Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

ASC farklılaşma kontrol için bir iki tabakalı Hidrojel mühendislik

doi: 10.3791/3953 Published: May 25, 2012

Summary

Bu protokol çevreleyen hücre dışı matriks gelen ipucu almak ve birden fenotipleri farklılaşması için indüklenebilir kök hücrelerin doğal yeteneği kullanılmasına odaklanmıştır. Bu yöntemler yazının aynı anda yağ kaynaklı kök hücreleri birlikte ayırt etmek için, PEG-fibrin ve kollajen oluşan iki katmanlı hidrojel kullanan bir model, bizim ve nitelendirilmesi uzanır

Abstract

Yılda Doğal polimerler nedeniyle ana biyouyumluluk ve in vitro ve in vivo olarak hücreleri ile etkileşim yeteneği daha fazla önem kazanmıştır. Rejeneratif tıpta umut vaat araştırma bir alan roman biyomalzemeler ve kök hücre kombinatoryal kullanılmasıdır. Doku mühendisliği alanında temel bir strateji hücre fonksiyonu yönlendirilmesi için üç boyutlu İskele (örneğin, hücre dışı matriks, hidrojeller, mikro / nano parçacıklar decellularized) kullanılmasıdır. Bu teknoloji, hücrelerin, onlar yapışabilir bunun üzerine bir substrata ihtiyaç çoğalırlar ve onların farklılaşmış hücre fenotipi ve fonksiyonu 2-3 olduğunu ifade keşif dönüşmüştür. Daha yakın zamanlarda, aynı zamanda hücre yapışması için, bu yüzeyler kullanımı, aynı zamanda etkileşime girer ve matris substrat (örn., hücre dışı matris, ECM) 4 kuyruklar alır sadece olduğu tespit edilmiştir. Bu nedenle, hücre ve iskelesi bir karşılıklı bağlantısı vardırdoku gelişimi, organizasyon ve nihai fonksiyonunu kontrol etmek için hizmet vermektedir. Yağ kökenli kök hücreleri (TSK) mezenkimal olan, non-hematopoetik kök hücreler çok soy diferansiyasyon sergileyen ve hücrelerin hazır kaynağıdır (yani pre-vasküler endotelin ve perisitler) olarak hizmet verebilir adipoz dokuda sunuyoruz. Bizim hipotezi yağ kaynaklı kök hücreleri iki katmanlı matrisler 1 tek ortak kültür onlar tarafından eş zamanlı olarak farklı fenotipleri doğru yönlendirilecek olmasıdır. Laboratuvarımız dermal yara iyileşmesi üzerine odaklanmıştır. Bu amaçla, bir dermal özgü yara iyileşmesi ECM çevrenin özelliklerini ve işlevlerini taklit tek bir kompozit doğal biyomalzemeler gelen matrisi, fibrin, kollajen ve kitosan yarattı.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Yağ-Türetilmiş Kök Hücre (TSK) 1, 5 Ayırma

Not: aksi belirtilmediği sürece tüm işlemler oda sıcaklığında yapıldı.

  1. Sıçan perirenal ve epididimal adipoz yalıtmak ve daha önce açıklanan 5 olarak% 1 fetal sığır serumu (FBS) içeren steril Hank tamponlu tuz solüsyonu (HBSS) ile yıkayın. Bu çalışma, Hayvan Refahı Yasası, uygulanması Hayvan Refahı Yönetmeliği ve Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu esaslarına göre uygun olarak yapılmıştır.
  2. Doku kıyma ve oda sıcaklığında 8 dakika boyunca 500 g'de 50 mL'lik bir tüp ve santrifüj içine% 1 FBS içeren HBSS 25 mL içine 1-2 g transfer.
  3. Serbest yüzen adipoz doku tabakası ve 125 ml Erlenmeyer şişesinde transfer toplayın ve 37 az 45 HBSS kollajenaz tip II (200 U / ml) 25 mL ° orbital çalkalayıcı (125 rpm) üzerinde C ile tedavi. Dikkatle pipeting tarafından sıvı kısmı (petrol ve yağ tabakası altında) çıkarın ve 100 sıralı olarak bu filtre - um ve 70 - mikron naylon ağ filtre. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 500 g'de santrifüje süzüntü, süpernatan aspire ve HBSS 25 mL ile iki kez pelet yıkanır.
  4. MesenPRO RS Büyüme katkısı, (penisilin G, 100 U / mL, 100 ug / streptomisin sülfat mL, ve amfoterisin 0.25 ug / mL antibiyotik-antimikotik ile desteklenmiş büyüme medyumu (MesenPRO RS Bazal Medium) 50 mL hücre pelletini İki T75 şişeler (25 mL / şişeye) içine L-glutamin ve pipetle hücreleri B), ve 2 mM.
  5. Kültür 37 azından% 5 CO2-nemli bir inkübatörde ASC ° C (pasaj 2-4 TSK ve tüm deney için kullanılmaktadır).

2. Chitosan Mikroküreler (KGYS) hazırlanması

Not: aksi belirtilmediği sürece tüm işlemler oda sıcaklığında yapıldı.

