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Bioengineering

ASCの分化を制御するための二層ゲルをエンジニアリング

doi: 10.3791/3953 Published: May 25, 2012

Summary

このプロトコルは、その周囲の細胞外マトリックスからヒントを得るために、複数の表現型に分化するよう誘導される幹細胞の固有の能力を活用に焦点を当てています。このメソッドの原稿は、同時に脂肪由来幹細胞を共区別するために、PEG-フィブリンおよびコラーゲンから成る二層ハイドロゲルを利用したモデルでは、我々の説明とその特性を拡張する

Abstract

年間の天然高分子ため、そのホストの生体適合性、in vitro および in vivo での細胞と相互作用する能力のより重要性を得ています再生医療の約束を保持している研究分野は、新規の生体材料と幹細胞の組合せを使用することです。組織工学の分野における基本戦略は、細胞機能を指示するための三次元足場(例えば、細胞外マトリックス、ヒドロゲル、マイクロ/ナノ粒子を脱細胞)の使用です。この技術は、細胞は、彼らが付着し、増殖し、それらの分化した細胞の表現型と機能2-3を表現できる上に基板が必要であることを発見から進化してきました。最近では、それはまた、細胞が付着するため、これらの基質を使用していますが、また相互作用し、マトリクス基板(例えば、細胞外マトリクス、ECM)4から手がかりを取るだけでなく、ことが決定されている。したがって、細胞と足場は、その相互接続を使用している組織開発、組織、および究極の機能を制御するのに役立ちます。脂肪由来幹細胞(ASCS)マルチ系統分化を示し、細胞の容易に利用可能なソース(すなわち、プレ血管内皮および周皮細胞)として機能することができ、脂肪組織内に存在する間葉系、非造血幹細胞である。我々の仮説は、脂肪由来幹細胞は、二層のマトリックス1で単に共存培養することにより同時に表現型を異なる方向に向けることができるということです。私たちの研究室では、皮膚創傷治癒に焦点を当てています。この目的のために、我々は皮膚固有の創傷治癒ECM環境の特性や機能を模倣することができます自然の生体材料、フィブリン、コラーゲン、キトサンから単一の複合マトリックスを作成しました。

Protocol

1。脂肪由来幹細胞(ASCS)1、5を分離する

注:特に断りのない限り、すべての手順は室温で行った。

  1. ラット腎周囲および副睾丸脂肪を分離し、前述の5のように1%ウシ胎児血清(FBS)を含む無菌ハンクス緩衝塩溶液(HBSS)で洗浄する。本研究では、動物福祉法を遵守して実施し、実装する動物福祉の規制と実験動物のケアと使用するためのガイドの原則に従ってされています。
  2. 組織をミンチし、室温で8分間500グラムで50 mLのチューブと遠心分離機に1%FBSを含むHBSS 25 mLに1〜2グラムを転送します。
  3. 浮遊脂肪組織層と125 mLの三角フラスコへの転送を収集し、37℃で45分間HBSSでコラゲナーゼII型(200 U / mL)を25 mLで扱う°オービタルシェーカー(125 rpm)でのC。 注意深くピペッティングにより液体留分を(油と脂肪層の下)を削除し、100を介して連続してそれをフィルタ - μmと70 - μmのナイロンメッシュフィルター。室温で10分間500gで濾液を遠心し、上清を吸引除去し、HBSS 25 mLで二回ペレットを洗浄する。
  4. MesenPRO RSの成長サプリメント、抗生物質抗真菌剤(ペニシリンG 100 U / mLの硫酸ストレプトマイシン100μg/ mLとし、アムホテリシン0.25μg/ mLとを添加した増殖培地50 mLの細胞ペレット(MesenPRO RS基礎培地)に懸濁しB)、および2つのT75フラスコ(25 / mLのフラスコ)にL-グルタミンおよびピペットの細胞を2mM。
  5. 文化37℃5%CO 2、加湿インキュベーター中ASC°C(通過2月4日ASCは、すべての実験に使用されています)。

