividad muy baja o es impura, una mayor concentración puede ser necesario y no debe afectar el proceso de inmovi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a la Oficina de Investigación Naval, Junta Unidas de soja, y la Fundación Nacional de Ciencias para la financiación.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number |
| Nafion | Sigma-Aldrich | 70160 |
| Tetra alkylammonium bromide salts | Sigma-Aldrich | n/a |
| Alcohol dehydrogenase | Sigma-Aldrich | A3263 |
| Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) | Simga-Aldrich | N7004 |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich | P8010 |
| Phenazine methosulfate (PMS) | Sigma-Aldrich | P9625 |
| 2,6-Dichloroindophenol (DCIP) | Sigma-Aldrich | D1878 |
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G7141 |
| 4-Hydroxybenzoic acid | Sigma-Aldrich | 240141 |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 |
| Peroxidase | Sigma-Aldrich | P8375 |
| 4-aminoantipyrine | Sigma-Aldrich | 06800 |
| UV/Vis Spectrophotometer | Thermo | Evolution 260 Bio or Spectronic Genesys 20 |
| Vortex Genie | ||
| Analytical balance |
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