Hydrofob Salt modifierade Nafion för enzymimmobilisering och stabilisering
Summary
Denna artikel beskriver ett förfarande för syntetisering av en hydrofobt modifierad Nafion-membranet enzymimmobilisering och hur man immobilisera proteiner och / eller enzymer i membranet och testa deras specifika aktivitet.
Abstract
Under det senaste årtiondet har det skett en mängd ansökan om immobiliserade och stabiliserade enzymer inklusive biokatalys, biosensorer och biobränsle celler. 1-3 I de flesta bioelektrokemiska tillämpningar är enzymer eller organeller immobiliseras på en elektrod yta med användning av någon typ av polymermatrisen. Detta polymerskelettet bör hålla de enzymer stabila och möjliggöra enkel diffusion av molekyler och joner in i och ut ur matrisen. De flesta polymerer som används för denna typ av immobilisering är baserade på polyaminer eller polyalkoholer – polymerer som efterliknar den naturliga miljön om de enzymer som de inkapslar och stabiliserar enzymet genom väte eller jonbindning. En annan metod för stabilisering enzymer innefattar användningen av miceller, vilka innehåller hydrofoba regioner som kan inkapslar och stabiliserar enzymer. 4,5 I synnerhet har det Minteer gruppen utvecklade en micellär polymer baserad på kommersiellt tillgängliga Nafion. 6,7 Nafionsjälv är en micellär polymer som medger kanal-assisterad diffusion av protoner och andra små katjoner, men micellerna och kanaler är extremt små och polymeren är mycket sur på grund av sulfonsyragrupper sidokedjor, som är ogynnsamma för enzymimmobilisering. När emellertid Nafion blandas med ett överskott av hydrofoba alkyl-ammoniumsalter såsom tetrabutylammoniumbromid (TBAB), de kvartära ammoniumkatjoner ersätta protonerna och bli motjonerna till de sulfonatgrupper på de polymera sidokedjor (figur 1). Detta resulterar i större miceller och kanaler inuti polymeren som möjliggör diffusion av stora substrat och joner som är nödvändiga för enzymatisk funktion såsom nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD). Denna modifierade Nafion polymer har använts för att immobilisera många olika typer av enzymer och mitokondrier för användning i biosensorer och biobränsle celler. 8-12 Detta dokument beskriver ett nytt förfarande för denna micellar polymer enzymimmobilisering membran som kan stabilisera enzymer. Syntesen av den micellära enzymimmobilisering membran, ett förfarande för immobilisering av enzymer i membranet, och analyserna för att studera enzymatiska specifika aktiviteten hos det immobiliserade enzymet i detalj nedan.
Protocol
Discussion
I den beskrivna förfarandet, är tetra-alkylammoniumsalter användas för att modifiera kommersiellt Nafion för att skapa micellära polymerer som kan användas för att immobilisera och stabilisera enzymer. De analyser som beskrivs i förfarandet framgår att polymeren kan användas för att immobilisera en stor mängd enzymer med en hög retention av aktivitet. Om enzymet av intresse har en mycket låg aktivitet eller är oren, kan en högre koncentration erfordras, och bör inte påverka immobiliseringsprocessen, s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna erkänner Office of Naval Research, United sojabönor styrelsen och National Science Foundation för finansiering.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number |
| Nafion | Sigma-Aldrich | 70160 |
| Tetra alkylammonium bromide salts | Sigma-Aldrich | n/a |
| Alcohol dehydrogenase | Sigma-Aldrich | A3263 |
| Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) | Simga-Aldrich | N7004 |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich | P8010 |
| Phenazine methosulfate (PMS) | Sigma-Aldrich | P9625 |
| 2,6-Dichloroindophenol (DCIP) | Sigma-Aldrich | D1878 |
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G7141 |
| 4-Hydroxybenzoic acid | Sigma-Aldrich | 240141 |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 |
| Peroxidase | Sigma-Aldrich | P8375 |
| 4-aminoantipyrine | Sigma-Aldrich | 06800 |
| UV/Vis Spectrophotometer | Thermo | Evolution 260 Bio or Spectronic Genesys 20 |
| Vortex Genie | ||
| Analytical balance |
References
- Calabrese-Barton, S., Gallaway, J., Atanassov, P. Enzymatic biofuel cells for implantable and microscale devices Chem. Rev. 104, 4867-4886 (2004).
- Cracknell, J. A., Vincent, K. A., Armstrong, F. A. Enzymes as Working or Inspirational Electrocatalysts for Fuel Cells and Electrolysis. Chem. Rev. 108, 2439-2461 (2008).
- Minteer, S. D., Liaw, B. Y., Cooney, M. J. Enzyme-Based Biofuel Cells. Curr. Opin. Biotechnol. 18, 228-234 (2007).
- Callahan, J. W., Kosicki, G. W. The Effect of Lipid Micelles on Mitochondrial Malate Dehydrogenase. Canadian Journal of Biochemistry. 45, 839-851 (1967).
- Martinek, K. Modeling of the Membrane Environment of Enzymes: Superactivity of Laccase Entrapped into Surfactant Reversed Micelles in Organic Solvents. Biokhimiya. 53, 1013-1016 (1988).
- Moore, C. M., Akers, N. L., Hill, A. D., Johnson, Z. C., Minteer, S. D. Improving the Environment for Immobilized Dehydrogenase Enzymes by Modifying Nafion with Tetraalkylammonium Bromides. Biomacromolecules. 5, 1241-1247 (2004).
- Schrenk, M. J., Villigram, R. E., Torrence, N. J., Brancato, S. J., Minteer, S. D. Effects of Mixture Casting Nafion with Quaternary Ammonium Bromide Salts on the Ion-Exchange Capacity and Mass Transport in the Membranes. J. Membr. Sci. 205, 3-10 (2002).
- Akers, N. L., Moore, C. M., Minteer, S. D. Development of Alcohol/O2 Biofuel Cells Using Salt-Extracted Tetrabutylammonium Bromide/Nafion Membranes to Immobilize Dehydrogenase Enzymes. Electrochim. Acta. 50, 2521-2525 (2005).
- Sokic-Lazic, D., Minteer, S. D. Citric Acid Cycle Biomimic on a Carbon Electrode. Biosens. Bioelectron. 24, 939-944 (2008).
- Arechederra, R. L., Minteer, S. D. Complete Oxidation of Glycerol in an Enzymatic Biofuel Cell. Fuel Cells. 9, 63-69 (2009).
- Germain, M., Arechederra, R. L., Minteer, S. D. Nitroaromatic Actuation of Mitochondrial Bioelectrocatalysis for Self-Powered Explosive Sensors. J. Am. Chem. Soc. 130, 15272-15273 (2008).
- Addo, P. K., Arechederra, R. L., Minteer, S. D. Evaluating Enzyme Cascades for Methanol/Air Biofuel Cells Based On NAD+-Dependent Enzymes. Electroanalysis. 22, 807-812 (2010).
- Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, M. D., Fujimoto, E. K., Goeke, N. M., Olson, B. J., Klenk, D. C. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150, 76-85 (1985).
