Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

Het vervaardigen van een dubbellagige Hydrogel om ASC differentiatie Controle

doi: 10.3791/3953 Published: May 25, 2012

Summary

Dit protocol richt zich op gebruik te maken van de inherente vermogen van stamcellen om cue te nemen van hun omringende extracellulaire matrix en worden aangezet om te differentieren naar verschillende fenotypes. Deze methode manuscript strekt de beschrijving en karakterisering van een model met behulp van een dubbellagige hydrogel, bestaande uit PEG-fibrine en collageen, gelijktijdig gelijktijdig onderscheid vet-stamcellen

Abstract

Natuurlijke polymeren door de jaren heen hebben meer belang, omdat van hun gastheer biocompatibiliteit en het vermogen om samen te werken met cellen in vitro en in vivo. Een gebied van onderzoek die belofte houdt in de regeneratieve geneeskunde is de combinatorische gebruik van nieuwe biomaterialen en stamcellen. Een fundamentele strategie op het gebied van tissue engineering is het gebruik van drie-dimensionale steiger (bijvoorbeeld gedecellulariseerde extracellulaire matrix, hydrogels, micro / nano deeltjes) voor de aansturing van de celfunctie. Deze technologie heeft zich ontwikkeld uit de ontdekking dat cellen een substraat waarop ze kunnen zich nodig hebben, vermenigvuldigen, en uiten hun gedifferentieerde cellulaire fenotype en functie 2-3. Meer recent heeft ook vastgesteld dat de cellen niet alleen deze substraten te gebruiken voor de naleving, maar ook interactie en neem signalen uit de matrix substraat (bijvoorbeeld, extracellulaire matrix, ECM) 4. Daarom werden de cellen en steigers een wederzijdse verbinding diedient om te controleren weefsel ontwikkeling, organisatie, en de uiteindelijke functie. Vet-afgeleide stamcellen (ASC) mesenchymale zijn, niet-hematopoëtische stamcellen aanwezig in vetweefsel dat multi-lijn differentiatie kan vertonen en dienen als een gemakkelijk toegankelijke bron van cellen (dat wil zeggen pre-vasculaire endotheel en pericyten). Onze hypothese is dat het vet-afgeleide stamcellen kunnen worden gericht op verschillende fenotypes tegelijk door gewoon co-kweken ze in dubbellagige matrices 1. Ons laboratorium is gericht op dermale wondgenezing. Daartoe hebben we een samengestelde matrix van natuurlijke biomaterialen fibrine, collageen en chitosan kunnen nabootsen die de eigenschappen en functies van de dermale specifieke wondgenezing ECM omgeving.

Protocol

1. Isoleren Adipose-stamcellen (ASC) 1, 5

Opmerking: Alle procedures werden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders vermeld.

  1. Isoleer rat perirenal en epididymis vet en wassen met een gebufferde zoutoplossing steriele Hank's (HBSS) met 1% foetaal bovine serum (FBS) zoals eerder beschreven 5. Deze studie is uitgevoerd in overeenstemming met de Animal Welfare Act, de uitvoerende Animal Welfare verordeningen en in overeenstemming met de beginselen van de Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren.
  2. Gehakt het weefsel en breng 1-2 g in 25 ml HBSS met 1% FBS in een 50 ml buis en centrifugeer bij 500 g gedurende 8 min bij kamertemperatuur.
  3. Verzamelen de vrij zwevende vetweefsel laag en breng 125 ml erlenmeyer en behandelen met 25 ml collagenase type II (200 U / ml) in HBSS 45 min bij 37 ° C op een schudapparaat (125 rpm). Verwijder voorzichtig de vloeibare fractie (onder olie en vet laag) door het pipetteren en opeenvolgend filteren door middel van een 100 - pm en 70 - um nylon mesh filter. Centrifugeer het filtraat bij 500 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur zuig de supernatant en tweemaal was de pellet met 25 ml HBSS.
  4. Resuspendeer de celpellet in 50 ml kweekmedium (MesenPRO RS basismedium) aangevuld met MesenPRO RS groeisupplement, antibiotica antimycotische (100 U / ml penicilline G 100 ug / mL streptomycine sulfaat en 0,25 ug / ml amfotericine B), en 2 mM L-glutamine en pipet cellen in twee T75 kolf (25 ml / kolf).
  5. Cultuur de ASC in een 5% CO2-bevochtigde incubator bij 37 ° C (passage 2-4 ASC worden gebruikt voor alle experimenten).

2. Voorbereiden Chitosan microsferen (CSM)

Opmerking: Alle procedures werden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders vermeld.