    5 Koaservasyon tekniği ile birlikte, bir su-içinde-yağ emülsiyonlaştırıcı işlem ile hazırlanır. Soya yağı, n-oktanol (1:2 v / v) ve 5 oluşan bir yağ fazı karışımı, 100 mL kitosan sulu bir çözeltisi (asetik asit içinde 0.5 M% 3 ağırlık / hacim kitosan 6 mL), emülsifiye % sorbitan-mono-oleat (p 80) emülgatör, zıt yönlerde aynı anda havai (1700 rpm) ve manyetik karıştırma (1000 rpm) ile. Çapraz bağlama oluşmadan önce erken oluşan miseller çözüm kalır ve dibe kadar olmadığı karıştırma temin eder bu ikili yöntemi. Dahası, içinde manyetik karıştırıcı yardımcıları misel oluşumu ve rigidization sırasında kitosan de-toplamak.
  1. Karışım sürekli stabil bir su-içinde-yağ emülsiyonu elde edilene kadar, yaklaşık 1 saat karıştırıldı karıştırın. 4 saat (24 mL toplam) n-oktanol, her 15 dakika içinde% 1 w / v potasyum hidroksit ile 1.5 mL ilavesi ile bağlama iyonik çapraz başlatabilir
  2. Bir vakum desikatörde kurtarıldı küreler kurulayın ve daha fazla işlem olmadan analiz. Eğer ortalama parçacık boyutu CSM, miligram başına yüzey alanına ve bir parçacık boyutu analizörü kullanılarak birim hacmi kübik belirleyebilir.
  3. Daha sonraki deneylerde, kalıntı tuzları uzaklaştırmak ve mutlak etanol 5 mL gece boyunca yıkanarak sterilize edilmesi steril su ile CSM üç kez yıkanır.

3. BelirlenmesiKGYS Serbest Amino Gruplarının sayısı

Not: aksi belirtilmediği sürece tüm işlemler oda sıcaklığında yapıldı.

  1. Trinitro benzensülfonik (TNBS) Bubnis ve Ofner 6 asit yöntemi kullanılarak bağlayan iyonik çapraz sonra KGYS mevcut serbest amino gruplarının sayısını belirleyin. 40 ° C'de 4 saat süreyle 50 mL'lik bir cam tüp içinde% 0.5 TNBS solüsyonu 1 mL mikrosferler 5 mg inkübe ve 60 6N HCI ile 3 ml ilave ° C'de 2 saat süreyle ile hidroliz.
  2. Oda sıcaklığına kadar soğumaya örnekleri ve deiyonize su ile 5 mL etil eter ve 10 ml ilave edilerek serbest TNBS özü.
  3. ° C bir su banyosunda 15 dakika oda sıcaklığına kadar soğutulur ve kalan eter, buharlaşma ve 15 ml su ile dilüe etmek için 40 sulu faz bir 5-mL'lik kısım ısıtılır.
  4. Boş ve kitosan CSM p için kullanılan kitosan olmadan TNBS çözümü kullanarak bir spektrofotometre ile 345 nm de absorbansı ölçülürAmino gruplarının sayısı tespit etmek telafi. Kitosan göre CSM serbest amino grubu ile kestirilebilir.

4. CSM içinde yükleniyor ASC

Not: aksi belirtilmediği sürece tüm işlemler oda sıcaklığında yapıldı.

  1. Gece steril HBSS bölümünde 2,5 sterilize KGYS 5 mg dengeye ve 8 eklemek - mikron gözenek büyüklüğüne membran kültür plakası eki (24-iyi plaka).
  2. KGYS membran üzerine yerleşmiş sonra, dikkatlice HBSS aspire ve uç dışına büyüme ortamının ekleme ve 700 uL içine büyüme ortamının 300 uL ekleyebilir.
  3. Kültürü plakası içine eklemek CSM içinde büyüme ortamı ve tohum 200 uL uygun konsantrasyonda Pastör pipetiyle TSK (1 × Ekim 4-4 x 10 4). Kültürü insert içinde orta son hacim, tohumlama sonra, 500 uL olup.
  4. Incub37 azından% 5 CO2 inkübatöründe nemlendirilmiş 24 saat süre ile KGYS üzerine ASC tohumlu ° C. yiyen

5.. KGYS yılında ASC Yükleme ve Hücre Uygulanabilirlik Yüzde Belirlenmesi

Not: aksi belirtilmediği sürece tüm işlemler oda sıcaklığında yapıldı.

  1. Insert membran içine göç etmiş hücreleri bozmadan steril 1,5 ml mikrosantrifüj tüp inkübasyon, pipet ASC yüklü CSM sonra.
  2. Artık orta çıkarın ve tüp taze besiyeri 250 uL ekleyin.
  3. Her tüpe, MTT ile 25 ul ilave [3 - (4,5-dimethylthiozole-2-il) -2,5-difeniltetrazolium bromür] çözeltisi (5 mg / mL) ve 2 nemlendirilmiş% 5 CO 4 saat için inkübe 37 ° C inkübatör
  4. İnkübasyondan sonra, orta kaldırmak dimetil sülfoksit 250 uL ekleyin ve karmaşık formazan çözünürleştirmek için 2-5 dakika boyunca vorteks karışımı.
  5. 2700 g at CSM santrifüjleyiniçin 5 dakika, süpernatant kapalı pipet ve MTT üreticinin talimatlarına göre bir standart plaka okuyucu kullanarak 570 nm ve 630 nm dalga boyunda absorbans kendi belirler.
  6. Bir standart eğri geliştirmek için kültüre tanımlandığı ASC numaraları elde edilen değerlere göre KGYS ile ilişkili hücre sayısının belirlenmesi.

6. ASC-CSM Hazırlanması ve Karakterizasyonu PEG-fibrin Jeller Gömülü

Not: aksi belirtilmediği sürece tüm işlemler oda sıcaklığında yapıldı.