2。キトサンマイクロスフェア(のCSM)を準備

注:特に断りのない限り、すべての手順は室温で行った。

    5を使用してイオンコアセルベーション技術とともに油中水型乳化プロセスによって調製される。大豆油、n-オクタノール(1:2 v / v)で、5から成る油相混合液100 mLにキトサンの水溶液(酢酸の0.5 Mの3%(w / v)のキトサンの6 mL)を乳化%ソルビタンモノオレエート(スパン80)、乳化剤、反対方向に同時にオーバーヘッド(1700 rpm)と磁気攪拌(1000回転)を使用します。架橋が発生する前に早期に形成されるミセル溶液中に残ることができ、底に沈殿するためにないことを確実に混合し、この二重の方法。さらに、デ集約ミセル形成とrigidization中にキトサンをで磁気攪拌棒を支援します。
  1. 安定した油中水型エマルションが得られるまで連続して約1時間撹拌した混合物をかき混ぜる。 4時間(24 mLの合計)のn-オクタノール15分毎に1%(w / v)の水酸化カリウムを1.5 mLを加えて架橋イオンクロスを開始
  2. 真空デシケーターに回復球を乾燥させ、さらなる処理なしで分析します。あなたは、平均CSMの粒径、ミリグラム当たりの表面積、粒子サイズアナライザーを使用して、単位体積を決定することができます。
  3. その後の実験では、残留塩を除去し、無水エタノール5 mLで一晩洗浄することによって滅菌する滅菌水でCSM 3回洗浄します。

3。の決定のCSMでの遊離アミノ基の数

注:特に断りのない限り、すべての手順は室温で行った。

  1. トリニトロベンゼン(TNBS)BubnisとOfner 6の酸アッセイを使用してリンクイオンのクロスした後のCSMに存在する遊離アミノ基の数を決定します。 40℃で4時間、50 mLのガラス管に0.5%TNBS溶液1mLをマイクロスフェアの5mgをインキュベートし、60℃の6N HClを3mL℃で2時間Cを加えて加水分解する。
  2. 室温にサンプルを冷却し、脱イオン水5 mLとエチルエーテル10mLを加えることによって自由にTNBSを抽出します。
  3. ℃で15分間水浴中で室温まで冷却し、残留エーテルを蒸発させ、水15 mLで希釈して40に水相の5 mLのアリコートを温める。
  4. 空白とCSMのpのために使用キトサンとキトサンなく、TNBS溶液を用いた分光光度計で345 nmの吸光度を測定するアミノ基の合計数を決定するための賠償。キトサンへの相対的なCSMの遊離アミノ基の数を推定する。

4。 CSMの読み込みASC

注:特に断りのない限り、すべての手順は室温で行った。

  1. 一晩滅菌HBSSでセクション2.5から滅菌CSMの5mgを平衡化および8に追加 - μmの孔径の膜培養プレートインサート(24ウェルプレート)。
  2. CSMがメンブレン上に定住した後、慎重にHBSSを吸引し、挿入の外に増殖培地の挿入、700μLの内部に増殖培地300μLを追加します。
  3. 培養プレートのインサート内部CSM上の成長培地と種子の200μLの適切な濃度(1×10 4から4×10 4)でASCを再懸濁します。カルチャーインサート内の培地の最終量は、播種後、500μLです。
  4. Incub37℃5%CO 2の加湿インキュベーター内で24時間のCSM上でASCシード℃を食べました

5。のCSMでASCの読み込みと細胞生存率の割合を決定する

注:特に断りのない限り、すべての手順は室温で行った。

  1. インキュベーションの後、インサート膜に移行した細胞に影響を与えることなく、滅菌済み1.5 mLのマイクロ遠心チューブにピペットASCにロードされたCSMを。
  2. 残留培地を除去し、チューブに新鮮な増殖培地250μLを追加します。
  3. MTT [3 - (4,5 - dimethylthiozole -2 -イル)-2,5 -ジフェニルテトラゾリウムブロミド]の25μL加え、各チューブに溶液(5 mg / ml)を、2加湿5%COで4時間インキュベート37℃のインキュベーター
  4. インキュベーション後、培地を除去し、ジメチルスルホキシドの250μLを追加し、ホルマザンの複合体を可溶化するために2から5分間ボルテックス混合物を。
  5. 2700グラムでCSMを遠心のために5分、上清からピペットとMTTの製造元の仕様に従って、標準的なプレートリーダーを用いて570 nmと630 nmで、その波長の吸光度を決定します。
  6. 標準曲線を開発するために培養され定義されているASC番号から得られた値に対する相対のCSMに関連付けられている細胞数を決定します。

