مع تدبير هيدروجيل Bilayered التحكم ASC التمايز
Summary
هذا البروتوكول يركز على الاستفادة من القدرة الكامنة للخلايا الجذعية لاتخاذ جديلة من مصفوفة من خارج الخلية المحيطة بها، ويكون ذلك حافزا على التمايز إلى الظواهر المتعددة. هذا المخطوط طرق تمتد لدينا وصف وتوصيف نموذج الاستفادة من هيدروجيل bilayered، ويتألف من الربط بين الليفين والكولاجين، وإلى وقت واحد شارك في تمييز الخلايا الجذعية الدهنية المشتقة<sup> 1</sup>.
Abstract
اكتسبت البوليمرات الطبيعية على مر السنين أكثر أهمية بسبب توافق مع الحياة التي تستضيفهم، والقدرة على التفاعل مع الخلايا في المختبر والمجراة. وثمة مجال البحوث التي تبشر بالخير في الطب التجديدي هو استخدام اندماجي من المواد الحيوية الرواية والخلايا الجذعية. استراتيجية أساسية في مجال هندسة الأنسجة هو استخدام ثلاثي الأبعاد سقالة (على سبيل المثال، decellularized المصفوفة خارج الخلية، الهلاميات المائية، مايكرو / نانو جزيئات) لتوجيه وظيفة الخلية. وقد تطورت هذه التكنولوجيا من اكتشاف أن الخلايا في حاجة الى الركيزة التي تقوم عليها يستطيعون الالتزام بها وتتكاثر، والتعبير عن النمط الظاهري الخلوية المتباينة وظيفة 2-3. وفي الآونة الأخيرة، كما قد تقرر أن الخلايا ليس فقط استخدام هذه ركائز للانضمام، ولكن أيضا تتفاعل وتأخذ العظة من الركيزة المصفوفة (على سبيل المثال، المصفوفة خارج الخلية، ECM) 4. ولذلك، فإن الخلايا والسقالات وجود اتصال متبادل أنيعمل للسيطرة على تنمية الأنسجة، وتنظيم، وظيفة في نهاية المطاف. الخلايا الجذعية الدهنية المشتقة من (ASCs) هي الوسيطة، والخلايا الجذعية غير hematopoetic الموجودة في الأنسجة الدهنية التي يمكن أن تظهر نسب متعددة التمايز وتكون بمثابة مصدر متاحة بسهولة من الخلايا (أي ما قبل بطائن الأوعية الدموية وpericytes). فرضيتنا هي التي يمكن أن توجه الخلايا الجذعية الدهنية المشتقة من الظواهر المختلفة في اتجاه واحد منهم من قبل المشاركة في زراعة ببساطة في مصفوفات bilayered 1. ويركز مختبر لدينا في التئام الجروح الجلدية. تحقيقا لهذه الغاية، أنشأنا مصفوفة واحدة مركب من المواد الحيوية الطبيعية، الليفين، والكولاجين، والشيتوزان التي يمكن أن تحاكي خصائص ووظائف بيئة جرح جلدي محددة ECM الشفاء.
Protocol
Discussion
وASCs معروفة لسهولة لهم من العزلة والقدرة على التمييز تجاه مختلف أنواع الخلايا. مع التقنيات الموضحة في هذه المخطوطة، ونحن قادرون على استغلال اللدونة من ASCs من خلال تعريض هذه الخلايا إلى biomatrices متعددة في وقت واحد. كما الخلايا تهاجر بعيدا عن قاعدة CSM ويدخل بيئتهم المحيطة خ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
كان مدعوما من قبل SN منحة زمالة ما بعد الدكتوراه في الهندسة من بيتسبرغ مبادرة الأنسجة. ويدعم منطقة دبي للتعهيد عن طريق منحة من منح المؤسسة جنيف.