  1. Polietilen glikol (PEG), fibrin (PEG-fibrin) hidrojel Suggs ve arkadaşları tarafından hazırlanan 7 süksinimidil glutarat modifiye polietilen glikol (PEG; 3400 Da) eriterek. Tris tamponlu tuz (TBS, pH 7.8) ve filtre sterilize 4 mL kullanılarak Sadece deney başlamadan önce bir-0.22 mikron filtre ile. Çözünmüş PEG ilk 3-4 saat boyunca bu uygulamada, sadece etkili olur.
  2. Mix 500 Μ fibrinojen stokunun l (TBS, pH 7.8 içinde 40 mg / mL) ve 37 de bir% 5 CO2 inkübatöründe nemlendirilmiş 20 dakika boyunca bir 6-kuyulu plakalı ve inkübe bir kültür PEG stokunun 250μl ° C. Fibrinojen: Bu karışım, 1:10, SG-PEG-SG bir molar konsantrasyon oranı oluşturmaktadır.
  3. CSM 5 mg arasında derişimde ASC-CSM 250 ul al, (≈ 2 x 10 hücre 4) ve pegile fibrinojen çözeltisi ile karıştırılır.
  4. Hemen trombin stok (25U/mL) 1 ml ekleyin ve hızlı bir şekilde pipetle bir veya iki kez çiğnemek. 10 dk tam jelleşme için izin vermek için 37 ° C'da PEG-fibrinojen ile trombin karıştırıldıktan sonra, hemen bir 12-kuyulu plakalı olarak hücre-jel karışımı yerleştirmek ve% 5 CO2 inkübatöründe inkübe nemlendirilmiş. Jelleşme süresi, hızlı olduğu için, fazla 5 saniye pipet içindeki jel çözümü deneyin ve tutmayın. Pegile fibrinojen trombin ile parçalanabilen bir pegile fibrin hidrojel oluşturur. Gibi the nihai ürünün jel PEG-fibrin olarak anılır.
  5. HBSS ile iki kez PEG-fibrin jeller yıkayın ve 37% 5 CO 2 nemli inkübatörde% 10 FBS ile takviye alfa minimal gerekli ortam (α-MEM) ° C ile inkübe
  6. Standart ışık mikroskopi teknikleri kullanan bir 11 günlük süre içinde jel içine CSM hücreleri göç gözlemleyin.

7. ASC-CSM Hazırlanması ve Karakterizasyonu Kollajen Jeller Gömülü

Not: aksi belirtilmediği sürece tüm işlemler oda sıcaklığında yapıldı.

  1. 2N NaOH ile 6.8 pH arındırılmış Bornstein 8 ve fibrillate yöntemine uygun olarak, fare kuyruk tendonları ekstrakte tipi 1 kolajen (7.5 mg / mL) karışımı ASC-CSM (5 mg ≈ 2 x 10 hücre ihtiva eden 4).
  2. Bir 12-iyi levhaya fibrile kolajen-ASC-CSM karışımı ekleyin ve bir% 5 CO2 humidi içinde 30 dakika süreyle inkübe37 fied inkübatör ° C
  3. Tam fibrilasyon sonra, 37 ° C kadar bir% 5 CO 2 nemli inkübatörde 11 gün için kolajen-ASC-CSM jeller inkübe
  4. Standart mikroskopi teknikleri kullanan bir 11 günlük süre içinde jel içine CSM hücreleri göç gözlemleyin.

8. Iki tabakalı PEG-fibrin (ASC-CSM)-Kolajen Jel Oluşumlar Gelişimi

Not: aksi belirtilmediği sürece tüm işlemler oda sıcaklığında yapıldı.

  1. Iki tabakalı yapı geliştirmek için, hafif bir değişiklik ile, yukarıda açıklandığı gibi Kolajen ve PEG-fibrin jeller hem hazırlanır. 1) Yük ASC: Kısaca, dört adımlı bir işlemi kullanarak kolajen ve PEG-fibrin iskeleleri arasında "sandviç" ASC-KGYS, iki bioscaffolds kullanarak kök hücre kaynağının tek göçmen ve co-indüksiyon özelliklerini incelemek için CSM, 2) üzerine col üzerinden fibrilizedir kollajen jel ve katman ASC-CSM boncuk dökümlagen jel, 3) dökme PEG-fibrin ASC-CSM-kollajen jel üzerinde jel ve jel katılaşmaya izin ve 4) iyi orta eklemek ve Vitro hücreleri üzerinde çalışma, (bkz. Şekil 1 in vivo uygulamalar için insert kaldırmak eklemek ).
  2. A-1 mL tipi karışıma ASC-CSM ilave etmeksizin, 7,1, yukarıda tarif edildiği gibi 1 kolajen (7.5 mg / mL) karışımı hazırlandı. Bir 6-de doku kültürü uç (8-um gözenek boyutu) içinde karışımı yerleştirin ve 37 ° C'de% 5 CO2 inkübatöründe nemlendirilmiş 30 dakika süreyle inkübe
  3. Kültür ortamına (200 ul) içinde süspanse ASC-CSM kolajen yüzeyi 5 mg (10, 000 hücre / mg) üzerinde tam fibrilasyon, tabakası sonra. Mikrosferler jel üzerinde yapıldıktan sonra, karışıma ASC-CSM eklenmesi ve ASC-CSM-kollajen katmanların üstüne tabakası pegile fibrinojen / trombin solüsyonu olmaksızın, bölümünde açıklandığı 6,0-PEG fibrin jel hazırlanması. PEG-fibrin jel hazırlanırken, t yerine, hücre kültür aracı maddesi 250 ul kullanımıhücreler içeren orta O 250 ul.
  4. Tamamlandığında, kültür ortamı ile yapı beslemeden önce tam jelleşme ulaşmak için% 5 CO 2 nemli inkübatörde 30 dakika yapıları tasarlamak.
  5. Tamamlandıktan sonra jelleşme, düşük odacık içinde bir yapı ve orta 3 mL üzerinde üst odacık içinde orta yerde 1 mL.

9. Stok Çözümler yapma

Not: aksi belirtilmediği sürece tüm işlemler oda sıcaklığında yapıldı.

  • Kalsiyum klorür stok (40 mM): Sadece CaCl 2 .2 H 2 O kullanın Deiyonize su 100 ml CaCl 2 .2 H 2 O 588,4 mg eritin. 0.22-mikron filtre kullanılarak sterilize edin.
  • Polietilen glikol: PEG oksijen ile son derece reaktif ve oda havasına maruz kaldığında okside olabilir. Bunun gibi, PEG azot (N 2) bir atmosfer altında muhafaza edilmelidir. Accurately kullanıma hazır olana kadar -80 az 2 ml santrifüj tüpüne (Kullanmadan önce N2 ile tüpleri temizlemek için emin olun) ve mağaza ° C 32 mg ağırlığında. Kullanmadan önce TBS çözeltisi 4 mL PEG 32 mg eritilir.
    Aşağıdaki çözümler her deneyde önce taze yapılmalıdır.
  • TBS Çözüm: (25 pH 7,75-7,77 ° C 25 ° C pH çok önemlidir). TBS çözeltisi 15 ml'lik hazırlamak için, dikkatle filtre ile sterilize deiyonize su içinde bir tampon tablet çözülür ve istenen pH değerine ayarlanır. Her zaman taze çözüm hazırlamak stok tutmayın.
  • Fibrinojen çözeltisi (40 mg / ml). Fibrinojen konsantrasyonu 40 mg / ml yapmak TBS fibrinojen tozu eritin. 4 de, bir manyetik karıştırıcı kullanılarak bir gece boyunca eritilmesi ° C. Bu, TBS ile istenen miktarı ile, tüm 1-g miktarı çözünmesi kolaylaşır. Ertesi gün, 4 ° C (genellikle bulanık) den fibrinojen kaldırmak ve buna izinBir homojen çözelti elde edilene kadar bir su banyosu içinde ısıtmak için. Son olarak, 0.45 mikron filtre kullanarak fibrinojen sterilize filtre.
  • Trombin solüsyonu (25 adet / ml): trombin solüsyonu yapmak için, gerekli miktarda tartılarak hazırlanan 40 mM CaCl 2 .2 H 2 O ile çözülür Her zaman stok yapmak için trombin tüm flakon kullanmak iyi bir uygulamadır. Örnek: -20 ° C'de 200 CaCl 2 mM .2 H 2 O, tablet ve mağaza ile 5 kU trombin bir şişe eritilir

10. Temsilcisi Sonuçlar

Burada sunulan tekniğin genel amacı bir teslimat aracı olarak CSM kullanarak birden fenotipleri içine ASC eşzamanlı matris odaklı farklılaşma potansiyeli göstermektir. Biz bir iki katmanlı kollajen-PEG-fibrin İskele içine KGYS kök hücre sunmak için bir in vitro stratejisi göstermektedir. ASC Karakterizasyonu Bu iskele reveale içinde gömülüASC-yüklü KGYS kollajen ve PEG-fibrin tabakası arasında "sandviç" edilebilir d aynı anda ve farklı şekilde yeni koşullar altında başarılı olmak için hem de ekstraselüler ortamlardan ipucu alabilir. Biz ilk hücre canlılığı ve göçmen kapasitelerini korumak için model sistemi için yeteneği karakterizedir. Kollajen bunların "stemness," olarak Stro-1 kendi ifade ve bunların fibroblast-benzeri morfolojisi (Şekil 2 ve 2F) tarafından gösterilmiştir korumak için TSK yeteneği desteklenir. Onların tüp benzeri yapı morfoloji, von Willebrand faktör (Şekil 2E ve 2G) onların endotel hücre özel ifade ve pericyte özel ifadesine gösterdiği gibi aksine, PEG-fibrin, vasküler bir fenotipe doğru ayırt etmek için TSK ve bağlı NG2 ve trombosit kaynaklı büyüme faktörü reseptörü beta (PDGFRβ) (veriler gösterilmemiştir). Ayrıca, bu gözlenen fenotipleri erken kültürünün oluştuğu ortaya çıktı ve 11 gün boyunca devam edilmiştir, gibi demlenirŞekil 3 'de hücre dizilerindeki ardışık.

Tablolar ve Şekiller

Çift-katlı Faydaları Construct:

  • Hücreleri olmadan iskele tek başına bir biyoaktif yapı iskelesi olarak gerçekleştirebilirsiniz.
  • PEG-fibrin büyüme faktörlerinin katkısı olmadan ayırt etmek için kök hücre uyarabilir.
  • Kollajen TSK ve kök hücre fenotipi korumada yardımcı olabilir.
  • Bir çift-katlı bir yapı diğer hücre tipleri geçirmek ve (örneğin, endotel hücreleri, fibroblast, keratinositler, düz kas hücreleri, perisitler) prolifere için aktif bir tabaka olarak kullanılabilir.
  • Sert ve yumuşak doku yenilenmesine hydroxyaptite veya demineralize kemik gibi sert doku mühendisliği iskeleleri ile kullanılabilir.
  • Bu çok katmanlı, farklı doku mühendisliği yapı (vb, dermal-damar, damar-epitel, dermal-vasküler-hipodermal gibi) geliştirmek için kullanılabilir.
  • Aynı anda geliştirmek için bir tek hücre kaynağı kullanırçok hücreli bölmeleri.
  • Bu doğal kökenli olduğundan ev sahibi doku ile entegre bir potansiyele sahiptir.
  • Jel yapısı içinde CSM göç etmek hücreleri için bir platform sağlar.
  • CSM hazırlamak için kullanılan Kitosan, iyi bilinen bir aktif kemo-cezbedicidir.
  • "Matrix-güdümlü kök hücre farklılaşması", bu protokolü uygulanan genel konsepti diğer kök hücre tiplerine uygulanabilir. Ancak, daha fazla araştırma matris odaklı farklılaşma fizibilite belirlemek için garantilidir. Iki katmanlı jel iskele sürekli ve kontrollü bir şekilde hücreleri sunmak için bir rezervuar olarak hareket edebilir.
  • Rekonstrüksiyon sonra, jeller hala bileşenleri tek tek ayrılabilir.

Şekil 1
Şekil 1. Şematik genel amacı ve tekniği süreci resmediyor. 1) Yağ kaynaklı kök hücreler (TSK) lo vardırkitosan mikroküreler üzerine aktarıldı. 2) Collagen daha sonra bir 6-de insert, kolajen fibrillate ayarlandı pH, ve bir 6-kuyucuklu plak odacık içine yerleştirilir insert içine dökülür. ASC-yüklü CSM küreler sonra kolajen üzerindeki katmanıdır. 3) pegile fibrinojen sonra kolajen (Artan-CSM) üzerine döküldü ve trombin ilavesiyle jölelenmişti edilir. 4) son iki tabakalı yapı daha sonra kültür uç çıkarılır ve in vitro veya in vivo analiz için de kullanılabilir.

Şekil 2
ASC Şekil 2. Karakterizasyonu kollajen ve PEG-fibrin 3D matrisinin içinde kültüre. Izole ASC A) Faz-kontrast fotomikrografıdır pasajlandı ve rutin 2-boyutlu hücre kültür teknikleri kullanılarak korunur. Fotomikrografları B, D ve F ASC-CSM 3 boyutlu kollajen jel içinde kültüre betimliyor; C, E ve G gösterisi ASC-CSM 1. günde bir 3 boyutlu PEG-fibrin jel, hem de içinde kültüre ise2. B ve C), hem TSK iskelesi tipte CSM küre uzağa geçiş gösterilmiştir. TSK ve kök hücre belirleyicisi Stro-1 (; ok D) kendi ifadesi korurken, kolajen (B) 'de bir basık, mil gibi morfoloji var görünüyor. PEG-fibrin TSK ve kültüre zaman daha tüp benzeri yapılar sergilerler ve von Willebrand Faktör (E) gibi vasküler hücre işaretleyicileri ifade indüklenir. Transmisyon elektron mikroskobu her iskele içinde TSK gösterdiği tipik bir morfoloji gösteriyor. (; Ok G) kollajen jel TSK TSK tipik lumenal (L etiketli) yapılar oluşmuş ise, hücre (F) gövdesinden uzanan küçük filopodia (fl) var görünüyor.

Şekil 3
Şekil 3. Kollajen bilayers ve PEG-fibrin jel arasındaki ASC-KGYS morfolojik analizi. ASC-KGYS kollajen ve PEG-fibrin jel arasında "sandviç" ve 11 gün kültüre edildi. Sol column göç ve kollajen matriks içinde çoğalan TSK resmediyor ve mil benzeri morfolojisi almaya görünür. Sağ sütunda TSK uzak KGYS göç ve PEG-fibrin jel boyunca tüp benzeri yapılar oluşturan resmediyor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

TSK ve izolasyon ve çeşitli hücre tipleri doğru ayırt etmek için yeteneği edilmeleri kolay olduğundan iyi bilinmektedir. Bu yazıda anlatılan teknikleri ile, aynı anda birden fazla biomatrices bu hücrelerin teşhir ederek TSK plastisite yararlanmak için edebiliyoruz. Hücreler CSM tabanı uzağa göç ve onların çevresindeki ekstrasellüler çevre girerken, hücrelerin iskele gelen ipucu almak ve ya "stemness" (kollajen) koruyabilir veya damar-damar-destekleyici hücre tipleri (fibrin) doğru ayırt teşvik edilecektir. Laboratuar deri ve yumuşak doku yara iyileşmesi ile ilgilenmesi nedeniyle, stratejik fibrin doğal damar ağı oluşumu 9 indükler ise kollajen, ev sahibi tarafından dermal ve epidermal rejenerasyonu destekler yana kollajen ve fibrin bir iki tabakalı uygulanmaktadır. Ayrıca, şimdi çapraz konuşma cilt keratinosit, fibroblast ve altta yatan vasküler ağ çoğalan arasında oluşur anlaşılmaktadır ve bu karmaşıkmekanizması düzgün yara iyileşmesi için 10 derece önemlidir. Altta yatan bir damar ağı olmadan, doku mühendisli deri grefti zorluk konak doku ile inosculating var. Bu nedenle, genel olarak bu hipotezin Kolajen ve TSK ile kombinasyon halinde bir çift-katlı olarak kullanılan fibrin, kan damarı, dermal ve re-epitelizasyonu işlemlerin bir veya daha fazla kademede iyileştirerek yara iyileşmesi kat azalacaktır olup.

Fibrin bir monomerik fibrinojen türetilen fibrinopeptide ve trombin aracılı bölünme sonra oluşan çok yönlü bir biyopolimerdir. Fibrin hemostatik bir madde (ABD Gıda ve İlaç İdaresi tarafından onaylanmış) gibi ve bu tür yumuşak doku diseksiyonu gibi işlemler de dahil olmak üzere klinik uygulamalar, çeşitli bir mastik klinik olarak kullanılmıştır. Ticari saflaştırılmış allojenik fibrinojen ve trombin gelen fibrin hidrojeller doku mühendisliği uygulamaları çeşitli son on yıl içinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Ancak, bazı büyük dezavantajları in fibrin hidrojel kullanarak doku mühendisliği yapılarının uygun oluşumu önce), düşük mekanik sertlik, ve 3) hızla bozulması 2 küçültmek için iskele için 1) potansiyel olabilir. Bu sorunların üstesinden gelmek için, fibrin kullanımı, daha iyi bir üç boyutlu bir doku-mühendislik iskelesi olarak hizmet etmek için daha önce yapılması gerekir. Bu tür bir yaklaşım, polietilen glikol (PEG-Fibrin) ile fibrin kopolimerize edilmektedir. Bizim ön çalışma değiştirilmemiş fibrin dahil diğer hidrojel örtüler, üzerinde yara iyileşmesinde avantajlı hale PEG-fibrin birçok benzersiz özellik göstermiştir. Pegile-fibrin sentetik hidrojeller ve doğal malzemelerin hem de benzersiz özellikler sergiler. Spesifik olarak, PEG varlığının eksüdaların yönetilmesi için bir çok hidrate (>% 90 su) nemli çevre sağlar. İkinci olarak, fibrin varlığında malzemeye biyobozunurluk confers, ancak önceden sonuçlar pegile fibrin unPEGylated fibrin fazla in vitro olarak önemli ölçüde daha kararlı olduğunu göstermektedir

Bizim iki katmanlı bir ikinci bileşeni olan kolajen. Kollajen doğal bir biyomateryal her yerde görülen memeliler ifade ve hücrelerin çeşitli türleri için eklenti doğrudan bir site olarak hizmet vermektedir. Farklı dokular doku fonksiyonel ihtiyaç tipine bağlı olarak, kolajen farklı tipte (tip 1-type29) ifade eder. ) Bir çok gözenekli hidrojel, 4 bizim modeli oldukça çekici hale kollajen diğer doğal özellikleri) o 1 olan o, 2 non-inflamatuar) kollajen hem bütün ve bozulmuş parçalar), 3 biyo-uyumlu olan bu hücre infiltrasyonu destekler ve göç, 5) onu modüle formülasyon ile ayarlanabilir olduğunu ve 7) kolayca ev sahibi doku ile inosculates kök hücreleri, 6) multipotency tutar. Deri ve yumuşak doku rejenerasyonu çalışmalarımız için, kollajen oluşan iki tabakalı kompozit beri doğal bir seçimdirBu son derece derin dermal bölgeleri de dahil olmak üzere deri boyunca ifade edilir, ve bir yara derinliği değerlendirmek için bir belirteç immünhistokimya olarak kullanılabilir.

Bu protokol, biz farklı vasküler hücre tiplerine karşı TSK ayırt ederken aynı anda TSK arasında "stemness" korumak için bir tekniği göstermek. Deri ve alttaki yumuşak doku çalışması için, kollajen ve PEG-fibrin doğrudan uygulanabilir. Ancak, diğer bioscaffold malzemeleri diğer hücre tiplerine ASC ikna etmek için onların keşfedilmeyi eşsiz yeteneklerini incelemek için uygulanabilir. Burada uygulanan teknikle kök hücre fenotipleri kontrolünde hücre dışı matriks önemini vurgulamak için yardımcı olur ve cildin yenilenme katmanlı kompozitlerin aramalarına lends.

Özet

Kritik Adımlar

  • Kollajen fibrilasyon neden ve istikrarlı bir jel str almak için onun doğru izoelektrik pH (pH6.8-7.1) şekilde ayarlanmalıdıructure.
  • PEG sulu PEG raf ömrü (4-5 saat) kısa olduğundan fibrinojen solüsyonu ile karıştırmadan önce taze hazırlanmalıdır.
  • Fibrinojen-PEG karışımı İnkübasyon süresi içinde-inkübasyon jelleşme sırasında bulanık bir opak yağış neden olabilir bu yana 25 dakika (° C 37) geçmemelidir.
  • Pegile fibrinojen çözeltisine trombin ilave edildikten sonra, karışıma hemen kültürü uçlar (bir pipetle nazik bir karıştırma sonrası) dağıtılan edilmelidir. Daha uzun bir süre (> 30 sn) için pipet içinde çözelti karışımı Holding pipet ve eşit şekilde dökülür jeller bulmakta zorluk içinde jelleşme neden olabilir.
  • CSM yatağın üzerinde mikroküreler eşit büyüklükte ve eşit dağılmış hücreleri kullanarak en uygun hücre yükleme için önemlidir. Çapında CSM boyut farklılığı doğrudan eşit olarak dağıtılmış ise ASC-CSM doğrudan t içine hücre göçü etkiler, mikro miligram başına hücre eki için uygun olan yüzey alanı etkilerdiye iskeleleri. Hücre yüklü mikroküreler (ASC-CSM) iskele içinde TSK ve hatta göç sağlamak için kollajen jel üzerinde düzgün bir şekilde dağıtılması gerekmektedir. Artan-KGYS dağılımı çok yoğun ise, hücre göçü jel içindeki belirli bir alana kadar konsantre alacak ve hücre-hücre etkileşim post-göçü sınırlayabilir.
  • Ortamının hacmi hücre kültürü ucun dış oyuğa ilave sağlamak ve iç ve menisküs daha yüksektir. Tipik olarak, bir iç: bu hücreler mikrosferler takılarak kolaylaştırır olarak 1:02 dış hacim oranında, uygundur.

