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Bioengineering

Progettazione di un Hydrogel doppo strato di controllo differenziazione ASC

doi: 10.3791/3953 Published: May 25, 2012

Summary

Questo protocollo si concentra sulla utilizzando la capacità intrinseca delle cellule staminali a prendere spunto dalla loro matrice extracellulare che circonda ed essere indotte a differenziarsi in fenotipi multipli. Questo manoscritto metodi estende la nostra descrizione e caratterizzazione di un modello utilizzando un idrogel doppo strato, costituito da PEG-fibrina e collagene, contemporaneamente alla co-differenziare derivate da tessuto adiposo cellule staminali

Abstract

Polimeri naturali nel corso degli anni hanno acquisito maggiore importanza a causa della loro biocompatibilità di accoglienza e la capacità di interagire con le cellule in vitro e in vivo. Un'area di ricerca che promette nel campo della medicina rigenerativa è l'uso combinatorio di biomateriali innovativi e cellule staminali. Una strategia fondamentale nel campo dell'ingegneria dei tessuti è l'uso di tridimensionale ponteggio (ad esempio, decellularizzato matrice extracellulare, idrogel, micro / nano particelle) per dirigere la funzione delle cellule. Questa tecnologia si è evoluta dalla scoperta che le cellule hanno bisogno di un substrato su cui si può aderire, proliferare, ed esprimono il loro fenotipo differenziato cellulare e la funzione 2-3. Più recentemente, è stato anche determinato che le cellule non solo utilizzare questi substrati per adesione, ma anche interagire e prende spunto dal substrato di matrice (ad esempio, matrice extracellulare, ECM) 4. Pertanto, le cellule e ponteggi una connessione reciproca cheserve a controllare lo sviluppo dei tessuti, l'organizzazione e la funzione finale. Derivate da tessuto adiposo cellule staminali (CSA) sono mesenchimale, non-ematopoietiche cellule staminali presenti nel tessuto adiposo, che può esibire multi-lineage differenziazione e servire come fonte immediatamente disponibile di cellule (cioè pre-endoteli vascolari e periciti). La nostra ipotesi è che derivate da tessuto adiposo cellule staminali possono essere dirette verso differenti fenotipi contemporaneamente semplicemente co-coltura in matrici doppo strato 1. Il nostro laboratorio è focalizzata sulla guarigione della ferita cutanea. A questo scopo, abbiamo creato un'unica matrice composita dai biomateriali naturali, fibrina, collagene, e chitosano che possono mimare le caratteristiche e le funzioni di un dermo-specifico ambiente guarigione della ferita ECM.

Protocol

1. Isolamento derivate da tessuto adiposo cellule staminali (CSA) 1, 5

Nota: Tutte le procedure sono state eseguite a temperatura ambiente salvo diversamente indicato.

  1. Isolare adiposo perirenale e epididimale di ratto e lavare con soluzione salina sterile tamponata di Hank (HBSS) contenente 1% siero bovino fetale (FBS) 5 come precedentemente descritto. Questo studio è stato condotto nel rispetto della legge sulla protezione degli animali, l'applicazione dei regolamenti benessere degli animali e in conformità con i principi della guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio.
  2. Tritare il tessuto e trasferire 1-2 g in 25 ml di HBSS contenente 1% FBS in una provetta da 50 ml e centrifugare a 500 g per 8 minuti a temperatura ambiente.
  3. Raccogliere il fluttuante strato di tessuto adiposo e trasferimento 125-mL beuta e trattare con 25 ml di collagenasi di tipo II (200 U / mL) in HBSS per 45 min a 37 ° C in un agitatore orbitale (125 rpm). Rimuovere con cautela la frazione liquida (sotto olio e strato adiposo) da parte dell'uso lasciare equilibrare e filtrarli in modo sequenziale attraverso un 100 - filtro a maglia di nylon micron - micron e 70. Centrifugare il filtrato a 500 g per 10 min a temperatura ambiente, aspirare il surnatante, il pellet e lavate due volte con 25 ml di HBSS.
  4. Risospendere il pellet di cellule in 50 mL di mezzo di crescita (RS MesenPRO medio basale) supplementato con supplemento MesenPRO crescita RS, antibiotico-antimicotico (100 U / mL di penicillina G, 100 pg / mL di streptomicina solfato, e 0,25 ug / ml di amfotericina B), e 2 mM di L-glutammina e cellule pipetta in due palloni T75 (25 ml / beuta).
  5. La cultura il ASC in un 5% di CO 2-incubatore umidificato a 37 ° C (passaggio 2-4 ASC sono utilizzati per tutti gli esperimenti).

2. Preparazione Chitosan Microsfere (CSM)

Nota: Tutte le procedure sono state eseguite a temperatura ambiente salvo diversamente indicato.

    5. Emulsionare una soluzione acquosa di chitosano (6 mL del 3% w / v chitosano in 0,5 M di acido acetico) in 100 ml di una miscela fase olio costituito da olio di soia, n-ottanolo (1:2 v / v) e 5 % sorbitan-monooleato (Span 80) emulsionante, usando testa (1700 rpm) e agitazione magnetica (1000 rpm) simultaneamente in direzioni opposte. Questo metodo di duplice assicura la miscelazione che micelle formate presto prima reticolazione avviene può rimanere in soluzione e non a depositarsi sul fondo. Inoltre, l'agitazione magnetica bar aiuti in de-aggregazione chitosano durante la formazione delle micelle e rigidization.
  1. Agitare la miscela agitata continuamente per circa 1 ora fino uno stabile acqua-in-olio è ottenuto. Iniziare croce ionico collega con l'aggiunta di 1,5 ml di 1% w / v di idrossido di potassio in n-ottanolo ogni 15 min per 4 h (24 mL totale)
  2. Asciugare le sfere recuperate in un essiccatore a vuoto e analizzare senza ulteriore trasformazione. È possibile determinare la dimensione particellare in media CSM, area superficiale per milligrammo, e il volume unitario cubico utilizzando un analizzatore di dimensione delle particelle.
  3. Per gli esperimenti successivi, lavare le CSM tre volte con acqua sterile per eliminare i sali residui e sterilizzare lavando tutta la notte con 5 mL di etanolo assoluto.

3. Determinazioneil numero di gruppi amminici liberi in CSM

Nota: Tutte le procedure sono state eseguite a temperatura ambiente salvo diversamente indicato.

  1. Determinare il numero di gruppi amminici liberi presenti nel CSM dopo cross linking ionico utilizzando il benzensolfonico trinitro (TNBS) dosaggio di acido Bubnis e Ofner 6. Incubare 5 mg di microsfere con 1 mL di soluzione 0,5% in TNBS un 50-mL tubo di vetro per 4 ore a 40 ° C e idrolizzare con l'aggiunta di 3 ml di HCl 6N a 60 ° C per 2 h.
  2. Raffreddare i campioni a temperatura ambiente ed estrarre i TNBS libere aggiungendo 5 ml di acqua deionizzata e 10 ml di etere etilico.
  3. Riscaldare un 5-mL aliquota della fase acquosa a 40 ° C in un bagno d'acqua per 15 minuti per evaporare qualsiasi etere residuo, raffreddare a temperatura ambiente, e diluire con 15 ml di acqua.
  4. Misurare l'assorbanza a 345 nm con uno spettrofotometro con la soluzione di TNBS senza chitosano come vuoto e il chitosano utilizzato per CSM priparazione per determinare il numero totale di gruppi amminici. Stimare il numero di gruppi amminici liberi del CSM rispetto al chitosano.

4. Caricamento in ASC CSM

Nota: Tutte le procedure sono state eseguite a temperatura ambiente salvo diversamente indicato.

  1. Equilibrare 5 mg di CSM sterilizzati dalla sezione 2.5 in HBSS sterili durante la notte e aggiungere ad un 8 - micron dimensione dei pori della membrana inserto cultura piastra (24 pozzetti).
  2. Dopo aver risolto i CSM sulla membrana, aspirare accuratamente le HBSS e aggiungere 300 ml di terreno di crescita all'interno dell'inserto e 700 microlitri di terreni di crescita verso l'esterno dell'inserto.
  3. ASC Risospendere alla concentrazione adeguata (1 × 10 4 a 4 × 10 4) in 200 microlitri di terreno di crescita e di semi sopra il CSM all'interno dell'inserto piastra di coltura. Il volume finale del mezzo all'interno dell'inserto coltura, dopo la semina, è 500 pl.
  4. Incubmangiato la testa di serie ASC sul CSM per 24 ore in un 5% di CO 2 incubatore umidificato a 37 ° C.

5. Determinazione della percentuale di caricamento ASC e la vitalità cellulare in CSM

Nota: Tutte le procedure sono state eseguite a temperatura ambiente salvo diversamente indicato.

  1. Dopo l'incubazione, la pipetta ASC-caricato CSM in uno sterile 1,5 mL provetta da microcentrifuga senza disturbare le cellule che sono migrate nella membrana di inserimento.
  2. Rimuovere il mezzo residuo e aggiungere 250 microlitri di terreno di crescita fresco al tubo.
  3. Per ogni provetta, aggiungere 25 ul di MTT [3 - (4,5-dimethylthiozole-2-il) -2,5-difeniltetrazolio bromuro] soluzione (5 mg / mL) e incubare per 4 ore in una CO 2 5% umidificata incubatore a 37 ° C.
  4. Dopo l'incubazione, rimuovere il supporto, si aggiungano 250 microlitri di dimetilsolfossido e miscelare l'impasto per 2-5 min per solubilizzare il complesso formazan.
  5. Centrifugare il CSM a 2700 gper 5 min, pipetta il surnatante e determinare la sua assorbanza a lunghezza d'onda di 570 nm e 630 nm usando un lettore di piastra normale, secondo le specifiche del costruttore MTT.
  6. Determinare il numero di cellule associato con i CSM relativi ai valori ottenuti da definiti numeri ASC coltura di sviluppare una curva standard.

6. Preparazione e caratterizzazione di ASC-CSM embedded in PEG-gel di fibrina

Nota: Tutte le procedure sono state eseguite a temperatura ambiente salvo diversamente indicato.

  1. Polietilene glicole (PEG) fibrina (PEG-fibrina) idrogel preparati Suggs et al 7 sciogliendo la succinimidil polietilenglicole glutarato modificato (PEG; 3400 Da). Utilizzando 4 mL di soluzione salina tamponata Tris (TBS, pH 7,8) e filtro sterilizzare con un filtro di 0,22 micron, poco prima dell'inizio dell'esperimento. PEG disciolto è efficace solo in questa applicazione per le prime 3-4 ore.
  2. Mescolare 500 μ l di brodo fibrinogeno (40 mg / mL in TBS, pH 7,8) e 250μl di azioni PEG in una cultura e di una piastra da 6 pozzetti ed incubare per 20 minuti in un 5% di CO 2 incubatore umidificato a 37 ° C. Questa miscela costituisce un rapporto molare di concentrazione di 1:10, SG-PEG-SG: fibrinogeno.
  3. Prendete 250 microlitri della ASC-CSM ad una concentrazione di 5 mg di CSM, (≈ 2 × 10 4 celle) e mescolare con la soluzione di fibrinogeno pegilato.
  4. Immediatamente aggiungere 1 ml di trombina stock (25U/mL) e rapidamente triturare una o due volte con la pipetta. Dopo la miscelazione la trombina con il PEG-fibrinogeno, immediatamente posizionare la cellula-gel miscela a 12-pozzetti e incubate in 5% CO 2 incubatore umidificato a 37 ° C per 10 min per permettere gelificazione completa. Poiché il tempo di gelificazione è veloce, non cercare di tenere la soluzione di gel all'interno del puntale per più di 5 secondi. Il fibrinogeno è scisso PEGylated da trombina e forma un idrogel PEGylated fibrina. Come tale, thprodotto gel e finale viene chiamato PEG-fibrina.
  5. Lavare le PEG-fibrina gel due volte con HBSS e incubare con alfa terreno minimo essenziale (α-MEM) supplementato con 10% FBS in un 5% CO 2 incubatore umidificato a 37 ° C.
  6. Osservare la migrazione di cellule CSM in gel su un periodo di 11 giorni usando tecniche standard di microscopia ottica.

7. Preparazione e caratterizzazione di ASC-CSM incorporato in gel di collagene

Nota: Tutte le procedure sono state eseguite a temperatura ambiente salvo diversamente indicato.

  1. Mix ASC-CSM (5 mg contenente ≈ 2 × 10 4 cellule) con collagene di tipo 1 (7,5 mg / mL) estratto da tendini coda di ratto secondo il metodo di Bornstein 8 e fibrillano dopo aver regolato il pH a 6,8 con NaOH 2N.
  2. Aggiungere il fibrillato collagene-ASC-CSM miscela a 12 pozzetti ed incubare per 30 minuti in un 5% di CO 2 umidostatocato incubatore a 37 ° C.
  3. Dopo completa fibrillazione, incubare le collagene-ASC-CSM gel fino a 11 giorni in 5% CO 2 incubatore umidificato a 37 ° C.
  4. Osservare la migrazione di cellule CSM in gel su un periodo di 11 giorni usando tecniche di microscopia standard.

8. Sviluppo di PEG doppo strato di fibrina-(ASC-CSM)-collagene Costrutti Gel

Nota: Tutte le procedure sono state eseguite a temperatura ambiente salvo diversamente indicato.

  1. Per sviluppare il bistrato costrutto, preparare sia il collagene e PEG-fibrina gel come descritto sopra, con lievi modifiche. In breve, per studiare le proprietà migratorie e co-induzione di una singola fonte di cellule staminali utilizzando due bioscaffolds, "sandwich" la ASC-CSM tra il collagene e le PEG-fibrina impalcature utilizzando un processo in quattro fasi: 1) Carico ASC sul CSM, 2) gettato gel fibrillato strato di collagene e le ASC-CSM perline Attraverso il Collagen gel, 3) fuso PEG-fibrina gel sulla ASC-CSM-gel di collagene e consentire gel di solidificare, e 4) aggiungere medio bene e inserire studiare le cellule in vitro o rimuovere da inserto per applicazioni in vivo (vedi Figura 1 ).
  2. Preparare una 1-mL collagene di tipo 1 (7,5 mg / mL), preparato come descritto sopra in 7,1, senza aggiungere ASC-CSM alla miscela. Posizionare la miscela in un 6-ben inserto di coltura (8-um dimensione dei pori) e incubare per 30 min in un 5% CO 2 incubatore umidificato a 37 ° C.
  3. Dopo aver completato fibrillazione, strato sopra il collagene superficie 5 mg di ASC-CSM (10, 000 cellule / mg) sospeso in terreni di coltura (200 pl). Dopo le microsfere si sono insediati nel gel, preparare il PEG-gel di fibrina come descritto nella sezione 6.0, senza l'aggiunta di ASC-CSM alla miscela, e lo strato del pegilato fibrinogeno / trombina soluzione nel corso degli ASC-CSM-strati di collagene. Nel preparare il PEG-fibrina gel, utilizzare 250 pl di mezzo di coltura cellulare in luogo di tegli 250 pl di mezzo contenente le cellule.
  4. Una volta completato, i costrutti incubare per 30 min in un 5% di CO 2 incubatore umidificato per ottenere completa gelificazione prima di alimentare il costrutto con mezzo di coltura.
  5. Dopo completa gelificazione, posto 1 mL di terreno nella camera superiore sul costrutto e 3 mL di terreno nella camera inferiore.

9. Fare Solutions archivio

Nota: Tutte le procedure sono state eseguite a temperatura ambiente salvo diversamente indicato.

  • Cloruro di azioni di calcio (40 mm): Utilizzare solo CaCl 2 .2 H 2 O. Sciogliere 588,4 mg di CaCl 2 .2 H 2 O con 100 ml di acqua deionizzata. Sterilizzare utilizzando un filtro di 0,22-um.
  • Polietilenglicole: PEG è altamente reattivo con ossigeno e può essere ossidato quando esposto all'aria ambiente. Come tale, PEG deve essere conservata in azoto (N 2) atmosfera. Accurately pesare 32 mg in uno da 2 ml provetta da centrifuga (assicuratevi di eliminare i tubi con N 2 prima dell'uso) e conservare a -80 ° C fino al momento dell'uso. Sciogliere 32 mg di PEG in 4 mL di soluzione di TBS prima dell'uso.
    Le seguenti soluzioni devono essere effettuate fresco prima di ogni esperimento.
  • TBS soluzione: (pH 7,75-7,77 a 25 ° C, pH a 25 ° C è molto critico). Per preparare 15 ml di soluzione di TBS, accuratamente sciogliere una compressa tampone in sterilizzata con filtro acqua deionizzata e regolare il pH desiderato. Non conservare la soluzione stock-prepararla fresca ogni volta.
  • Fibrinogeno soluzione: (40 mg / ml). Sciogliere polvere fibrinogeno in TBS per rendere la concentrazione di fibrinogeno 40 mg / ml. Sciogliere per tutta la notte con un agitatore magnetico a 4 ° C. È facile per sciogliere l'intera quantità di 1-g con la quantità richiesta di TBS. Il giorno seguente, rimuovere il fibrinogeno da 4 ° C (di solito torbido) e consentonoper riscaldare in un bagno di acqua fino a una soluzione omogenea. Infine, filtrare sterilizzare il fibrinogeno utilizzando un filtro da 0,45 micron.
  • Trombina soluzione (25 unità / ml): Per rendere la soluzione di trombina, pesare la quantità richiesta e sciogliere con il preparato 40 mM CaCl 2 .2 H 2 O. E 'sempre una buona pratica di utilizzare la fiala intera della trombina per fare il brodo. Esempio: Sciogliere una bottiglia di 5 kU trombina con 200 mM di CaCl 2 .2 H 2 O, aliquotare e conservare a -20 ° C.

10. Risultati rappresentativi

L'obiettivo generale della tecnica qui presentata è quello di dimostrare il potenziale di matrice simultanea-driven differenziazione delle ASC nel CSM fenotipi multipli usando come veicolo di consegna. Dimostriamo una strategia in vitro per fornire cellule staminali dal CSM in un doppo strato di collagene-PEG-fibrina patibolo. Caratterizzazione di ASC integrato all'interno di questo reveale scaffoldd che ASC-caricati CSM può essere "sandwich" tra uno strato di collagene e PEG-fibrina simultaneamente e differenzialmente prendono spunto da entrambi gli ambienti extracellulari a crescere in loro nuove condizioni. Per prima cosa ha caratterizzato la possibilità per il sistema modello per mantenere la vitalità delle cellule e le capacità migratorie. Collagene sostenuto la capacità di ASCs di mantenere la loro "staminalità", come hanno dimostrato la loro espressione di Stro-1 e la loro morfologia simile fibroblasti (Figura 2D e 2F). Al contrario, PEG-fibrina indotto le ASC a differenziarsi verso un fenotipo vascolare, come è dimostrato dalla loro morfologia simile a tubo struttura, la loro cellule endoteliali-specifica espressione del fattore di von Willebrand (2E Figura e 2G), e periciti-specifica di espressione NG2 e crescita derivato dalle piastrine recettore beta fattore (PDGFRβ) (dati non mostrati). Inoltre, questi fenotipi osservati si sono verificati all'inizio di cultura e sono stati mantenuti nell'arco di 11 giorni, come è demonstrated in Figura 3.

Tabelle e figure

Vantaggi di doppio strato Construct:

  • La sola scaffold senza cellule in grado di eseguire come impalcatura bioattiva.
  • PEG-fibrina può indurre le cellule staminali per differenziare senza aggiunta di fattori di crescita.
  • Il collagene può aiutare a mantenere il fenotipo delle cellule staminali del CSA.
  • Un costrutto doppio strato può essere utilizzato come substrato attivo per altri tipi di cellule a proliferare e migrare (ad esempio, cellule endoteliali, fibroblasti, cheratinociti, cellule muscolari lisce, periciti).
  • Può essere usato con tessuto duro-scaffold ingegneria come l'osso hydroxyaptite o demineralizzata per rigenerare tessuti duri e molli.
  • Può essere utilizzato per sviluppare un multistrato, diverse ingegneria tessutale costrutto (come dermo-vascolare, vascolare-epiteliale, dermo-ipodermico-vascolari, ecc.)
  • Si utilizza una singola cella sorgente di sviluppare simultaneamentecompartimenti pluricellulari.
  • Ha il potenziale per l'integrazione con il tessuto ospite, poiché è di origine naturale.
  • CSM all'interno del costrutto gel fornisce una piattaforma per le cellule di migrare dal.
  • Il chitosano, usato per preparare CSM, è un noto attivo chemo-attrattore.
  • Il concetto generale applicato in questo protocollo di "matrix-driven differenziazione delle cellule staminali" può essere applicato ad altri tipi di cellule staminali. Tuttavia, ulteriori indagini è garantito per determinare la fattibilità della matrice-driven differenziazione. Il gel doppo strato impalcatura può agire come un serbatoio per fornire le cellule in modo continuo e controllato.
  • Dopo la ricostruzione, i gel possono comunque essere separati in singoli componenti.

Figura 1
Figura 1. Schema raffigurante l'obiettivo globale e il processo della tecnica. 1) derivate da tessuto adiposo cellule staminali (CSA) sono loaded su chitosano microsfere. 2) collagene viene quindi versata in un 6-ben inserto, il pH regolato a fibrillare il collagene, e l'inserto collocato in una camera ben 6-piastra. Le ASC-caricati sfere CSM sono poi stratificate sopra il collagene. 3) Il fibrinogeno PEGylated viene quindi versata sopra il collagene (ASC-CSM) e gelificato con l'aggiunta di trombina. 4) Il costrutto bistrato finale può quindi essere rimosso dal inserto cultura e utilizzati in vitro o in vivo di analisi.

Figura 2
Caratterizzazione Figura 2. Di ASC coltura entro collagene e PEG-fibrina matrici 3D. A) a contrasto di fase microfotografia di isolato ASC diversi passaggi e mantenuto utilizzando di routine 2-dimensionali tecniche di coltura cellulare. Microfotografie B, D, F e raffigurano ASC-CSM coltivate all'interno di un 3-dimensionale gel di collagene e che C, E, G e spettacolo ASC-CSM coltivate all'interno di un 3-dimensionale PEG-gel di fibrina, sia al giorno 12. In B e C), ASC sono mostrati migrazione lontano dalla sfera CSM in entrambi i tipi di ponteggio. ASC sembrano avere un appiattita, come morfologia-mandrino in collagene (B), pur mantenendo la loro espressione del marcatore di cellule staminali Stro-1 (D; freccia). Quando coltivate in PEG-fibrina ASC presentano più strutture tubolari e sono indotti ad esprimere tali marcatori di cellule vascolari come fattore di von Willebrand (E). Microscopia elettronica a trasmissione illustra la morfologia tipica dimostrata da ASC all'interno di ogni ponteggio. ASC in gel di collagene sembrano avere minore filopodia (fl) che si estende dal corpo della cellula (F), mentre ASC tipicamente formato luminale (etichetta L) strutture (G; freccia).

Figura 3
Figura 3. L'analisi morfologica di ASC-CSM tra i doppi strati di collagene e di PEG-gel di fibrina. ASC-CSM stati "sandwich" tra collagene e PEG-gel di fibrina e mantenute in coltura per 11 giorni. La sinistra column rappresenta ASCs migrazione e proliferazione all'interno della matrice di collagene e sembrano assumere un mandrino simile morfologia. La colonna di destra raffigura ASCs migrano lontano dai CSM e tubo formatore strutture simili in tutto il PEG-gel di fibrina.

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Discussion

ASC sono ben noti per la loro facilità di isolamento e la capacità di differenziare verso vari tipi di cellule. Con le tecniche descritte in questa manoscritto, siamo in grado di sfruttare la plasticità del ASCs esponendo le cellule a biomatrices contemporaneamente. Come le cellule migrano lontano dalla loro base CSM e inserire il proprio ambiente circostante extracellulare, le cellule prendono spunto dal patibolo e può mantenere "staminalità" (collagene) o essere indotte a differenziarsi verso tipi di cellule vascolari-and-vascolare di supporto (fibrina). Dal momento che il nostro laboratorio è interessato in pelle e dei tessuti molli guarigione delle ferite, abbiamo strategicamente implementato un doppio strato di collagene e di fibrina dal collagene favorisce la rigenerazione dermica ed epidermica da parte dell'ospite, mentre la formazione di fibrina induce naturalmente vascolare rete 9. Inoltre, è ora inteso che cross-talk verifica tra cheratinociti proliferanti pelle, fibroblasti e la rete vascolare sottostante, e questo complessomeccanismo è molto critica per la corretta guarigione della ferita 10. Senza una rete vascolare sottostante, dell'ingegneria tissutale innesti cutanei hanno difficoltà inosculating con il tessuto ospite. Pertanto, la nostra ipotesi generale è che il collagene e fibrina, quando usato come un doppio strato in combinazione con ASC, diminuisce i tempi di guarigione delle ferite, migliorando uno o più stadi di vaso sanguigno, dermica, e riepitelizzazione processi.

Fibrina è un biopolimero versatile formato dopo trombina-mediata clivaggio fibrinopeptide A derivata da fibrinogeno monomerico. Fibrina è stato utilizzato clinicamente come un agente emostatico (approvato dalla US Food and Drug Administration) e come sigillante in una varietà di applicazioni cliniche, comprese le procedure come la dissezione dei tessuti molli. Idrogel fibrina da commercialmente fibrinogeno purificato allogenico e trombina sono stati utilizzati ampiamente nell'ultimo decennio in una varietà di applicazioni di ingegneria tissutale. Tuttavia, alcuni svantaggi importanti in utilizzando un idrogel di fibrina può essere 1) il potenziale per il patibolo a ridursi, 2) bassa rigidità meccanica, e 3) rapida degradazione prima della formazione corretta dei tissutale strutture. Per superare questi problemi, fibrina deve essere modificato prima dell'uso per servire come meglio tridimensionale ingegneria tessutale scaffold. Un tale approccio è copolimerizzando la fibrina con polietilene glicole (PEG-fibrina). Il nostro lavoro preliminare ha dimostrato parecchie caratteristiche uniche di PEG-fibrina che lo rendono vantaggioso nella guarigione delle ferite più medicazioni idrogel, compresi fibrina non modificato. Pegilato-fibrina presenta caratteristiche uniche di entrambi i idrogel sintetici e materiali naturali. In particolare, la presenza di PEG fornisce altamente idratata (> 90% acqua) ambiente umido per la gestione di essudati. In secondo luogo, la presenza di fibrina biodegradabilità conferisce al materiale, tuttavia, i risultati precedenti dimostrano che PEGylated fibrina è notevolmente più stabile in vitro di fibrina unPEGylated

Il secondo componente della nostra bistrato è collagene. Il collagene è una naturale biomateriale ubiquitariamente espressa in mammiferi e serve come sito di attacco diretto per vari tipi di cellule. Diversi tessuti esprimono diversi tipi di collagene (tipo 1-type29), a seconda del tipo di esigenza funzionale del tessuto. Altre proprietà intrinseche di collagene che lo rendono estremamente attraente nel nostro modello sono che 1) è non-infiammatorio, 2) entrambi i componenti interi degradati di collagene sono biocompatibili, 3) è un idrogel altamente porosa, 4) supporta infiltrazione di cellule e la migrazione, 5) mantiene multipotenza delle cellule staminali, 6) è sintonizzabile per formulazione di modulazione, e 7) si inosculates prontamente con tessuto ospite. Per i nostri studi di rigenerazione della pelle e dei tessuti molli, un composito costituito da doppio strato di collagene è una scelta naturale dal momento cheè altamente espresso in tutta la pelle, comprese le regioni profonde dermico, e può essere utilizzata come marcatore immunoistochimica per valutare la profondità di una ferita.

In questo protocollo, abbiamo dimostrato una tecnica per mantenere simultaneamente "staminalità" di ASC differenziando ASCs verso vari tipi di cellule vascolari. Per lo studio della pelle e la sua tessuto sottostante molli, collagene e PEG-fibrina sono direttamente applicabili. Tuttavia, altri materiali bioscaffold può essere implementato per studiare le loro capacità esplorate uniche per indurre ASC in altri tipi di cellule. La tecnica implementata qui contribuisce a sottolineare l'importanza della matrice extracellulare nel controllo fenotipi di cellule staminali e avvalori l'esplorazione di strati compositi per la rigenerazione della pelle.

Riassunto

Passaggi critici

  • Il collagene deve essere regolata per il suo corretto pH isoelettrico (pH6.8-7.1) per indurre fibrillazione e ottenere una str stabile gelUTTURA.
  • PEG deve essere rinnovato prima della miscelazione con la soluzione di fibrinogeno in quanto la durata di PEG acquosa è breve (4-5 ore).
  • Il tempo di incubazione di fibrinogeno-PEG miscela non deve superare i 25 minuti (a 37 ° C) da oltre-incubazione può causare precipitazione opaco torbida durante la gelificazione.
  • Dopo aver aggiunto la trombina alla soluzione fibrinogeno pegilato, la miscela deve essere dispensato agli inserti culturali (immediatamente dopo la miscelazione delicata con una pipetta). Mantenendo la miscela soluzione la punta della pipetta per un tempo più lungo (> 30 sec) può provocare la gelificazione nella punta della pipetta e difficoltà di ottenere gel uniformemente versato.
  • Utilizzando cellule di dimensioni uniformi microsfere e distribuiti uniformemente sul letto CSM è fondamentale per la cella di carico ottimale. Variazione di dimensioni CSM di diametro influenza direttamente superficie disponibile per l'adesione delle cellule per milligrammo di microsfere, mentre uniformemente distribuito ASC-CSM influenza direttamente la migrazione delle cellule in tha ponteggi. La cellula-caricato microsfere (ASC-CSM) devono essere distribuiti uniformemente sulla superficie del gel di collagene per garantire anche la migrazione del ASC all'interno del ponteggio. Se la distribuzione di ASC-CSM è troppo densa, la migrazione delle cellule otterrà concentrata a una particolare area all'interno dei gel e possono limitare l'interazione cellula-cellula post-migrazione.
  • Assicurarsi che il volume di mezzi aggiunto al pozzetto esterna dell'inserto coltura cellulare è superiore al menisco interno del bene. Tipicamente, uno interno: esterno rapporto in volume di 1:2 è appropriato, ciò facilita le cellule fissaggio al microsfere.

Limitazioni

  • Questo metodo è limitata alla superficie totale disponibile sul microsfere. Se un numero elevato cella è desiderata, più microsfere sono necessarie per aumentare la superficie.
  • Poiché le cellule sono destinate a migrare da microsfere, un lasso di tempo può essere osservata per la migrazione iniziale di cellulare su e all'interno dei gel.
  • Le microsfere sono nell'interfaccia dei due gel (collagene e PEG-fibrina), e questo può limitare / richiedere più tempo per la migrazione di cellule di estremità distali dei gel.
  • Durante la costruzione del doppio strato, PEGylated fibrinogeno-trombina miscela deve essere aggiunto rapidamente una CSM-ASC letto sopra collagene. Ciò può causare irregolare ri-distribuzione di ASC-CSM. In caso di ri-distribuzione irregolare di ASC-CSM all'interfaccia durante PEG-fibrina gel colata, il costrutto gel può essere lentamente agitato manualmente rapidamente ridistribuire il microsfere prima gelificazione completa.
  • Questo metodo è limitato a cellule che hanno proprietà migratori e può non essere adatto per fornire tipi di cellule indipendenti ancoraggio.
  • La soluzione di collagene prima fibrillazione rimane in pH acido e limita la miscela diretta delle cellule all'interno gel di collagene. In quanto tale, se non regolato in un lasso di tempo ragionevole (~ 30 min), la vitalità cellulare può essere compromessa.
  • Poiché la gELS utilizzati in questo costrutto sono individualmente strati, un'eventuale interruzione o separazione dei gel può verificarsi durante la manipolazione processo. Quindi, si può limitare la facilità di manipolazione durante studi in vivo.

Modifiche possibili

  • ASC-CSM può essere distribuito in modo uniforme all'interno delle singole gel invece di stratificazione loro all'interfaccia.
  • ASC può essere miscelato direttamente nel gel individuali piuttosto che consegna dal CSM, ma questo potrebbe limitare lo sviluppo di cellule altamente organizzate con disegni costrutti tissutali.
  • Per evitare uniforme ridistribuzione di ASC-CSM durante PEG-fibrina colata, il ASC-CSM può essere sospesa in un piccolo volume di soluzione acquosa di chitosano (1% w / v) e distribuito uniformemente sulla gel di collagene. Ciò garantirà fermo attaccamento di ASC-CSM sopra lo strato di gel di collagene e impedirà sloggiare di ASC-CSM dalla superficie collagene.
  • Il costrutto di per sé può essere utilizzato in maniera invertita, cioè, PEG-fibrin gel può essere lanciato prima e ASC-CSM può essere seme sulla cima di PEG-fibrina gel seguita da gel di collagene. In questo modo consente all'utente di lanciare la soluzione fibrillato sopra lo strato di collagene (ASC-CSM)-PEG-fibrina con maggior cautela in quanto, a differenza di PEG-gel di fibrina, soluzione di collagene fibrillato richiede più tempo (30 minuti) a solidificare. Con l'adozione di questo processo si può assicurare di mantenere la distribuzione uniforme di ASC-CSM.
  • I gel (collagene e / o PEG-fibrina gel) può essere incorporato con mitogeni, come fattori di crescita (per esempio, fattore di crescita vascolare endoteliale, fattori di crescita dei fibroblasti), in modo da indurre la migrazione più rapida e la proliferazione cellulare.

Risoluzione dei problemi

  • Durante la fibrillazione soluzione di collagene, se il pH è superiore al pH isoelettrico della> 7,2, il pH deve essere variata aggiungendo o più soluzione stock collagene, abbassando il pH utilizzando una soluzione di acido debole.
  • Durante la preparazione del CSM, se una variazione di grandi dimensioni occurs, allora un numero di parametri possono essere regolati per ottenere dimensioni CSM desiderata (viscosità della soluzione di chitosano magazzino, il volume di tensioattivo, velocità di agitazione, ecc).
  • In caso di lenta migrazione cellulare durante la compilazione dei gel, un numero maggiore di ASC-CSM può essere utilizzato per aumentare il numero di cellule migranti dal CSM in gel.
  • Il processo di PEG-fibrinogeno gelificazione può essere ritardata da ridurre il volume della trombina aggiunta alla miscela (tipicamente 900 pl invece di 1 mL) o preparando un archivio di concentrazione inferiore di trombina (20 U / mL in luogo di 25 U / mL) . Questo permette più lento gelificazione del PEG-fibrinogeno miscela e di conseguenza dà più tempo per la colata cauto pegilato-fibrinogeno e trombina sulla miscela ASC-CSM.
  • Durante l'incubazione, se si verifica una separazione di fase (tra collagene e fibrina gel), un anello a sterile Teflon 'O' possono essere immessi sul costrutto superiore per garantire il fissaggio delle fasi gel.

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Disclosures

Nessun conflitto di interessi finanziari esistono.

Disclaimers

I pareri o le affermazioni contenute nel presente documento sono le opinioni personali degli autori e non devono essere interpretate come ufficiale o che riflette le opinioni del Dipartimento della Difesa o il Governo degli Stati Uniti. Gli autori sono dipendenti del governo degli Stati Uniti, e questo lavoro è stato preparato come parte delle loro funzioni ufficiali. Tutto il lavoro è stato sostenuto dalla US Army Medical Research e Materiel Command. Questo studio è stato condotto nell'ambito di un protocollo esaminato e approvato dalla US Army Medical Research e Materiel Command Institutional Review Board e in conformità con il protocollo approvato.

Acknowledgments

SN è stato sostenuto da una borsa post-dottorato dal Initiative Tissue Engineering Pittsburgh. DOZ è supportata da una sovvenzione concessa dalla Fondazione di Ginevra.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) GIBCO, by Life Technologies 14175 Consumable
Fetal Bovine Serum Hyclone SH30071.03 Consumable
Collagenase Type II Sigma-Aldrich C6685 Consumable
70-μm Nylon Mesh Filter BD Biosciences 352350 Consumable
100-μm Nylon Mesh Filter BD Biosciences 352360 Consumable
MesenPRO Growth Medium System Invitrogen 12746-012 Consumable
L-Glutamine GIBCO, by Life Technologies 25030 Consumable
CaCl2.2H2O Sigma-Aldrich C8106 Consumable
T75 Tissue Culture Flask BD Biosciences 137787 Consumable
Chitosan Sigma-Aldrich 448869 Consumable
Acetic Acid Sigma-Aldrich 320099 Consumable
N-Octanol Acros Organics 150630025 Consumable
Sorbitan-Mono-Oleate Sigma-Aldrich S6760 Consumable
Potassium Hydroxide Sigma-Aldrich P1767 Consumable
Acetone Fisher Scientific L-4859 Consumable
Ethanol Sigma-Aldrich 270741 Consumable
Trinitro Benzenesulfonic Acid Sigma-Aldrich P2297 Consumable
Hydrochloric Acid Sigma-Aldrich 320331 Consumable
Ethyl Ether Sigma-Aldrich 472-484 Consumable
8-μm Tissue Culture Plate Inserts BD Biosciences 353097 Consumable
1.5-ml Microcentrifuge Tubes Fisher Scientific 05-408-129 Consumable
MTT Reagent Invitrogen M6494 Consumable
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich D8779 Consumable
Qtracker Cell Labeling Kit(Q Tracker 655) Molecular Probes, Life Technologies Q2502PMP Consumable
Type 1 Collagen Travigen 3447-020-01 Consumable
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich S8045 Consumable
12-Well Tissue Culture Plates BD Biosciences 353043 Consumable
Fibrinogen Sigma-Aldrich F3879 Consumable
Thrombin Sigma-Aldrich T6884 Consumable
Benztriazole Derivative of Polyethylene Sunbio DE-034GS Consumable
Tris Buffer Tablet (pH 7.6) Sigma-Aldrich T5030 Consumable
Centrifuge Eppendorf 5417R Equipment
Orbital Shaker New Brunswick Scienctific C24 Equipment
Humidified Incubator with Air-5% CO2 Thermo Fisher Scientific, Inc. Model 370 Equipment
Overhead Stirrer IKA Visc6000 Equipment
Magnetic Stirrer Corning PC-210 Equipment
Vacuum Desiccator - - Equipment
Particle Size Analyzer Malvern Instruments STP2000 Spraytec Equipment
Water Bath Fisher Scientific Isotemp210 Equipment
Spectrophotometer Beckman Coulter Inc. Beckman Coulter DU 800UV/Visible Spectrophotometer Equipment
Vortex Diagger 3030a Equipment
Microplate Reader Molecular Devices SpectraMax M2 Equipment
Light/Fluorescence Microscope Olympus Corporation IX71 Equipment
Confocal Microscope Olympus Corporation FV-500 Laser Scanning Confocal Microscope Equipment
Scanning Electron Microscope Carl Zeiss, Inc. Leo 435 VP Equipment
Transmission Electron Microscope JEOL JEOL 1230 Equipment

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References

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Progettazione di un Hydrogel doppo strato di controllo differenziazione ASC
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Natesan, S., Zamora, D. O., Suggs, L. J., Christy, R. J. Engineering a Bilayered Hydrogel to Control ASC Differentiation. J. Vis. Exp. (63), e3953, doi:10.3791/3953 (2012).More

Natesan, S., Zamora, D. O., Suggs, L. J., Christy, R. J. Engineering a Bilayered Hydrogel to Control ASC Differentiation. J. Vis. Exp. (63), e3953, doi:10.3791/3953 (2012).

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