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14175 | Consumable |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | Consumable |
| Collagenase Type II | Sigma-Aldrich | C6685 | Consumable |
| 70-μm Nylon Mesh Filter | BD Biosciences | 352350 | Consumable |
| 100-μm Nylon Mesh Filter | BD Biosciences | 352360 | Consumable |
| MesenPRO Growth Medium System | Invitrogen | 12746-012 | Consumable |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 | Consumable |
| CaCl2.2H2O | Sigma | C8106 | Consumable |
| T75 Tissue Culture Flask | BD Biosciences | 137787 | Consumable |
| Chitosan | Sigma-Aldrich | 448869 | Consumable |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099 | Consumable |
| N-Octanol | Acros Organics | 150630025 | Consumable |
| Sorbitan-Mono-Oleate | Sigma-Aldrich | S6760 | Consumable |
| Potassium Hydroxide | Sigma-Aldrich | P1767 | Consumable |
| Acetone | Fisher Scientific | L-4859 | Consumable |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 270741 | Consumable |
| Trinitro Benzenesulfonic Acid | Sigma-Aldrich | P2297 | Consumable |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | 320331 | Consumable |
| Ethyl Ether | Sigma-Aldrich | 472-484 | Consumable |
| 8-μm Tissue Culture Plate Inserts | BD Biosciences | 353097 | Consumable |
| 1.5-ml Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | Consumable |
| MTT Reagent | Invitrogen | M6494 | Consumable |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8779 | Consumable |
| Qtracker Cell Labeling Kit(Q Tracker 655) | Molecular probes | Q2502PMP | Consumable |
| Type 1 Collagen | Travigen | 3447-020-01 | Consumable |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | Consumable |
| 12-Well Tissue Culture Plates | BD Biosciences | 353043 | Consumable |
| Fibrinogen | Sigma | F3879 | Consumable |
| Thrombin | Sigma | T6884 | Consumable |
| Benztriazole Derivative of Polyethylene | Sunbio | DE-034GS | Consumable |
| Tris Buffer Tablet (pH 7.6) | Sigma | T5030 | Consumable |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | Equipment |
| Orbital Shaker | New Brunswick Scienctific | C24 | Equipment |
| Humidified Incubator with Air-5% CO2 | Thermo Scientific | Model 370 | Equipment |
| Overhead Stirrer | IKA | Visc6000 | Equipment |
| Magnetic Stirrer | Corning | PC-210 | Equipment |
| Vacuum Desiccator | – | – | Equipment |
| Particle Size Analyzer | Malvern | STP2000 Spraytec | Equipment |
| Water Bath | Fisher Scientific | Isotemp210 | Equipment |
| Spectrophotometer | Beckman | Beckman Coulter DU 800UV/Visible Spectrophotometer | Equipment |
| Vortex | Diagger | 3030a | Equipment |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax M2 | Equipment |
| Light/Fluorescence Microscope | Olympus | IX71 | Equipment |
| Confocal Microscope | Olympus | FV-500 Laser Scanning Confocal Microscope | Equipment |
| Scanning Electron Microscope | Carl Zeiss MicroImaging | Leo 435 VP | Equipment |
| Transmission Electron Microscope | JEOL | JEOL 1230 | Equipment |
References
- Natesan, S. A bilayer construct controls adipose-derived stem cell differentiation into endothelial cells and pericytes without growth factor stimulation. Tissue Eng. Part A. 17, 941-953 (2011).
- Nuttelman, C. R., Tripodi, M. C., Anseth, K. S. Synthetic hydrogel niches that promote hMSC viability. Matrix Biol. 24, 208-218 (2005).
- Benoit, D. S. Integrin-linked kinase production prevents anoikis in human mesenchymal stem cells. J Biomed Mater Res A. 81, 259-268 (2007).
- Willerth, S. M., Sakiyama-Elbert, S. E. Combining stem cells and biomaterial scaffolds for constructing tissues and cell delivery. , (2008).
- Natesan, S. Adipose-derived stem cell delivery into collagen gels using chitosan microspheres. Tissue Eng. Part A. 16, 1369-1384 (2010).
- Bubnis, W. A., Ofner, M. C. The determination of epsilon-amino groups in soluble and poorly soluble proteinaceous materials by a spectrophotometric method using trinitrobenzenesulfonic acid. Anal. Biochem. 207, 129-133 (1992).
- Zhang, G. A PEGylated fibrin patch for mesenchymal stem cell delivery. Tissue Eng. 12, 9-19 (2006).
- Bornstein, M. B. Reconstituted rattail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes. Lab Invest. 7, 134-137 (1958).
- Zhang, G. Vascular differentiation of bone marrow stem cells is directed by a tunable three-dimensional matrix. Acta Biomater. 6, 3395-3403 (2010).
- Rochon, M. H. Normal human epithelial cells regulate the size and morphology of tissue-engineered capillaries. Tissue Eng. Part A. 16, 1457-1468 (2010).
- Liu, H., Collins, S. F., Suggs, L. J. Three-dimensional culture for expansion and differentiation of mouse embryonic stem cells. Biomaterials. 27, 6004-6014 (2006).