Sınırlamalar

  • Bu yöntem, mevcut mikrosferler toplam yüzey alanı ile sınırlıdır. Daha yüksek bir hücre sayısı arzu edilirse, daha mikrosferler yüzey alanını artırmak için gereklidir.
  • Hücreler mikrosferler ile geçirmek için amaçlanan yana bir zaman gecikmesi üzerine ve jeller içerisinde hücre başlangıç ​​geçiş için görülebilir.
  • Mikrosferler iki jellerin arabirimi (kollajen ve PEG-fibrin) vardır, ve bu jellerin uzak uçlarına hücrelerin göç için daha uzun süre sınırlayabilir / alabilir.
  • Çift katlı inşaatı sırasında, pegile fibrinojen-trombin karışımı kollajen üstüne bir CSM-ASC yatak üzerinde hızlıca eklenmelidir. Bu ASC-KGYS yeniden dağılımı eşit neden olabilir. PEG-fibrin gel döküm sırasında arayüz ASC-KGYS eşitsiz yeniden dağıtılması halinde, jel yapısı yavaş hızla yeniden dağıtmak mikrosferlerin elle ajite olabilir tam jelleşme önce.
  • Bu yöntem, göç eden özelliklere sahip olduğu ve demir bağımsız hücre tipleri sağlamak için uygun olmayabilir hücreleri ile sınırlıdır.
  • Fibrilasyon önce kollajen çözelti asidik pH kalır ve kollajen jel içindeki hücrelerin doğrudan karışımı sınırlar. Makul bir süre (~ 30 dakika) içerisinde ayarlanabilir değilse gibi, hücre canlılığı tehlikeye.
  • G beriBu yapıda kullanılan els ayrı ayrı jeller olası bir bozulma ya da ayırma işlemi işleme sırasında oluşabilecek, katmanıdır. Bu nedenle, in vivo çalışmalar sırasında taşıma kolaylığı sınırlayabilir.

Olası Değişiklikler

  • ASC-KGYS bireysel jeller yerine katmanlama onlara arayüzü içinde eşit olarak dağıtılabilir.
  • TSK ve bireysel jeller içinde yerine CSM sunarak daha doğrudan karışık olabilir, ama bu son derece organize hücre-desenli doku yapıları gelişimini sınırlayabilir.
  • PEG-fibrin döküm sırasında ASC-KGYS düzensiz yeniden dağılımı önlemek için, ASC-KGYS sulu çözeltisi kitosan küçük bir hacmi (% 1 w / v) içerisinde süspanse edildi ve kollajen jel üzerinde eşit dağıtılabilir. Bu kollajen jel tabakası üzerinde ASC-KGYS sıkı bağlanma sağlayacak ve kollajen yüzeyinden ASC-KGYS ile yerinden oynatmamaya önleyecektir.
  • Kendisi tarafından yapı ters bir şekilde kullanılabilir, yani, PEG-fibrin jeller ilk döküm olabilir ve ASC-KGYS kollajen jeller takiben PEG-fibrin jel üstünde tohum olabilir. Aksi takdirde kullanıcı PEG-fibrin jeller aksine, fibrillated kollajen çözüm kuvvetlendirmek için ekstra zaman (30 dakika) gerektirir, çünkü daha ihtiyatlı (ASC-CSM)-PEG-fibrin tabakası üzerinde fibrilizedir kollajen çözüm döküm sağlar. Bu süreç benimseyerek bir ASC-CSM eşit dağılımı sağlamak için emin olabilirsiniz.
  • Jeller (kollajen ve / veya PEG-fibrin jeller) hızlı hücre göçü ve proliferasyonunu şekilde, büyüme faktörleri gibi mitojenler, (örneğin, vasküler endotelyal büyüme faktörü, fibroblast büyüme faktörü) ile dahil edilebilir.

Sorun Giderme

  • PH> 7.2 izoelektrik pH aşarsa, kolajen çözeltisi fibrilasyon sırasında, pH zayıf bir asit çözeltisi ile pH düşürücü, daha kolajen stok solüsyonu ilave biri tarafından yeniden ayarlanması gerekmektedir.
  • CSM hazırlarken, eğer boyutu occu büyük bir varyasyonSonra RS, parametreler bir çok arzu edilen CSM boyutu (kitosan stok solüsyonu viskozite, yüzey aktif madde miktarı, karıştırma hızı vb) verecek şekilde ayarlanabilir.
  • Jeller doldurma yavaş hücre göçü durumunda, ASC-KGYS daha yüksek sayıda jel içine CSM dışarı göç hücrelerin sayısını arttırmak için kullanılabilir.
  • PEG-fibrinojen jelleşme işlemi karışımı (tipik olarak 900 uL yerine 1 mL) eklenmiştir trombinin hacmi kesme ya da trombinin daha düşük bir konsantrasyonunun demirbaş (25 U / ml arasında bir yerde 20 U / ml) hazırlamak tarafından geciktirilebilir . Bu PEG-fibrinojen karışımı yavaş jelleşme sağlar ve dolayısıyla ASC-ÇKYS üzerinden pegile-fibrinojen ve trombin karışımı ihtiyatlı döküm için ekstra zaman verir.
  • Bir faz ayrılması oluşursa inkübasyon sırasında, (kollajen ve fibrin jel arasında), steril bir teflon 'O' ring jel evreleri tespit sağlamak için üst yapı üzerine yerleştirilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Hiçbir rakip mali çıkarlarını var.

Feragatname

Burada yer alan görüşler ya da iddiaların yazarların özel görünümleri ve resmi olarak veya Savunma ya da ABD Hükümeti Bölümü görüşlerini yansıtan tefsir edilmesi değildir. Yazarlar, ABD Hükümeti çalışanları, ve bu çalışma resmi görevlerinin bir parçası olarak hazırlandı. Tüm çalışmalar ABD Ordusu Tıbbi Araştırma ve Malzeme Komutanlığı tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma ABD Ordusu Tıbbi Araştırma ve Malzeme Komutanlığı Kurumsal Değerlendirme Kurulu tarafından onaylanan protokole göre incelenen ve onaylanan bir protokol çerçevesinde yürütülmüştür.

Acknowledgments

SN Pittsburgh Doku Mühendisliği Girişimi bir Doktora Sonrası Araştırma Bursu Grant tarafından desteklenmiştir. DOZ Cenevre Vakfı tarafından verilen bir hibe ile desteklenmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) GIBCO, by Life Technologies 14175 Consumable
Fetal Bovine Serum Hyclone SH30071.03 Consumable
Collagenase Type II Sigma-Aldrich C6685 Consumable
70-μm Nylon Mesh Filter BD Biosciences 352350 Consumable
100-μm Nylon Mesh Filter BD Biosciences 352360 Consumable
MesenPRO Growth Medium System Invitrogen 12746-012 Consumable
L-Glutamine GIBCO, by Life Technologies 25030 Consumable
CaCl2.2H2O Sigma-Aldrich C8106 Consumable
T75 Tissue Culture Flask BD Biosciences 137787 Consumable
Chitosan Sigma-Aldrich 448869 Consumable
Acetic Acid Sigma-Aldrich 320099 Consumable
N-Octanol Acros Organics 150630025 Consumable
Sorbitan-Mono-Oleate Sigma-Aldrich S6760 Consumable
Potassium Hydroxide Sigma-Aldrich P1767 Consumable
Acetone Fisher Scientific L-4859 Consumable
Ethanol Sigma-Aldrich 270741 Consumable
Trinitro Benzenesulfonic Acid Sigma-Aldrich P2297 Consumable
Hydrochloric Acid Sigma-Aldrich 320331 Consumable
Ethyl Ether Sigma-Aldrich 472-484 Consumable
8-μm Tissue Culture Plate Inserts BD Biosciences 353097 Consumable
1.5-ml Microcentrifuge Tubes Fisher Scientific 05-408-129 Consumable
MTT Reagent Invitrogen M6494 Consumable
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich D8779 Consumable
Qtracker Cell Labeling Kit(Q Tracker 655) Molecular Probes, Life Technologies Q2502PMP Consumable
Type 1 Collagen Travigen 3447-020-01 Consumable
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich S8045 Consumable
12-Well Tissue Culture Plates BD Biosciences 353043 Consumable
Fibrinogen Sigma-Aldrich F3879 Consumable
Thrombin Sigma-Aldrich T6884 Consumable
Benztriazole Derivative of Polyethylene Sunbio DE-034GS Consumable
Tris Buffer Tablet (pH 7.6) Sigma-Aldrich T5030 Consumable
Centrifuge Eppendorf 5417R Equipment
Orbital Shaker New Brunswick Scienctific C24 Equipment
Humidified Incubator with Air-5% CO2 Thermo Fisher Scientific, Inc. Model 370 Equipment
Overhead Stirrer IKA Visc6000 Equipment
Magnetic Stirrer Corning PC-210 Equipment
Vacuum Desiccator - - Equipment
Particle Size Analyzer Malvern Instruments STP2000 Spraytec Equipment
Water Bath Fisher Scientific Isotemp210 Equipment
Spectrophotometer Beckman Coulter Inc. Beckman Coulter DU 800UV/Visible Spectrophotometer Equipment
Vortex Diagger 3030a Equipment
Microplate Reader Molecular Devices SpectraMax M2 Equipment
Light/Fluorescence Microscope Olympus Corporation IX71 Equipment
Confocal Microscope Olympus Corporation FV-500 Laser Scanning Confocal Microscope Equipment
Scanning Electron Microscope Carl Zeiss, Inc. Leo 435 VP Equipment
Transmission Electron Microscope JEOL JEOL 1230 Equipment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Natesan, S. A bilayer construct controls adipose-derived stem cell differentiation into endothelial cells and pericytes without growth factor stimulation. Tissue Eng. Part A. 17, 941-953 (2011).
  2. Nuttelman, C. R., Tripodi, M. C., Anseth, K. S. Synthetic hydrogel niches that promote hMSC viability. Matrix Biol. 24, 208-218 (2005).
  3. Benoit, D. S. Integrin-linked kinase production prevents anoikis in human mesenchymal stem cells. J Biomed Mater Res A. 81, 259-268 (2007).
  4. Willerth, S. M., Sakiyama-Elbert, S. E. Combining stem cells and biomaterial scaffolds for constructing tissues and cell delivery. (2008).
  5. Natesan, S. Adipose-derived stem cell delivery into collagen gels using chitosan microspheres. Tissue Eng. Part A. 16, 1369-1384 (2010).
  6. Bubnis, W. A., Ofner, M. C. 3rd The determination of epsilon-amino groups in soluble and poorly soluble proteinaceous materials by a spectrophotometric method using trinitrobenzenesulfonic acid. Anal. Biochem. 207, 129-133 (1992).
  7. Zhang, G. A PEGylated fibrin patch for mesenchymal stem cell delivery. Tissue Eng. 12, 9-19 (2006).
  8. Bornstein, M. B. Reconstituted rattail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes. Lab Invest. 7, 134-137 (1958).
  9. Zhang, G. Vascular differentiation of bone marrow stem cells is directed by a tunable three-dimensional matrix. Acta Biomater. 6, 3395-3403 (2010).
  10. Rochon, M. H. Normal human epithelial cells regulate the size and morphology of tissue-engineered capillaries. Tissue Eng. Part A. 16, 1457-1468 (2010).
  11. Liu, H., Collins, S. F., Suggs, L. J. Three-dimensional culture for expansion and differentiation of mouse embryonic stem cells. Biomaterials. 27, 6004-6014 (2006).
ASC farklılaşma kontrol için bir iki tabakalı Hidrojel mühendislik
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Natesan, S., Zamora, D. O., Suggs, L. J., Christy, R. J. Engineering a Bilayered Hydrogel to Control ASC Differentiation. J. Vis. Exp. (63), e3953, doi:10.3791/3953 (2012).More

Natesan, S., Zamora, D. O., Suggs, L. J., Christy, R. J. Engineering a Bilayered Hydrogel to Control ASC Differentiation. J. Vis. Exp. (63), e3953, doi:10.3791/3953 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter