Nafion הידרופובי מלח, שונה עבור Immobilization האנזים ייצוב
Summary
במאמר זה אתאר את הליך סינתזה אנזים שונה hydrophobically Nafion immobilization קרום ואיך לשתק חלבונים ו / או אנזימים בתוך קרום ולבדוק הפעילות הספציפיים שלהם.
Abstract
בעשור האחרון, חלה שפע של אנזימים בקשה ללא יכולת לזוז, התייצב כולל Biocatalysis, biosensors, ותאי דלק ביולוגי. 1-3 ביישומים bioelectrochemical ביותר, אנזימים או האברונים הם משותקים על משטח האלקטרודה עם שימוש של סוג כלשהו של פולימר מטריקס. זה פיגום פולימרי צריך לשמור על האנזימים יציבים ולאפשר דיפוזיה קליל של מולקולות ויונים פנימה והחוצה של מטריקס. רוב פולימרים המשמשים עבור סוג זה של חוסר תנועה מבוססים על פוליאמינים או polyalcohols – פולימרים המחקים את הסביבה הטבעית של האנזימים שהם לתמצת ולייצב את האנזים באמצעות מימן או מליטה יוניים. שיטה נוספת לייצוב אנזימים כרוכה בשימוש micelles, המכילות אזורים הידרופובי שניתן לתמצת לייצב אנזימים. 4,5 בפרט, קבוצת מינטיר פיתחה פולימר micellar מבוסס על Nafion זמינים מסחרית. 6,7 Nafionעצמו הוא פולימר micellar המאפשר דיפוזיה ערוץ בסיוע של פרוטונים קטיונים קטנים אחרים, אבל את micelles וערוצים קטנים מאוד הפולימר הוא חומצי מאוד, בשל שרשרת חומצה sulfonic לוואי, הוא שלילי עבור immobilization האנזים. עם זאת, כאשר Nafion מעורבב עם עודף של הידרופובי מלחי אמוניום אלקיל ברומיד כגון tetrabutylammonium (TBAB), את קטיונים אמוניום הרביעון להחליף את הפרוטונים ולהיות יונים נגד לקבוצות sulfonate על שרשרות פולימר לוואי (איור 1). התוצאה micelles ערוצי גדולים בתוך הפולימר המאפשרים דיפוזיה של מצעים ויונים גדולים הדרושים לתפקוד אנזימטי כגון dinucleotide nicotinamide אדנין (NAD). שונה זה Nafion פולימר נעשה שימוש כדי לשתק הרבה סוגים שונים של אנזימים, כמו גם המיטוכונדריה לשימוש biosensors ותאי דלק ביולוגי. 8-12 מאמר זה מתאר את הליך הרומן עבור ביצוע מיקרופוןellar immobilization פולימרי קרום האנזים שיכול לייצב אנזימים. סינתזה של קרום immobilization micellar האנזים, הליך משתק אנזימים בתוך הקרום, ואת מבחני ללימוד פעילות אנזימטית של אנזים מסוים משותקת מפורטים להלן.
Protocol
Discussion
בהליך המתואר, טטרה אלקיל מלחי אמוניום משמשים לשנות Nafion מסחרי ליצור פולימרים micellar שניתן להשתמש בהם כדי לשתק ולייצב אנזימים. מבחני המתוארים הצג את הנוהל הפולימר יכול לשמש כדי לשתק מגוון רחב של אנזימים עם השמירה הגבוהה של הפעילות. אם האנזים עניין יש פעילות נמוכה מאוד או…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים משרד המחקר של הצי, מועצת הברית סויה, ואת הקרן הלאומית למדע למימון.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number |
| Nafion | Sigma-Aldrich | 70160 |
| Tetra alkylammonium bromide salts | Sigma-Aldrich | n/a |
| Alcohol dehydrogenase | Sigma-Aldrich | A3263 |
| Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) | Simga-Aldrich | N7004 |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich | P8010 |
| Phenazine methosulfate (PMS) | Sigma-Aldrich | P9625 |
| 2,6-Dichloroindophenol (DCIP) | Sigma-Aldrich | D1878 |
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G7141 |
| 4-Hydroxybenzoic acid | Sigma-Aldrich | 240141 |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 |
| Peroxidase | Sigma-Aldrich | P8375 |
| 4-aminoantipyrine | Sigma-Aldrich | 06800 |
| UV/Vis Spectrophotometer | Thermo | Evolution 260 Bio or Spectronic Genesys 20 |
| Vortex Genie | ||
| Analytical balance |
References
- Calabrese-Barton, S., Gallaway, J., Atanassov, P. Enzymatic biofuel cells for implantable and microscale devices Chem. Rev. 104, 4867-4886 (2004).
- Cracknell, J. A., Vincent, K. A., Armstrong, F. A. Enzymes as Working or Inspirational Electrocatalysts for Fuel Cells and Electrolysis. Chem. Rev. 108, 2439-2461 (2008).
- Minteer, S. D., Liaw, B. Y., Cooney, M. J. Enzyme-Based Biofuel Cells. Curr. Opin. Biotechnol. 18, 228-234 (2007).
- Callahan, J. W., Kosicki, G. W. The Effect of Lipid Micelles on Mitochondrial Malate Dehydrogenase. Canadian Journal of Biochemistry. 45, 839-851 (1967).
- Martinek, K. Modeling of the Membrane Environment of Enzymes: Superactivity of Laccase Entrapped into Surfactant Reversed Micelles in Organic Solvents. Biokhimiya. 53, 1013-1016 (1988).
- Moore, C. M., Akers, N. L., Hill, A. D., Johnson, Z. C., Minteer, S. D. Improving the Environment for Immobilized Dehydrogenase Enzymes by Modifying Nafion with Tetraalkylammonium Bromides. Biomacromolecules. 5, 1241-1247 (2004).
- Schrenk, M. J., Villigram, R. E., Torrence, N. J., Brancato, S. J., Minteer, S. D. Effects of Mixture Casting Nafion with Quaternary Ammonium Bromide Salts on the Ion-Exchange Capacity and Mass Transport in the Membranes. J. Membr. Sci. 205, 3-10 (2002).
- Akers, N. L., Moore, C. M., Minteer, S. D. Development of Alcohol/O2 Biofuel Cells Using Salt-Extracted Tetrabutylammonium Bromide/Nafion Membranes to Immobilize Dehydrogenase Enzymes. Electrochim. Acta. 50, 2521-2525 (2005).
- Sokic-Lazic, D., Minteer, S. D. Citric Acid Cycle Biomimic on a Carbon Electrode. Biosens. Bioelectron. 24, 939-944 (2008).
- Arechederra, R. L., Minteer, S. D. Complete Oxidation of Glycerol in an Enzymatic Biofuel Cell. Fuel Cells. 9, 63-69 (2009).
- Germain, M., Arechederra, R. L., Minteer, S. D. Nitroaromatic Actuation of Mitochondrial Bioelectrocatalysis for Self-Powered Explosive Sensors. J. Am. Chem. Soc. 130, 15272-15273 (2008).
- Addo, P. K., Arechederra, R. L., Minteer, S. D. Evaluating Enzyme Cascades for Methanol/Air Biofuel Cells Based On NAD+-Dependent Enzymes. Electroanalysis. 22, 807-812 (2010).
- Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, M. D., Fujimoto, E. K., Goeke, N. M., Olson, B. J., Klenk, D. C. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150, 76-85 (1985).