6。 PEG-フィブリンゲルに埋め込まれたASC-CSMの調製とキャラクタリゼーション

注:特に断りのない限り、すべての手順は室温で行った。

  1. ポリエチレングリコール(PEG)フィブリン(PEG-フィブリン)ハイドロゲルはSuggs により作製7スクシンイミジルグルタレート変更されたポリエチレングリコール(PEG、3400 Da)を溶解することによってトリス緩衝生理食塩水(TBS、pHは7.8)とフィルターは滅菌の4 mLを用いてただの実験を開始する前に0.22μmのフィルターである。溶解PEGは、最初の3-4時間のために、このアプリケーションでのみ有効です。
  2. ミックス500&ムー、37℃5%CO 2の加湿インキュベーター内で20分間フィブリノゲン株式のL(TBS、pHは7.8で40 mg / mL)は、6ウェルプレートとインキュベートウェル培養におけるPEG株式の250μlの℃のフィブリノゲン:この混合物は、1:10、SG-PEG-SGのモル濃度比を構成しています。
  3. CSMの5 mgの濃度でASC-CSMの250μlを取り、(≈2×10 4細胞)とPEG化フィブリノゲン溶液と混合する。
  4. 直ちにトロンビン株式の1ミリリットル(25U/mL)を追加し、迅速にピペットで一度か二度ひいて粉にする。 10分を完全にゲル化を可能にするために37℃でPEG-フィブリノーゲンとトロンビンを混合した後、すぐに12ウェルプレートに細胞-ゲル混合物を配置し、5%CO 2の加湿インキュベーター中でインキュベートした。ゲル化時間が速いので、5秒以上ピペットチップ内にゲル溶液を試してみて、保持しません。 PEG化されたフィブリノゲンがトロンビンによって切断およびPEG化フィブリンゲルを形成する。など、目E最後のゲル製品は、PEG-フィブリンと呼ばれています。
  5. HBSSで二回PEG-フィブリンゲルを洗浄し、37℃5%CO 2の加湿インキュベーター中で10%FBSを添加したα最小必須培地(α-MEM)℃でインキュベート
  6. 標準の光学顕微鏡技術を用いた11日間にわたってゲルにCSMからの細胞の遊走を観察します。

7。コラーゲンゲルに埋め込まれたASC-CSMの調製とキャラクタリゼーション

注:特に断りのない限り、すべての手順は室温で行った。

  1. 2N NaOHを用いて6.8にpHを調整した後、Bornstein 8の方法とフィブリル化に従って、ラット尾の腱から抽出された1型コラーゲン(7.5 mg / ml)と混合ASC-CSM(≈2×10 4細胞を含む5 mg)を得た。
  2. 12ウェルプレートにフィブリル化コラーゲン-ASC-CSM混合物を追加し、5%CO 2加湿で30分間インキュベート37 fiedインキュベーター℃、
  3. 完全に心房細動の後、37℃で最大5%CO 2の加湿インキュベーター内で11日間までコラーゲン-ASC-CSMゲルをインキュベート
  4. 標準的な顕微鏡技術を用いた11日間にわたってゲルにCSMからの細胞の遊走を観察します。

8。二層PEG-フィブリン(ASC-CSM)コラーゲンゲルコンストラクトの開発

注:特に断りのない限り、すべての手順は室温で行った。

  1. 二重層は、構築する開発するために、若干の修正により、上記のようにコラーゲンとPEG-フィブリンゲルの両方を準備します。簡単に言うと、4段階のプロセスを使用して、コラーゲンとPEG-フィブリンの足場の間に "サンドイッチ" ASC-CSMを2 bioscaffoldsを使用して幹細胞の単一のソースの渡り鳥との共同誘導特性を研究するには:1)ロードASC CSM、2)にCOL上のフィブリル化コラーゲンゲル層ASC-CSMビーズをキャストラゲンゲル、3)キャストPEG-フィブリンゲルASC-CSM-コラーゲンゲル上およびゲルが固化することができ、4)のウェルに培地を追加し、in vitroで細胞を勉強したり( 図1を参照してくださいin vivoアプリケーション用インサートから削除するには、挿入。)
  2. 混合物にASC-CSMを追加せずに、7.1で上記のように1 mLの1型コラーゲン(7.5 mg / mL)を混合物を準備します。 6ウェル組織培養インサート(8μmの孔径)に混合物を置き、37℃5%CO 2の加湿インキュベーター内で30分間インキュベート
  3. コラーゲン表面を完全に細動した後、層培地(200μl)を中に懸濁させASC-CSM(10、000細胞/ mg)を5 mgの。ミクロスは、ゲル上の定住した後、セクション6.0で説明したように、混合物にASC-CSMを追加し、層ASC-CSM-コラーゲン層上にPEG化されたフィブリノゲン/トロンビン解決せず、PEG-フィブリンゲルを調製する。 PEG-フィブリンゲルを準備するとき、Tの代わりに細胞培養培地250μlを使用細胞を含む培地中の彼は250μlの。
  4. 完了すると、培地の構造を供給する前に完全にゲル化を達成するために、5%CO 2の加湿インキュベーター中で30分間構造をインキュベートします。
  5. 完全にゲル化した後、場所の上部構造物上室と下室の培地3 mLの培地を1 mL。

9。原液を作る

注:特に断りのない限り、すべての手順は室温で行った。

  • 塩化カルシウムの在庫(40 mm)は:唯一のCaCl 2·2H 2 Oを使用します。脱イオン水100mlでのCaCl 2·2H 2 Oの588.4 mgを溶解する。 0.22μmのフィルターを使用して滅菌する。
  • ポリエチレングリコール:PEGは、酸素との反応性が高いと室内の空気にさらされると酸化しになることができます。このように、PEGは、窒素(N 2)雰囲気下で保存する必要があります。 ACCurately使用直前まで-80℃で2 ml遠心チューブ(使用前にN 2でチューブをパージするようにしてください)とストア°Cで32 mgの重量を量る。使用前にTBS溶液4mlにPEGの32 mgを溶解する。
    次のソリューションは、すべての実験の前に新鮮行わなければなりません。
  • TBS溶液:(25 pHが7.75から7.77℃、25℃でのpHが非常に重要です)。 TBS溶液15mlを準備するには、慎重にフィルター滅菌脱イオン水で1つのバッファータブレットを溶解し、必要なpHに調整します。それは毎回新鮮なソリューションの準備の在庫を保管しないでください。
  • フィブリノゲン溶液:(40 mg / ml)を。 40 mg / mlのフィブリノゲン濃度を作るためにTBSでフィブリノゲン粉末を溶解する。 4℃でマグネチックスターラーを使用して一晩、それを溶かす℃にそれはTBSの必要量と全体の1-Gの量を溶解しやすくなります。次の日、4°C(通常は曇り)からフィブリノゲンを除去し、それを許可する均質な溶液が得られるまでの水浴で温めています。最後に、0.45μmフィルターを使用して、フィブリノゲンを滅菌ろ過する。
  • トロンビン溶液(25単位/ ml):トロンビン溶液を作るために、必要な量を量ると、準備を40mMのCaCl 2·2H 2 Oで溶解それは常にストックを作るためにトロンビンの全体のバイアルを使用することをお勧めします。例:-20℃〜200 mMのCaCl 2の0.2 H 2 O、アリコートと店舗で5区トロンビンのボトルを溶かし

10。代表的な結果

ここで紹介するテクニックの全体的な目標は、送達ビヒクルとしてCSMを使用して複数の表現型にASCの同時マトリクス駆動型の分化の可能性を実証することである。我々は、二層コラーゲン-PEG-フィブリン足場にCSMのから幹細胞を提供するためにin vitroでの戦略を示しています。この足場reveale内に埋め込まれたASCの特性評価同時に、差動では、新しい条件の下で繁栄するには、両方の細胞外環境からキューを取るコラーゲンとPEG-フィブリンの層の間にASCにロードされたのCSM "が挟まれた"ことができるD。まず、細胞の生存と渡り鳥の能力を維持するために、モデルシステムのための能力を特徴とする。コラーゲンは、彼らの"stemness"などSTRO-1の発現とその線維芽細胞様形態( 図2Dおよび2F)によって実証されたを維持するために、ASCの機能をサポートしていました。それらのチューブ状構造の形態、von Willebrand因子( 図2Eと2G)のそれらの内皮細胞特異的発現、および周皮細胞特異的発現によって実証されるとは対照的に、PEG-フィブリンは、血管の表現型に向かって区別するためにASCを誘導しNG2および血小板由来増殖因子受容体β(PDGFRβ)(データは示さず)。さらに、これらの観​​測された表現型は、培養の初期に起こるように思われ、11日間維持されたとして、DEMです。図3にonstrated。

表と図

二重層の利点は構築:

  • 細胞を含まないだけでは足場は、生物活性足場として実行することができます。
  • PEG-フィブリンは、成長因子を添加せずに区別するために幹細胞を誘導することができる。
  • コラーゲンは、ASCの幹細胞の表現型を維持するために支援することができます。
  • 二重層構造は、他の細胞型が移行し、(例えば、内皮細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト、平滑筋細胞、周皮細胞)が増殖するためのアクティブ基板として使用することができます。
  • これは、硬組織及び軟組織を再生するためにhydroxyaptiteまたは脱骨のような硬組織工学の足場を使用することができます。
  • これは、多層、多様な組織工学コンストラクト(等、皮膚血管、血管上皮、真皮血管皮下など)を開発するために使用することができます。
  • それは同時に開発するために、単一セルのソースを使用して多コンパートメント。
  • それは自然起源のものであるため、宿主組織と統合する可能性を秘めています。
  • ゲル構造内のCSMは、細胞から移行するためのプラットフォームを提供します。
  • CSMを準備するために使用されるキトサンは、よく知られているアクティブな化学誘引です。
  • "マトリックス駆動型の幹細胞の分化"のこのプロトコルに適用される全体的なコンセプトは、他の幹細胞の種類に適用されるかもしれません。しかし、さらなる調査がマトリックス駆動型の分化の可能性を決定するために保証されています。二層ゲル足場は持続的かつ制御された方法で細胞を提供するための貯水池として機能することができます。
  • 再建後、ゲルはまだ個々の成分に分離することができます。

図1
図1。回路図は、技術の全体的な目標及びプロセスを描いた。 1)脂肪由来幹細胞(ASCS)は、LOです。キトサンマイクロスフェアにaded。 2)コラーゲンは、その後6ウェルインサートは、コラーゲンをフィブリル化するためにpH調整し、6ウェルプレートチャンバーに入れ、挿入に注がれています。 ASCにロードされたCSMの球はその後コラーゲン上に積層されています。 3)PEG化フィブリノゲンは、その後コラーゲン(ASC-CSM)に注ぎ、トロンビンの添加によってゲル化されています。 4)最後の二重層構造は、その後の培養インサートから削除され、in vitroまたは in vivo分析使用することができます。

図2
図2。ASCの特性は、コラーゲンとPEG-フィブリン3Dマトリックス内で培養した。隔離されたASCの)位相コントラスト顕微鏡写真は、継代し、ルーチンの2次元細胞培養技術を使用して維持しています。両方とも1日目C、E、および3次元PEG-フィブリンゲル内で培養しGのショーASC-CSM、一方、顕微鏡写真A、B、D、Fは3次元コラーゲンゲル内培養ASC-CSMを描く2。 BとC)では、ASCは、両方の足場タイプのCSM球からの移行を示しています。幹細胞のマーカーSTRO-1(;矢印D)のそれらの発現を維持しながら、ASCは、コラーゲンのフラット化、紡錘状の形態(B)を持っているように見えます。 PEG-フィブリンASCの中で培養したときには、よりチューブ状の構造を示し、von Willebrand因子(E)などの血管細胞マーカーを発現するように誘導されています。透過型電子顕微鏡は、それぞれの足場内のASCによって示され、典型的な形態を示しています。 (;矢印G)コラーゲンゲル内でのASCはASCのは、通常、内腔(Lラベルが付いている)構造を形成し、一方、セル(F)の本体から伸びる小さな糸状仮足(FL)を持っているように見えます。

図3
図3。コラーゲンとPEG-フィブリンゲルの二重層の間にASC-CSMの形態学的解析。 ASC-CSMはコラーゲンとPEG-フィブリンゲルの間に "挟まれた"と11日間培養で維持した。左columnは、コラーゲンマトリックス内に移行し、増殖してASCを表し、紡錘状の形態を取るように見えます。右の列には、PEG-フィブリンゲル全体のCSMと成形チューブ状の構造からの移行ASCを示しています。

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Discussion

ASCはアイソレーションと、様々な種類の細胞に向かって分化する能力の容易さのためによく知られている。この原稿に記載された技術で、我々は、同時に複数のbiomatricesにこれらの細胞を曝すことによってASCの可塑性を悪用することができます。細胞は、CSMのベースから離れての移行とその周囲の細胞外環境を入力すると、細胞は足場からキューを取得し、いずれかの "stemness"(コラーゲン)を維持したり、血管と血管支持細胞型(フィブリン)に向かって分化を誘導することができます。私たちのラボは、皮膚および軟部組織の創傷治癒に興味を持っているので、我々は戦略的にフィブリンが自然に血管網の形成9を誘導する一方、コラーゲンは、ホストによって真皮と表皮の再生をサポートしているのでコラーゲンとフィブリンの二重層を実装しました。さらに、現在のクロストークは、皮膚のケラチノサイト、線維芽細胞、および基礎となる血管網の増殖の間で発生することを理解され、そしてこのような複雑な機構は、適切な創傷治癒10の非常に重要です。基本的な血管網がなければ、組織工学皮膚移植は、ホスト組織とinosculating難しさを持っています。したがって、当社の全体的な仮説は、コラーゲンとのASCとの組み合わせで重層として使用されるフ​​ィブリンは、血管、皮膚、再上皮化のプロセスの1つ以上の段階を改善することにより、創傷治癒時間を短縮されます。

フィブリンモノマーは、フィブリノーゲンからフィブリノペプチドに由来のトロンビン媒介切断後に形成された多彩な生体高分子である。フィブリンは止血剤(米国食品医薬品局によって承認された)として、このような軟部組織の解離などの手続きを含む臨床のさまざまなアプリケーションのシーラントとして臨床的に使用されています。市販の精製された同種フィブリノーゲンとトロンビンからフィブリンハイドロゲルは、組織工学のさまざまなアプリケーションでは過去10年間で広く使用されている。しかし、いくつかの主要な欠点​​Inはフィブリンゲルを使用して組織工学構造体の適切な形成前に1)足場の可能性は縮小する、2)低機械剛性、および3)急速分解することができます。これらの問題を克服するために、フィブリンは優れた三次元組織工学の足場として機能するために使用する前に変更する必要があります。そのようなアプローチは、ポリエチレングリコール(PEG-フィブリン)とフィブリンを共重合されています。私たちの予備的な作業は、変更されていないフィブリンを含む他のハイドロゲルドレッシング、上の創傷治癒にそれが有利なように、PEG-フィブリンのいくつかのユニークな機能を実証しています。 PEG化-フィブリンは、合成ハイドロゲルと天然素材の両方のユニークな機能を発揮します。具体的には、PEGの存在は、滲出液を管理するための高度に水和(> 90%水)を湿った環境を提供しています。第二に、フィブリンの存在は、材料に生分解性を付与するが、前の結果は、PEG化フィブリンはフィブリンunPEGylatedより、in vitroではるかに安定であることを示している

私たちの二重層の第2の成分は、コラーゲンである。コラーゲンは、天然の生体遍在哺乳類で発現し、細胞の様々なタイプの添付ファイルの直接のサイトとして機能します。異なる組織は、組織の機能的必要性のタイプに応じて、コラーゲンの種類(タイプ1-type29)を表現します。他の2、1)は、非炎症性であるということです我々のモデルでは非常に魅力的なコラーゲンの固有の性質)コラーゲンの両方の全体と劣化成分が生体適合性、3)それは非常に多孔性ハイドロゲルである、4)それは細胞浸潤をサポートしていますと移行、5)それは、変調製剤による調整可能であり、7)、それは容易に宿主組織とinosculates幹細胞、6)の多能性維持しています。皮膚および軟部組織の再生に我々の研究では、コラーゲンから成る二重層複合以来、自然な選択ですそれは非常に深い真皮領域を含む、皮膚を通して表現さ​​れ、傷の深さを評価するための免疫組織化学的マーカーとして使用することができます。

このプロトコルでは、様々な血管の細胞型に向かってASCを差別化しながら同時にASCの "stemness"を維持する手法を示しています。皮膚とその基礎となる軟組織の研究では、コラーゲンとPEG-フィブリンに直接適用されます。しかし、他のbioscaffold材料は他の細胞タイプにASCを誘導するために彼らの探求のユニークな能力を研究するために実装することができます。ここで実装技術は、幹細胞の表現型を制御する細胞外マトリックスの重要性を強調するのに役立ち、皮膚再生のための層状複合体の探査に信憑性を貸す。

要約

重要なステップ

  • コラーゲンは、細動を誘発し、安定したゲルstrを取得するために、正しい電のpH(pH6.8-7.1)に調整する必要がありますucture。
  • PEGは、PEG水溶液の貯蔵寿命が短いので、(4-5時間)フィブリノゲン溶液と混合する前に新たに調製する必要があります。
  • オーバーインキュベーションがゲル中に濁った不透明な沈殿を引き起こす可能性があるのでフィブリノゲン-PEG混合物のインキュベーション時間(37℃)25分を超えてはなりません。
  • PEG化フィブリノゲン液にトロンビンを添加した後、混合物は直ちに培養インサート(ピペットを用いて穏やかに混合した後)に分配されるべきである。長い時間(> 30秒)のためのピペットチップに混合溶液を保持するピペットの先端と均等に注ぎゲルを得ることが困難である中でゲル化を引き起こす可能性があります。
  • CSMのベッドの上に均一サイズの微小球と均等に分散された細胞を使用すると、最適なセルローディングのために重要です。直径CSMの大きさの変動は直接均等に分散され、一方、ASC-CSMが直接tに細胞遊走に影響を与え、微小球のミリグラム当たりの細胞接着のために利用可能な表面積に影響を与える彼は足場。セルにロードされたミクロスフェア(ASC-CSM)は、足場内のASCのも移行を確保するためにコラーゲンゲルの上に均等に分散する必要があります。 ASC-CSMの分布が非常に密である場合には、細胞遊走は、ゲル内の特定の領域に濃縮され、細胞間相互作用移行後の制限される場合があります。
  • メディアのボリュームは、細胞培養インサートの外側のウェルに添加していることを確認するだけでなく、内側の半月板よりも高くなっています。一般的に、内側:これは、微小球に付着する細胞を容易にするように1:2の外側の体積比は、適切である。

制限事項

  • このメソッドは、ミクロスフェア上で利用可能な総表面積に制限されています。高い細胞数が必要な場合は、より多くのミクロスフェアは、表面積を大きくする必要があります。
  • 細胞はマイクロスフェアからの移行を目的としていますので、タイムラグは、上およびゲル内の細胞の初期の移行のために観察されることがあります。
  • ミクロスフェアは、2つのゲルのインターフェース(コラーゲンとPEG-フィブリン)にあり、これがゲルの先端に細胞の移動のために長い時間を制限する/かかる場合があります。
  • 二重層の構造の間に、PEG化フィブリノゲントロンビン混合物は、コラーゲンの上にCSM-ASCのベッドの上をすばやく追加する必要があります。これは、ASC-CSMの再配布ムラが発生することがあります。 PEG-フィブリンゲルキャスティング時の界面でASC-CSMの不均一な再配布の場合には、ゲル構造が徐々に完全にゲル化する前に、すぐに再配布するミクロスフェアに手動で攪拌されることがあります。
  • このメソッドは、渡り鳥の特性を有し、足場非依存性の細胞タイプを提供するのに適してすることはできません細胞に限定されています。
  • 心房細動の前にコラーゲン溶液は、酸性pHのままで、コラーゲンゲル内の細胞の直接の混合物を制限します。合理的な期間(〜30分)内で調整されていない場合などの、細胞の生存が危険にさらされる可能性があります。
  • グラムからこの構文で使用されているELSは、個別に積層され、ゲルの可能性の混乱または分離は、処理プロセス中に発生する可能性があります。したがって、それはin vivo試験時の取り扱いやすさで制限される場合があります。

可能な変更

  • ASC-CSMは個々のゲルの代わりに、階層化、それらの界面での内で均等に分散させることができます。
  • ASCはCSMが提供するのではなく、個々のゲル内で直接混合することができますが、これは高度に組織化された細胞パターン化された組織構造の開発を制限される場合があります。
  • PEG-フィブリン鋳造時のASC-CSMの不均一な再配布を避けるために、ASC-CSMをキトサン水溶液(1%w / v)の小容積に懸濁し、コラーゲンゲルに均等に分散されることがあります。これは、コラーゲンゲル層の上にASC-CSMの会社の添付ファイルを確実にし、コラーゲン表面からASC-CSMの外れを防ぎます。
  • それ自体でコンストラクトは反転方法で利用することができる、すなわち、PEG-Fibrinゲルは、最初にキャストすることができ、ASC-CSMはコラーゲンゲルに続くPEG-フィブリンゲルの上にシードすることができます。そうすることで、ユーザーはPEG-フィブリンゲルとは異なり、フィブリル化コラーゲン溶液が固化するために余分な時間(30分)を必要とし、以来、慎重に(ASC-CSM)-PEG-フィブリン層の上にフィブリル化コラーゲン溶液をキャストすることができます。このプロセスを採用することによって、一つはASC-CSMの均一な分布を維持するために確保することができます。
  • ゲル(コラーゲンおよび/またはPEG-フィブリンゲル)が速く、細胞遊走および増殖を誘導するように、成長因子などのマイトジェン(例えば、血管内皮増殖因子、線維芽細胞成長因子)を配合することができる。

トラブルシューティング

  • pHが> 7.2の等電点のpHを超えた場合、コラーゲン溶液の細動中に、pHは弱酸性溶液を用いてpHを下げ、より多くのコラーゲン原液を追加するのいずれかの方法で再調整しなければなりません。
  • CSMを準備する際に、もしサイズoccuには大きなばらつきRSは、そのパラメータの数は、所望のCSMサイズ(キトサン原液の粘度、界面活性剤の量、攪拌速度等)を得るために調整することができます。
  • ゲルを移入が遅い細胞移動の場合には、ASC-CSMの高い番号は、ゲルにCSMの外に移行する細胞の数を高めるために使用することができます。
  • PEG-フィブリノゲンのゲル化のプロセスは、混合物(典型的に900μLの代わりに、1 mL)に追加されたトロンビンの量をカットまたはトロンビンの低濃度の在庫(25 U / mLの代わりに、20 U / mL)を調製することにより遅延することができます。これは、PEG-フィブリノーゲン混合物の遅いゲル化することができ、したがって、ASC-CSMを介してPEG化-フィブリノーゲンとトロンビン混合物の慎重なキャスティングのために余分な時間を与えます。
  • 相分離が発生した場合、インキュベーション中に、(コラーゲンとフィブリンゲルの間)、滅菌テフロン 'O'リングは、ゲル相の締結を保証する上構造に配置することができます。

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Disclosures

なし競合する経済的利益は存在しません。

免責事項

ここに記載されている意見やアサーションは、作者の私的見解であり、公式、または国防省、または米国政府の部門の意見を反映して解釈されるべきではありません。著者らは、米国政府の従業員であり、この作品は、その職務の一部として作成されました。すべての作業は、米陸軍医学研究および資材コマンドでサポートされていました。本研究では、米陸軍医学研究および資材コマンド治験審査委員会によって、承認されたプロトコルに従って検討し、承認されたプロトコルの下で実施されました。

Acknowledgments

SNは、ピッツバーグ·ティッシュエンジニアリング·イニシアティブからポストドクトラルフェローシップ·グラントによってサポートされていました。 DOZは、ジュネーブ財団から授与の助成金によってサポートされています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) GIBCO, by Life Technologies 14175 Consumable
Fetal Bovine Serum Hyclone SH30071.03 Consumable
Collagenase Type II Sigma-Aldrich C6685 Consumable
70-μm Nylon Mesh Filter BD Biosciences 352350 Consumable
100-μm Nylon Mesh Filter BD Biosciences 352360 Consumable
MesenPRO Growth Medium System Invitrogen 12746-012 Consumable
L-Glutamine GIBCO, by Life Technologies 25030 Consumable
CaCl2.2H2O Sigma-Aldrich C8106 Consumable
T75 Tissue Culture Flask BD Biosciences 137787 Consumable
Chitosan Sigma-Aldrich 448869 Consumable
Acetic Acid Sigma-Aldrich 320099 Consumable
N-Octanol Acros Organics 150630025 Consumable
Sorbitan-Mono-Oleate Sigma-Aldrich S6760 Consumable
Potassium Hydroxide Sigma-Aldrich P1767 Consumable
Acetone Fisher Scientific L-4859 Consumable
Ethanol Sigma-Aldrich 270741 Consumable
Trinitro Benzenesulfonic Acid Sigma-Aldrich P2297 Consumable
Hydrochloric Acid Sigma-Aldrich 320331 Consumable
Ethyl Ether Sigma-Aldrich 472-484 Consumable
8-μm Tissue Culture Plate Inserts BD Biosciences 353097 Consumable
1.5-ml Microcentrifuge Tubes Fisher Scientific 05-408-129 Consumable
MTT Reagent Invitrogen M6494 Consumable
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich D8779 Consumable
Qtracker Cell Labeling Kit(Q Tracker 655) Molecular Probes, Life Technologies Q2502PMP Consumable
Type 1 Collagen Travigen 3447-020-01 Consumable
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich S8045 Consumable
12-Well Tissue Culture Plates BD Biosciences 353043 Consumable
Fibrinogen Sigma-Aldrich F3879 Consumable
Thrombin Sigma-Aldrich T6884 Consumable
Benztriazole Derivative of Polyethylene Sunbio DE-034GS Consumable
Tris Buffer Tablet (pH 7.6) Sigma-Aldrich T5030 Consumable
Centrifuge Eppendorf 5417R Equipment
Orbital Shaker New Brunswick Scienctific C24 Equipment
Humidified Incubator with Air-5% CO2 Thermo Fisher Scientific, Inc. Model 370 Equipment
Overhead Stirrer IKA Visc6000 Equipment
Magnetic Stirrer Corning PC-210 Equipment
Vacuum Desiccator - - Equipment
Particle Size Analyzer Malvern Instruments STP2000 Spraytec Equipment
Water Bath Fisher Scientific Isotemp210 Equipment
Spectrophotometer Beckman Coulter Inc. Beckman Coulter DU 800UV/Visible Spectrophotometer Equipment
Vortex Diagger 3030a Equipment
Microplate Reader Molecular Devices SpectraMax M2 Equipment
Light/Fluorescence Microscope Olympus Corporation IX71 Equipment
Confocal Microscope Olympus Corporation FV-500 Laser Scanning Confocal Microscope Equipment
Scanning Electron Microscope Carl Zeiss, Inc. Leo 435 VP Equipment
Transmission Electron Microscope JEOL JEOL 1230 Equipment

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References

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ASCの分化を制御するための二層ゲルをエンジニアリング
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Natesan, S., Zamora, D. O., Suggs, L. J., Christy, R. J. Engineering a Bilayered Hydrogel to Control ASC Differentiation. J. Vis. Exp. (63), e3953, doi:10.3791/3953 (2012).More

Natesan, S., Zamora, D. O., Suggs, L. J., Christy, R. J. Engineering a Bilayered Hydrogel to Control ASC Differentiation. J. Vis. Exp. (63), e3953, doi:10.3791/3953 (2012).

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