    5. Emulgeren van een waterige oplossing van chitosan (6 ml van 3% w / v chitosan in 0,5 M azijnzuur) in een 100 ml van een oliefase mengsel van sojaolie, n-octanol (1:2 v / v) en 5 % sorbitan-mono-oleaat (span 80) emulgator met overhead (1700 rpm) en magnetische roerstaaf (1000 rpm) tegelijkertijd in tegengestelde richting. Deze dubbele mengmethode zorgt ervoor dat micellen eerste gevormd voordat verknoping optreedt kan in oplossing blijven en niet om op de bodem. Bovendien is de magnetische roerstaaf helpt bij het de-aggregatie van chitosan tijdens micel vorming en rigidization.
  1. Continu het mengsel Roer geroerd gedurende ongeveer 1 uur tot een stabiele water-in-olie emulsie wordt verkregen. Start ionische verknoping, met toevoeging van 1,5 ml 1% w / v kaliumhydroxide in n-octanol elke 15 min wordt 4 h (24 ml totaal)
  2. Droog de herstelde bolletjes in een vacuümexsiccator en analyseren zonder verdere verwerking. U bepaalt de gemiddelde CSM deeltjesgrootte oppervlak milligram en de toestel kubieke volume met een deeltjesgrootte-analysator.
  3. Voor de daaropvolgende experimenten, was de CSM drie keer met steriel water om de resterende zouten te verwijderen en door te wassen 's nachts met 5 ml absolute ethanol te steriliseren.

3. Het bepalen vanHet aantal vrije aminogroepen in CSM

Opmerking: Alle procedures werden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders vermeld.

  1. Bepaal het aantal vrije aminogroepen in CSM na ionische verknoping met de trinitro benzeensulfonzuur (TNBS) zuur assay van Bubnis en Ofner 6. Incubeer 5 mg microsferen met 1 ml 0,5% TNBS oplossing in een 50 ml glazen buis gedurende 4 uur bij 40 ° C en hydrolyseren met de toevoeging van 3 ml 6N HCl bij 60 ° C gedurende 2 uur.
  2. Koel de monsters tot kamertemperatuur en extraheren van de vrije TNBS door toevoeging van 5 ml gedeioniseerd water en 10 ml ethylether.
  3. Verwarm een ​​5 ml aliquot van de waterfase tot 40 ° C in een waterbad gedurende 15 minuten om eventuele ether, afkoelen tot kamertemperatuur, verdampen en verdund met 15 ml water.
  4. Meet de absorptie bij 345 nm met een spectrofotometer TNBS oplossing zonder chitosan als blanco en chitosan voor CSM pherstel van het totale aantal aminogroepen bepalen. Schatting van het aantal vrije aminogroepen van de CSM ten opzichte van chitosan.

4. Laden ASC in CSM

Opmerking: Alle procedures werden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders vermeld.

  1. Equilibreer 5 mg gesteriliseerd CSM's uit paragraaf 2.5 in steriele HBSS 's nachts en toe te voegen aan een 8 - um poriegrootte membraan cultuur plaat insert (24-wells plaat).
  2. Nadat de CSM hebben zich op het membraan voorzichtig zuig de HBSS en voeg 300 ul groeimedium aan de binnenzijde van het inzetstuk en 700 ul van kweekmedia om de buitenzijde van het inzetstuk.
  3. Hersuspenderen ASC de juiste concentratie (1 x 4 tot 04 oktober x 10 4) in 200 pi groeimedium en zaad via CSM in de petrischaal inzetstuk. Het eindvolume van medium in de cultuur inzetstuk, na het zaaien, 500 ul.
  4. Incubaten ASC uitgezaaid CSM gedurende 24 uur in een 5% CO2 bevochtigde incubator bij 37 ° C.

5. Bepalen van het percentage van de ASC laden en levensvatbaarheid van de cellen in CSM

Opmerking: Alle procedures werden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders vermeld.

  1. Na de incubatie pipet de ASC-loaded CSM in een steriele 1,5 ml microcentrifugebuis zonder verstoring van de cellen die zijn gemigreerd naar de insert membraan.
  2. Verwijder het resterende medium en voeg 250 ul vers groeimedium de buis.
  3. Om elke buis, voeg 25 ul MTT (3 - [4,5-dimethylthiozole-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromide bromide] oplossing (5 mg / ml) en 4 h incuberen in een 5% CO2 bevochtigde incubator bij 37 ° C.
  4. Na incubatie verwijderen medium, voeg 250 ul dimethyl sulfoxide en vortex het mengsel gedurende 2-5 minuten de formazan complex oplosbaar.
  5. Centrifugeer de CSM op 2700 g5 min uit de pipet supernatant en de golflengte absorptie bij 570 nm en 630 nm met een standaard plaatlezer bepalen volgens MTT fabrikant.
  6. Bepaal de cel is gekoppeld met de CSM opzichte van de waarden verkregen uit gedefinieerd ASC getallen gekweekt tot een standaardcurve ontwikkelen.

6. Bereiding en karakterisering van ASC-CSM Ingebed in PEG-fibrine Gels

Opmerking: Alle procedures werden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders vermeld.

  1. Polyethyleenglycol (PEG) fibrine (PEG-fibrine) hydrogel bereid door Suggs et al. 7 door het oplossen van de succinimidyl glutaraat gewijzigd polyethyleen glycol (PEG, 3400 Da). Met 4 ml Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS, pH 7,8) en filter gesteriliseerd een 0,22 pm filter net voordat het experiment. Opgeloste PEG is alleen effectief in deze toepassing voor de eerste 3-4 uur.
  2. Meng 500 &mu, l fibrinogeen voorraad (40 mg / ml in TBS, pH 7,8) en 250μl van PEG voorraad in een cultuur en een 6-wells plaat en incubeer 20 minuten in een 5% CO2 bevochtigde incubator bij 37 ° C. Dit mengsel vormt een molaire concentratie verhouding van 1:10, SG-PEG-SG: fibrinogeen.
  3. Breng 250 ul ASC-CSM in een concentratie van 5 mg CSM (≈ 2 x 10 4 cellen) en meng met de gePEGyleerde fibrinogeenoplossing.
  4. Onmiddellijk voeg 1 ml trombine voorraad (25U/mL) en snel een of twee keer fijnstampen met de pipet. Na menging trombine met de PEG-fibrinogeen onmiddellijk plaats de cel-gel mengsel in een 12-well plaat en geïncubeerd in een 5% CO2 bevochtigde incubator bij 37 ° C gedurende 10 min om voor volledige gelering. Omdat de gelering tijd is snel, probeer dan niet en de gel oplossing te houden binnen de pipet tip voor langer dan 5 seconden. De gePEGyleerde fibrinogeen wordt gesplitst door trombine en vormt een gePEGyleerd fibrine hydrogel. Als zodanig the uiteindelijke gel product wordt aangeduid als PEG-fibrine.
  5. Tweemaal wassen PEG-fibrine gels met HBSS en geïncubeerd met alfa minimaal essentieel medium (MEM-α) aangevuld met 10% FBS in een 5% CO2 bevochtigde incubator bij 37 ° C.
  6. Let op de migratie van cellen van CSM in de gel over een 11-daagse periode met behulp van standaard lichtmicroscopie technieken.

7. Bereiding en karakterisering van ASC-CSM Ingebed in Collageen Gels

Opmerking: Alle procedures werden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders vermeld.

  1. Mix ASC-CSM (5 mg met ≈ 2 x 10 4 cellen) met type 1 collageen (7,5 mg / ml) uit rattenstaart pezen volgens de werkwijze van Bornstein 8 en fibrilleren nadat de pH op 6,8 met 2N NaOH.
  2. Voeg de gefibrilleerde collageen ASC-CSM mengsel tot een 12-well plaat en gedurende 30 min in een 5% CO2 humidimelde incubator bij 37 ° C.
  3. Na volledige fibrillatie incuberen de collageen ASC-CSM gels tot 11 dagen in een 5% CO2 bevochtigde incubator bij 37 ° C.
  4. Let op de migratie van cellen van CSM in de gel over een 11-daagse periode met behulp van standaard microscopische technieken.

8. Ontwikkeling van dubbellagige PEG-fibrine-(ASC-CSM)-Collageen Gel constructen

Opmerking: Alle procedures werden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders vermeld.

  1. Ontwikkeling van de bilaag construeren bereiden zowel het collageen en het PEG-fibrine gels zoals hierboven beschreven, met geringe modificaties. Kortom, aan de trekkende en co-inductie eigenschappen van een enkele bron van stamcellen met behulp van twee bioscaffolds te bestuderen, "sandwich" van de ASC-CSM tussen het collageen en de PEG-fibrine steigers met behulp van een proces van vier stappen: 1) Load ASC op CSM, 2) gegoten gefibrilleerde collageen gel en laag de ASC-CSM kralen over de collagen gel, 3) cast PEG-fibrinegel over de ASC-CSM-collageen gel en laat gel te stollen, en 4) medium toe te voegen aan goed en voeg naar cellen in vitro te bestuderen of te verwijderen inzetstuk voor in vivo toepassingen (zie figuur 1 ).
  2. Bereid een 1 ml collageen type 1 (7,5 mg / ml) mengsel zoals beschreven in 7.1 zonder toevoeging ASC-CSM aan het mengsel. Plaats het mengsel in een 6-wells weefselkweekplaten element (8 urn poriegrootte) en geïncubeerd gedurende 30 min in een 5% CO2 bevochtigde incubator bij 37 ° C.
  3. Na volledige fibrillatie, laag over het collageen oppervlak 5 mg ASC-CSM (10, 000 cellen / mg) gesuspendeerd in kweekmedia (200 pi). Nadat de microsferen hebben zich over de gel bereiden PEG-fibrinegel zoals beschreven in 6.0 zonder toevoeging ASC-CSM aan het mengsel en de laag gePEGyleerde fibrinogeen / thrombine-oplossing via ASC-CSM-collageen lagen. Bij de opstelling PEG-fibrine gel, met 250 pi celkweekmedium in plaats van thij 250 pl medium waarin de cellen.
  4. Na voltooiing incuberen de constructen voor 30 min in een 5% CO2 bevochtigde incubator volledige gelering bereiken voordat het voeden van de construct met kweekmedium.
  5. Na volledige gelering, place 1 ml medium in de bovenste ruimte op de constructie en 3 mL medium in de onderkast.

9. Het maken van Stock-oplossingen

Opmerking: Alle procedures werden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders vermeld.

  • Calciumchloride voorraad (40 mm): Gebruik alleen CaCl 2 .2 H 2 O. Los 588,4 mg CaCl2 0,2 H 2 O met 100 ml gedeïoniseerd water. Steriliseren met een 0,22 pm filter.
  • Polyethyleenglycol: PEG is zeer reactief met zuurstof en kan geoxideerd bij blootstelling aan lucht in de ruimte. Als zodanig dient PEG worden bewaard onder stikstof (N2) atmosfeer. Accurately wegen 32 mg in een 2-ml centrifugebuis (zorg ervoor dat de buizen te reinigen met N2 voor gebruik) en bewaar bij -80 ° C tot aan gebruik. Los 32 mg PEG in 4 ml TBS oplossing voor gebruik.
    De volgende oplossingen moeten worden vers gemaakt voor elke experiment.
  • TBS oplossing (pH 7,75-7,77 bij 25 ° C, pH bij 25 ° C zeer kritisch). Om 15 ml van de TBS-oplossing te bereiden, zorgvuldig te ontbinden een buffer tablet in filter-gesteriliseerd gedeïoniseerd water en aan te passen aan de gewenste pH. Bewaar de stockoplossing-voor te bereiden het vers elke keer.
  • Fibrinogeen oplossing (40 mg / ml). Los fibrinogeen poeder TBS de fibrinogeenconcentratie 40 mg / ml. Overnacht opgelost met behulp van een magnetische roerder bij 4 ° C. Het is gemakkelijk om de gehele een-g hoeveelheid opgelost met de vereiste hoeveelheid TBS. De volgende dag, verwijder de fibrinogeen van 4 ° C (meestal bewolkt) en laat hette verwarmen in een waterbad tot een homogene oplossing wordt verkregen. Tenslotte filter steriliseren fibrinogeen met een 0,45 pm-filter.
  • Trombine-oplossing (25 eenheden / ml): Om de trombine-oplossing te maken, weeg de benodigde hoeveelheid en los op met de voorbereide 40 mM CaCl 2 .2 H 2 O. Het is altijd een goede gewoonte om de hele flacon van trombine te gebruiken om de voorraad te maken. Voorbeeld: Los een fles van 5 kU trombine met 200 mM CaCl 2 .2 H 2 O, hoeveelheid en bewaar bij -20 ° C.

10. Representatieve resultaten

Het algemene doel van de techniek die hier is om het potentieel van gelijktijdige matrix-gestuurde differentiatie van ASC aan te tonen in meerdere fenotypes met behulp van CSM als transportmiddel. We tonen een in vitro strategie om stamcellen te bevrijden van CSM in een dubbellagige collageen-PEG-fibrine schavot. Karakterisering van ASC ingebed in deze steiger revealed dat de ASC-loaded CSM kan worden 'ingeklemd' tussen een laag van collageen en PEG-fibrine gelijktijdig en differentieel te laten inspireren door zowel de extracellulaire omgeving te gedijen onder hun nieuwe omstandigheden. We hebben eerst kenmerkend was voor de mogelijkheid voor het modelsysteem levensvatbaarheid van de cellen en migrerende capaciteiten te behouden. Collageen ondersteunde het vermogen van ASC hun "stemness ', zoals werd aangetoond door hun expressie van Stro-1 en fibroblast-achtige morfologie (figuur 2D en 2F) te handhaven. Daarentegen PEG-geïnduceerde fibrine de ASC onderscheid naar een vasculaire fenotype, zoals blijkt uit de buisvormige structuur morfologie, de endotheelcel-specifieke expressie van von Willebrand factor (Figuur 2E en 2G) en pericyte-specifieke expressie van NG2 en platelet-derived growth factor receptor beta (PDGFRβ) (gegevens niet getoond). Bovendien zijn deze waargenomen fenotypes leek in het begin van de cultuur voorkomen en hielden gedurende 11 dagen, net als demook aangetoond in figuur 3.

Tabellen en Figuren

Voordelen van dubbellaag Construct:

  • De steiger alleen, zonder cellen voeren als een bioactieve scaffold.
  • PEG-fibrine kan induceren stamcellen te differentiëren zonder toevoeging van groeifactoren.
  • Collageen kan helpen bij het handhaven van de stamcellen fenotype van ASC.
  • Een dubbellaag construct kan worden gebruikt als actieve substraat voor andere celtypen migreren en prolifereren (bijvoorbeeld endotheelcellen, fibroblast, keratinocyten gladde spiercellen, pericyten).
  • Het kan gebruikt worden met harde tissue engineering steigers zoals hydroxyaptite of gedemineraliseerd been van harde en zachte weefsel te regenereren.
  • Het kan worden gebruikt om een ​​multi-layered, diverse weefsel-engineering construct (zoals huid-en vaatziekten, vasculaire-epitheliale, huid-en vaatziekten-onderhuidse, enz.) te ontwikkelen.
  • Het maakt gebruik van een single-cell source gelijktijdig te ontwikkelenmeercellige compartimenten.
  • Het heeft het potentieel om te integreren met de gastheer weefsel omdat het van natuurlijke oorsprong.
  • CSM binnen de gel constructie biedt een platform voor cellen om te migreren uit.
  • Chitosan, gebruikt CSM bereiden is een bekende chemo-actieve lokmiddel.
  • Het concept toegepast in deze protocol "matrix aangedreven stamceldifferentiatie" worden toegepast op andere typen stamcellen. Er is echter nader onderzoek gerechtvaardigd om de haalbaarheid van een matrix-gestuurde differentiatie te bepalen. De dubbellagige gel steiger een reservoir om de cellen te leveren in een duurzame en gecontroleerde manier.
  • Na herstel kan de gels nog worden gescheiden in afzonderlijke componenten.

Figuur 1
Figuur 1. Schematische afbeelding van de algemene doelstelling en het proces van de techniek. 1) Adipose-afgeleide stamcellen (ASC) zijn loaded op chitosan microsferen. 2) Collageen wordt vervolgens uitgegoten in een 6-wells insert, de pH op het collageen fibrilleren en het inzetstuk geplaatst in een 6-wells plaat kamer. De ASC-geladen CSM bollen worden dan gelaagd over de collageen. 3) Het gePEGyleerde fibrinogeen wordt gegoten over de collageen (ASC-CSM) en gegeleerd door toevoeging van trombine. 4) Het uiteindelijke construct dubbellaag kan dan worden verwijderd uit de kweek insert en gebruikt voor in vitro of in vivo analyse.

Figuur 2
Figuur 2. Karakterisering van ASC gekweekt in collageen en PEG-fibrine 3D-matrices. A) fase-contrast microfoto van geïsoleerde ASC gepasseerd en in stand gehouden met behulp van routine 2-dimensionale celkweek technieken. Microfoto B, D en F tonen ASC-CSM gekweekt binnen een 3-dimensionale collageen gel; dat C, E en G Show ASC-CSM gekweekt binnen een 3-dimensionale PEG-fibrinegel, zowel op dag 12. In B en C) zijn weergegeven ASC migreren afstand van het gebied CSM in beide typen scaffold. ASC's lijken een afgeplatte, spindel-achtige morfologie in collageen (B) hebben, met behoud van hun uitdrukking van de stamcel marker Stro-1 (D; pijl). Wanneer gekweekt in PEG-fibrine ASC's vertonen meer tube-achtige structuren en gestimuleerd worden tot een dergelijke vasculaire cel markers als von Willebrand Factor (E) uit te drukken. Transmissie electronenmicroscopie toont de typische morfologie aangetoond ASC binnen elke scaffold. ASC in collageen-gel lijkt kleiner filopodia (fl) dat zich uitstrekt van het lichaam van de cel (F), terwijl ASC meestal gevormd lumenale (met het label L) structuren (G; pijl).

Figuur 3
Figuur 3. Morfologische analyse van de ASC-CSM tussen dubbellagen van collageen en PEG-fibrine gels. ASC-CSM's werden "ingeklemd" tussen collageen en PEG-fibrine gels en onderhouden in cultuur voor 11 dagen. De linker column toont ASC migreren en prolifererende binnen de collageen matrix en lijken te nemen op een as-achtige morfologie. De rechterkolom toont ASC's migreren uit de buurt van de CSM en de vorming van buis-achtige structuren in de PEG-fibrine gel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ASC's zijn bekend om hun gemak van isolatie en het vermogen om onderscheid te maken in de richting van verschillende celtypes. Met de technieken beschreven in dit manuscript zijn wij in staat om de plasticiteit van ASC te benutten door het blootstellen van deze cellen om meerdere biomatrices tegelijk. Als cellen weg te migreren van hun CSM basis en voeren hun omringende extracellulaire omgeving, de cellen nemen richtsnoer van het schavot en kan zowel stand te houden "stemness" (collageen) of worden aangezet om te differentiëren in de richting van vasculaire-en vasculaire-ondersteunende celtypen (fibrine). Aangezien ons lab is geïnteresseerd in de huid en weke delen wondgenezing, we strategisch implementeerde een dubbellaag van collageen en fibrine sinds collageen ondersteunt dermale en epidermale regeneratie door de gastheer, terwijl de fibrine natuurlijk induceert vasculaire netwerk vorming 9. Voorts is het nu duidelijk dat overspraak optreedt tussen prolifererende keratinocyten huid, fibroblast en de onderliggende vasculaire netwerk, en dit complexmechanisme is uiterst kritisch voor een goede wondheling 10. Zonder een onderliggende vasculaire netwerk, tissue-engineered huidtransplantaties moeite hebben inosculating met host weefsel. Daarom onze algemene hypothese dat collageen en fibrine, indien gebruikt als dubbellaag in combinatie met ASC zal wondheling verkort door het verbeteren van een of meer fasen van bloedvaten, huid, en re-epithelisatie processen.

Fibrine is een veelzijdig biopolymeer gevormd na trombine-bemiddelde splitsing van fibrinopeptide A uit monomere fibrinogeen. Fibrine is klinisch gebruikt als een hemostatische agent (goedgekeurd door de US Food and Drug Administration) en als kit in een verscheidenheid van klinische toepassingen, met inbegrip van procedures, zoals de weke delen dissectie. Fibrine hydrogelen van commercieel gezuiverd allogene fibrinogeen en thrombine algemeen toegepast in het afgelopen decennium verschillende weefselspecifieke technische toepassingen. Echter, een aantal belangrijke nadelen in het gebruik van een fibrine-hydrogel kan 1) de kans op het schavot te krimpen, 2) lage mechanische stijfheid, en 3) snelle afbraak voor een goede vorming van de tissue-engineered structuren. Om deze problemen te overwinnen, fibrine moet worden gewijzigd voor gebruik als een beter driedimensionale tissue engineering scaffold. Een dergelijke benadering is copolymeriseren de fibrine met polyethyleenglycol (PEG-fibrine). Ons voorbereidend werk heeft aangetoond dat een aantal unieke kenmerken van de PEG-fibrine dat het zinvol is in de wondgenezing ten opzichte van andere hydrogel verbanden, met inbegrip van niet-gemodificeerde fibrine. GePEGyleerde-fibrine vertoont unieke kenmerken van zowel synthetische hydrogels en natuurlijke materialen. Specifiek, de aanwezigheid van PEG een uiterst gehydrateerd (> 90% water) vochtige omgeving voor het beheren exudaten. Ten tweede, de aanwezigheid van fibrine verleent biologische afbreekbaarheid van het materiaal, maar vóór resultaten laten zien dat gePEGyleerde fibrine aanzienlijk stabieler dan in vitro unPEGylated fibrine

De tweede component van onze dubbellaag is collageen. Collageen is een natuurlijk biomateriaal alomtegenwoordig uitgedrukt in zoogdieren en dient als een directe bindingsplaats voor verschillende soorten cellen. De weefsels drukken verschillende collageen (type 1-type29), afhankelijk van het type functionele behoefte van het weefsel. Andere inherente eigenschappen van collageen, dat het zeer aantrekkelijk maken in ons model zijn dat 1) het is niet-inflammatoire, 2) zowel geheel afgebroken onderdelen van collageen biocompatibel zijn, 3) het is een zeer poreuze hydrogel, 4) het ondersteunt cel infiltratie en migratie, 5) onderhoudt multipotent van stamcellen, 6) is instelbaar door het moduleren van formulering, en 7) het gemakkelijk inosculates met host weefsel. Voor onze studies in de huid en weke delen regeneratie, een dubbellaag composiet bestaande uit collageen is een logische keuze, omdatwordt zeer uitgesproken in de huid, inclusief diepe huid gebieden, en kan worden gebruikt als immunohistochemie marker om de diepte van een wond beoordelen.

In dit protocol, demonstreren we een techniek om tegelijkertijd te behouden "stemness" van ASC maar onderscheid te ASC in de richting van verschillende vasculaire celtypen. Voor de studie van de huid en de onderliggende zachte weefsel, collageen en PEG-fibrine rechtstreeks van toepassing zijn. Maar ook andere bioscaffold materialen worden uitgevoerd om hun verkend unieke mogelijkheden te bestuderen om ASC te induceren in andere celtypen. De techniek hier te vinden helpt om benadrukken het belang van de extracellulaire matrix in het controleren van stamcellen fenotypes en leent geloof aan de exploratie van gelaagde composieten voor regeneratie van de huid.

Overzicht

Kritische stappen

  • Collageen moet worden aangepast om de correcte iso-elektrisch pH (pH6.8-7.1) fibrillatie veroorzaken en krijg een stabiele gel structuur.
  • PEG moet vers worden bereid voor het mengen met fibrinogeenoplossing sinds de houdbaarheid van waterige PEG is kort (4-5 uur).
  • Incubatietijd van fibrinogeen-PEG mengsel mag niet meer dan 25 minuten (bij 37 ° C), omdat over-incubatie kan een troebele ondoorzichtig neerslag veroorzaken tijdens gelering.
  • Na toevoeging trombine aan de gePEGyleerde fibrinogeenoplossing moet het mengsel gedoseerd met cultuur inserts onmiddellijk (na voorzichtig mengen met een pipet). Houd de oplossing mengsel in de pipet tip voor een langere tijd (> 30 sec) kan leiden tot gelering in de pipetpunt en moeilijkheden bij het verkrijgen van gelijkmatig gegoten gels.
  • Met behulp van een uniforme grootte microsferen en gelijkmatig verdeeld over de cellen CSM bed is van cruciaal belang voor een optimale cel laden. CSM grootte variatie in de diameter van een directe invloed op beschikbare oppervlakte voor celhechting per milligram van microsferen, terwijl gelijkmatig verdeeld ASC-CSM direct celmigratie invloed in thij steigers. De cel beladen microsferen (ASC-CSM) gelijkmatig verdeeld op de collageen gel nog migratie van ASC in de steiger te waarborgen. Als de verdeling van de ASC-CSM is te dicht is, zal de cel migratie krijgen geconcentreerd tot een bepaald gebied binnen de gels en kan cel-cel interactie na de migratie te beperken.
  • Dat het volume van de media toegevoegd aan de buitenzijde en de celkweek inzetstuk is dan de meniscus van de put. Gewoonlijk een binnenste: buitenste volumeverhouding van 1:2 is, want dit vergemakkelijkt cellen verbonden aan de microsferen.

Beperkingen

  • Deze methode is beperkt tot het totale oppervlak op de microsferen. Indien een groter aantal cellen gewenst, meer microsferen nodig om de oppervlakte te vergroten.
  • Omdat de cellen bestemd voor het migreren van microsferen, kan een vertraging worden waargenomen voor de eerste migratie van cel op en binnen de gels.
  • De microsferen in de interface van twee gels (collageen en PEG-fibrine), en dit kan beperken / langer duren voordat de migratie van cellen distale uiteinden van de gels.
  • Bij de constructie van de bilaag, gePEGyleerde fibrinogeen trombine mengsel snel worden toegevoegd in een CSM-ASC bed boven collageen. Dit kan leiden tot ongelijke herverdeling van de ASC-CSM. Bij ongelijke herverdeling van ASC-CSM op het grensvlak in PEG-fibrinegel gieten kan de gel construct hand langzaam geroerd om snel herverdelen microsferen vóór volledige gelering.
  • Deze methode is beperkt tot cellen die trekkende eigenschappen hebben en mag niet geschikt voor verankering-onafhankelijke celtypen leveren.
  • De collageenoplossing voor fibrillatie blijft zure pH en beperkt de directe mengsel van cellen in collageengels. Als zodanig, zo niet aangepast binnen een redelijke termijn (~ 30 min), kan levensvatbaarheid van de cellen worden aangetast.
  • Aangezien gels in dit construct afzonderlijk gelaagd, het wegvallen of scheiding van de gels kunnen optreden tijdens verwerking proces. Derhalve kan beperken gemak bij het ​​hanteren tijdens in vivo studies.

Eventuele wijzigingen

  • ASC-CSM's kunnen gelijk worden verdeeld binnen de afzonderlijke gels in plaats van lagen ze op de interface.
  • ASC kan direct gemengd worden in de afzonderlijke gels in plaats van het leveren van CSM, maar dit kan de ontwikkeling van goed georganiseerde cel-patroon weefsel constructies te beperken.
  • Om ongelijke herverdeling van de ASC-CSM tijdens de PEG-fibrine casting te voorkomen, kan het ASC-CSM's worden opgehangen in een klein volume van waterige chitosan-oplossing (1% w / v) en gelijkmatig verdeeld over collageen gels. Dit zal zorgen voor stevige bevestiging van ASC-CSM over de collageen gel laag en wordt voorkomen dat loskomen van de ASC-CSM's van het collageen oppervlak.
  • De construct kan op zichzelf worden gebruikt in een omgekeerde wijze, dat wil zeggen PEG-fibrin gels kan eerst worden gegoten en het ASC-CSM kan zaad worden op de top van de PEG-fibrine gels, gevolgd door collageen gels. Hierdoor kan de gebruiker de gefibrilleerde collageen oplossing werpen over de (ASC-CSM)-PEG-fibrine laag voorzichtiger omdat, in tegenstelling tot de PEG-fibrine gels, gefibrilleerd collageen oplossing extra tijd (30 minuten) te stollen vereist. Door de goedkeuring van dit proces kan men ervoor te zorgen dat een gelijkmatige verdeling van de ASC-CSM te behouden.
  • De gels (collageen en / of PEG-fibrine gels) kan worden opgenomen met mitogenen, zoals groeifactoren (bijvoorbeeld vasculaire endotheel groeifactor, fibroblast groeifactoren) om een ​​snellere celmigratie en proliferatie te induceren.

Problemen oplossen

  • Bij het ontvezelen van collageenoplossing, als de pH boven de isoelektrische pH> 7,2 dient de pH aangepast door het toevoegen meer collageen voorraadoplossing, verlaging van de pH met zwak zure oplossing.
  • Bij de voorbereiding van de CSM, als er een grote variatie in grootte veiligheid en gers dan een aantal parameters kan worden aangepast aan de gewenste grootte CSM (viscositeit chitosan voorraadoplossing, volume van surfactant roersnelheid, enz.) op te leveren.
  • Bij langzame celmigratie bij het vullen van de gels, kan een groter aantal ASC-CSM worden gebruikt om het aantal cellen van de CSM migreren naar gels verhogen.
  • Het proces van PEG-fibrinogeen gelering vertraagd door beperking van de hoeveelheid trombine aan het mengsel toegevoegd (gewoonlijk 900 pi in plaats van 1 mL) of aan een lagere concentratie voorraad trombine (20 U / ml in plaats van 25 U / ml) . Dit maakt tragere gelering van PEG-fibrinogeen mengsel en geeft daarmee extra tijd voor een voorzichtig gieten van gePEGyleerde-fibrinogeen en trombine mengsel over de ASC-CSM.
  • Tijdens de incubatie als een fasescheiding optreedt (tussen collageen en fibrine gel), een steriele Teflon "O" ring worden aangebracht op de bovenste construct om bevestiging van de gel fasen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen concurrerende financiële belangen bestaan.

Disclaimers

De meningen of beweringen in dit document zijn de prive-opvattingen van de auteurs en zijn niet te worden opgevat als officiële of die de opvattingen van het ministerie van Defensie of de Amerikaanse overheid. De auteurs zijn medewerkers van de Amerikaanse overheid, en dit werk werd opgesteld in het kader van hun officiële taken. Al het werk werd ondersteund door het Amerikaanse leger Medical Research en Materieel Command. Deze studie werd uitgevoerd onder een protocol beoordeeld en goedgekeurd door de US Army Medical Research en Materieel Command Institutional Review Board en in overeenstemming met het goedgekeurde protocol.

Acknowledgments

SN werd ondersteund door een Postdoctoraal Fellowship Grant van de Pittsburgh Tissue Engineering Initiative. DOZ wordt ondersteund door een subsidie ​​van The Genève Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) GIBCO, by Life Technologies 14175 Consumable
Fetal Bovine Serum Hyclone SH30071.03 Consumable
Collagenase Type II Sigma-Aldrich C6685 Consumable
70-μm Nylon Mesh Filter BD Biosciences 352350 Consumable
100-μm Nylon Mesh Filter BD Biosciences 352360 Consumable
MesenPRO Growth Medium System Invitrogen 12746-012 Consumable
L-Glutamine GIBCO, by Life Technologies 25030 Consumable
CaCl2.2H2O Sigma-Aldrich C8106 Consumable
T75 Tissue Culture Flask BD Biosciences 137787 Consumable
Chitosan Sigma-Aldrich 448869 Consumable
Acetic Acid Sigma-Aldrich 320099 Consumable
N-Octanol Acros Organics 150630025 Consumable
Sorbitan-Mono-Oleate Sigma-Aldrich S6760 Consumable
Potassium Hydroxide Sigma-Aldrich P1767 Consumable
Acetone Fisher Scientific L-4859 Consumable
Ethanol Sigma-Aldrich 270741 Consumable
Trinitro Benzenesulfonic Acid Sigma-Aldrich P2297 Consumable
Hydrochloric Acid Sigma-Aldrich 320331 Consumable
Ethyl Ether Sigma-Aldrich 472-484 Consumable
8-μm Tissue Culture Plate Inserts BD Biosciences 353097 Consumable
1.5-ml Microcentrifuge Tubes Fisher Scientific 05-408-129 Consumable
MTT Reagent Invitrogen M6494 Consumable
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich D8779 Consumable
Qtracker Cell Labeling Kit(Q Tracker 655) Molecular Probes, Life Technologies Q2502PMP Consumable
Type 1 Collagen Travigen 3447-020-01 Consumable
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich S8045 Consumable
12-Well Tissue Culture Plates BD Biosciences 353043 Consumable
Fibrinogen Sigma-Aldrich F3879 Consumable
Thrombin Sigma-Aldrich T6884 Consumable
Benztriazole Derivative of Polyethylene Sunbio DE-034GS Consumable
Tris Buffer Tablet (pH 7.6) Sigma-Aldrich T5030 Consumable
Centrifuge Eppendorf 5417R Equipment
Orbital Shaker New Brunswick Scienctific C24 Equipment
Humidified Incubator with Air-5% CO2 Thermo Fisher Scientific, Inc. Model 370 Equipment
Overhead Stirrer IKA Visc6000 Equipment
Magnetic Stirrer Corning PC-210 Equipment
Vacuum Desiccator - - Equipment
Particle Size Analyzer Malvern Instruments STP2000 Spraytec Equipment
Water Bath Fisher Scientific Isotemp210 Equipment
Spectrophotometer Beckman Coulter Inc. Beckman Coulter DU 800UV/Visible Spectrophotometer Equipment
Vortex Diagger 3030a Equipment
Microplate Reader Molecular Devices SpectraMax M2 Equipment
Light/Fluorescence Microscope Olympus Corporation IX71 Equipment
Confocal Microscope Olympus Corporation FV-500 Laser Scanning Confocal Microscope Equipment
Scanning Electron Microscope Carl Zeiss, Inc. Leo 435 VP Equipment
Transmission Electron Microscope JEOL JEOL 1230 Equipment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Natesan, S. A bilayer construct controls adipose-derived stem cell differentiation into endothelial cells and pericytes without growth factor stimulation. Tissue Eng. Part A. 17, 941-953 (2011).
  2. Nuttelman, C. R., Tripodi, M. C., Anseth, K. S. Synthetic hydrogel niches that promote hMSC viability. Matrix Biol. 24, 208-218 (2005).
  3. Benoit, D. S. Integrin-linked kinase production prevents anoikis in human mesenchymal stem cells. J Biomed Mater Res A. 81, 259-268 (2007).
  4. Willerth, S. M., Sakiyama-Elbert, S. E. Combining stem cells and biomaterial scaffolds for constructing tissues and cell delivery. (2008).
  5. Natesan, S. Adipose-derived stem cell delivery into collagen gels using chitosan microspheres. Tissue Eng. Part A. 16, 1369-1384 (2010).
  6. Bubnis, W. A., Ofner, M. C. 3rd The determination of epsilon-amino groups in soluble and poorly soluble proteinaceous materials by a spectrophotometric method using trinitrobenzenesulfonic acid. Anal. Biochem. 207, 129-133 (1992).
  7. Zhang, G. A PEGylated fibrin patch for mesenchymal stem cell delivery. Tissue Eng. 12, 9-19 (2006).
  8. Bornstein, M. B. Reconstituted rattail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes. Lab Invest. 7, 134-137 (1958).
  9. Zhang, G. Vascular differentiation of bone marrow stem cells is directed by a tunable three-dimensional matrix. Acta Biomater. 6, 3395-3403 (2010).
  10. Rochon, M. H. Normal human epithelial cells regulate the size and morphology of tissue-engineered capillaries. Tissue Eng. Part A. 16, 1457-1468 (2010).
  11. Liu, H., Collins, S. F., Suggs, L. J. Three-dimensional culture for expansion and differentiation of mouse embryonic stem cells. Biomaterials. 27, 6004-6014 (2006).
Het vervaardigen van een dubbellagige Hydrogel om ASC differentiatie Controle
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Natesan, S., Zamora, D. O., Suggs, L. J., Christy, R. J. Engineering a Bilayered Hydrogel to Control ASC Differentiation. J. Vis. Exp. (63), e3953, doi:10.3791/3953 (2012).More

Natesan, S., Zamora, D. O., Suggs, L. J., Christy, R. J. Engineering a Bilayered Hydrogel to Control ASC Differentiation. J. Vis. Exp. (63), e3953, doi:10.3791/3953 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter